㈠ 超滤离心管怎么使用
蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号的、不同体积大小和超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用。
1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。
2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。
4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mg/ml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。
5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。
6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入MilliQ水到超滤管中，没过超滤膜，防止膜失水变干。
7、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。
8、倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将管芯浸入MilliQ水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用MilliQ水洗干净。
9、取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml
离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。
㈡ 【星耀小课堂】纯化基操篇｜大肠杆菌与内毒素的爱恨情仇——人类【纯化】花式“劝分”方法解析
内毒素的去除在生物制品纯化过程中至关重要，本文将详细介绍内毒素的结构、去除方法以及不同层析技术和切向流膜过滤法在去除样品内毒素污染中的应用策略。内毒素源于革兰氏阴性细菌的细胞壁外膜脂多糖（LPS），主要由O-特异性侧链、核心多糖和类脂A（lipid A）构成，类脂A在通常条件下带有部分负电荷，具有强疏水性和弱亲水性双相性，能结合带正电和疏水性的分子。
内毒素的结构稳定，单体质量约为10-20KDa，聚合体质量可达300-1000KDa或更大，且具有良好的热稳定性。内毒素的去除是确保生物制品安全性的关键步骤。FDA等法规对内毒素控制和降低到安全水平提出明确要求。为了有效去除内毒素，需从源头消除外源性内毒素的污染，确保与样品直接接触的设备、容器具、储液袋、原辅料、耗材等无内毒素污染。
对于样品中内源性内毒素污染，去除方法主要涉及石棉及活性炭吸附、化学降解、相分离法和超滤法等。其中，石棉及活性炭吸附法利用吸附原理去除内毒素；化学降解法则通过强酸、强碱或氧化剂等使内毒素降解；相分离法利用相似相溶的萃取原理，在低温条件下，Triton X-114溶解度高，内毒素溶解于其中；随温度升高溶解度降低，形成沉淀并去除内毒素。超滤法则基于分子量差异去除内毒素，常用300KDa超滤膜，适用于去除水中或小分子溶液中的内毒素。
层析法是内毒素去除的常用方法，包括离子交换层析、疏水层析、分子筛层析、亲和交换层析、复合模式层析等。例如，离子交换层析基于内毒素的低等电点特性，适合去除中性和碱性蛋白中的内毒素，通过调整缓冲液的电导率、pH值等参数优化纯化过程。疏水层析利用内毒素在高盐条件下聚集成复合体，以流穿形式去除，适用于对盐浓度变化不敏感的蛋白。凝胶过滤层析则利用内毒素与目标蛋白在水溶液中形成不同大小的分子聚集体的差异进行分离。复合模式层析通过层析柱骨架上复合的化学基团，实现内毒素杂质的有效去除。
切向流膜过滤法是一种有效的内毒素去除技术，基于膜孔径小于内毒素分子量的原理，实现内毒素被截留，而目标样品透过膜孔。该方法考虑目标分子的大小分布、内毒素与目标分子的相互作用、目标蛋白质浓度以及是否添加相应的洗涤剂等因素，以优化内毒素去除效率。通过将大肠杆菌表达的细菌样品稀释后，使用100 kDa膜进行过滤，内毒素去除效率范围从28.9%到99.8%。在过滤过程中，添加非离子去污剂Triton X-114和精氨酸等添加剂，有助于解离内毒素与样品分子的相互作用，进一步降低终产物内毒素含量。
总结内毒素去除策略，结合不同生物制品和工艺特点，采用复合工艺条件，如层析方法和切向流膜过滤法，以及非离子去污剂和添加剂的使用，能有效降低工艺过程中的内毒素杂质，提高产品安全性。耀海生物作为生物医药产业的CRO/CDMO/MAH服务提供商，通过多年深耕微生物表达体系CDMO服务，为国内外制药公司提供从工艺开发到商业化生产的全生命周期CDMO服务，推动客户新药项目顺利推进，为中国生物医药产业的发展持续赋能。
㈢ 超滤膜10kda是什么意思
截留率。超滤膜上标的10KD、30KD，都是指截留率单位越大，超滤得改瞎到的物质分子也越大。10kDa的超滤膜就是该超闷歼卜滤膜对10kDa的葡蚂穗聚糖截留率为90。
㈣ 超滤法提取外泌体的原理和操作要点是什么
外泌体是细胞分泌的一种微小囊泡，具有重要的生物学功能。超滤法是提取外泌体的常用方法之一，以下是其原理和操作要点：
原理
超滤法是利用超滤膜对不同大小分子进行选择性分离的技术。超滤膜具有一定的孔径范围，当含有外泌体的生物样品通过超滤膜时，小于膜孔径的物质如小分子代谢物、盐离子、缓冲液等可以自由通过膜孔，而外泌体的粒径通常在 30 - 150nm 之间，大于超滤膜的孔径，因此被截留在膜的一侧，从而实现外泌体与其他杂质的分离和浓缩。
操作要点
样品准备
确保生物样品的新鲜度，尽量减少外泌体的降解和聚集。例如，对于血液样本，应在采集后尽快离心分离血清或血浆，并避免反复冻融。
对样品进行预处理，如过滤或低速离心，以去除细胞碎片、大的蛋白质聚集体等杂质，防止它们堵塞超滤膜。
选择合适的超滤膜
根据外泌体的大小和特性，选择具有合适孔径的超滤膜。一般来说，截留分子量为 100 - 300kDa 的超滤膜较为常用，对应的孔径可有效截留外泌体。
考虑超滤膜的材质，如聚醚砜（PES）、再生纤维素等，材质应具有良好的生物相容性、化学稳定性和低蛋白吸附性，以减少对外泌体的吸附和破坏。
超滤操作
将预处理后的样品加入到超滤装置中，注意避免气泡的产生，因为气泡可能会影响超滤效果并导致外泌体损失。
选择合适的超滤方式，如搅拌式超滤或切向流超滤。搅拌式超滤适用于小体积样品，通过搅拌可以减少浓差极化现象；切向流超滤则更适合大规模样品的处理，能有效提高超滤效率和膜的使用寿命。
控制超滤的压力和流速，避免过高的压力导致外泌体变形或破裂。一般来说，操作压力应控制在 0.5 - 2 bar 之间，流速根据具体装置和样品体积进行调整。
在超滤过程中，可适时补充缓冲液或生理盐水，以维持样品的渗透压和体积，防止外泌体因浓缩过度而发生聚集。
外泌体收集和保存
超滤完成后，小心收集截留在外泌体浓缩液，避免污染。
如需长期保存，应将外泌体浓缩液分装成小份，避免反复冻融，可在 - 80℃冰箱中保存。同时，可加入适量的保护剂如甘油、BSA 等，以稳定外泌体的结构和功能。
在整个超滤法提取外泌体的过程中，要严格遵守无菌操作原则，防止微生物污染，同时注意操作的温和性，以保持外泌体的完整性和生物学活性。
㈤ 分离22KD的蛋白质选择什么型号的超滤膜
如果是分离22kDa及分子量远小于它的小蛋白，推荐用millipore的超滤管，截留分子量10kDa，体积1-15ml都有。主要还是看你的目的蛋白是集中于浓缩液部分，还是滤液部分，从而选择合适的截留分子量