侧链BOC脱除与树脂切除

① 生物化学王镜岩第三版第四章第三题标准答案

1.如果一个相对分子质量为12000的蛋白质，含10种氨基酸，并假设每种氨基酸在该蛋白质分子中的数目相等，问这种蛋白质有多少种可能的排列顺序？[10100]
解：1012000/120=10100

2、有一个A肽，经酸解分析得知为Lys、His、Asp、Glu2、Ala以及Val、Tyr和两个NH3分子组成。当A肽与FDNB试剂反应后得DNP-Asp；当用羧肽酶处理后得游离缬氨酸。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到两种肽，其中一种（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4时，净电荷为零，另一种（His、Glu以及Val）可给除DNP-His，在pH6.4时，带正电荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得到两种肽，其中一种（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4时全中性，另一种（Lys、His、Glu2以及Val）在pH6.4时带正电荷。问A肽的氨基酸序列如何？[Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val]
解：1、N-末端分析：FDNB法得：Asp-；
2、C-末端分析：羧肽酶法得：-Val；
3、胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基形成的肽键，得到的是以Arg和Lys为C-末端残基的肽断。酸水解使Asn→Asp+ NH4+，由已知条件（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）可得：Asn-(
)-( )-( )-Lys-(
)-( )-Val；
4、FDNB法分析N-末端得DNP-His，酸水解使Gln→Glu+NH4+由已知条件（His、Glu、Val）可得：Asn-( )-( )-( )-Lys-His-Gln-Val；
5、糜蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键。由题，得到的一条肽（Asp、Ala、Tyr）结合（3）、（4）可得该肽的氨基酸序列为：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val

3、某多肽的氨基酸序列如下：Glu-Val-Lys-Asn-Cys-Phe-Arg-Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu-Ala-Thr-Cys-Arg-His-Met-Asp-Gln-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu_Glu-Lys。（1）如用胰蛋白酶处理，此多肽将产生几个肽？并解释原因（假设没有二硫键存在）；（2）在pH7.5时，此多肽的净电荷是多少单位？说明理由（假设pKa值：α-COOH4.0；α- NH3+6.0；Glu和Asp侧链基4.0；Lys和Arg侧链基11.0；His侧链基7.5；Cys侧链基9.0；Tyr侧链基11.0）；（3）如何判断此多肽是否含有二硫键？假如有二硫键存在，请设计实验确定5，17和23位上的Cys哪两个参与形成？[（1）4个肽；（2）-2.5单位；（3）如果多肽中无二硫键存在，经胰蛋白酶水解后应得4个肽段；如果存在一个二硫键应得3个肽段并且个肽段所带电荷不同，因此可用离子交换层析、电泳等方法将肽段分开，鉴定出含二硫键的肽段，测定其氨基酸顺序，便可确定二硫键的位置]

4、今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸。经糜蛋白酶作用后，此肽断裂城两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。这两个肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。试问此七肽的一级结构怎样？[它是一个环肽，序列为：-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-]
解：（1）此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸，说明此肽不含游离末端NH2，即此肽为一环肽；
（2）糜蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，由已知两肽段氨基酸组成（Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg）可得：-(
)-( )-Tyr-和-( )-( )-(
)-Phe-；
（3）由（2）得的两肽段分别与FDNB反应，分别产生DNP-Ser和DNP-Lys可知该两肽段的N-末端分别为-Ser-和-Lys-，结合（2）可得：-Ser-Ala-Tyr-和-Lys-( )-( )-Phe-；
（4）胰蛋白酶专一断裂Arg或Lys残基的羧基参与形成的肽键，由题生成的两肽段氨基酸组成（Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可得：-Pro-Arg-和-( )-( )-( )-( )-Lys；
综合（2）、（3）、（4）可得此肽一级结构为：-Lys-Pro-Arg-Phe-Ser-Ala-Tyr-

5、三肽Lys- Lys- Lys的pI值必定大于它的任何一个个别基团的pKa值，这种说法是否正确？为什么？[正确，因为此三肽处于等电点时，七解离集团所处的状态是C-末端COO-（pKa=3.0），N末端NH2（pKa≌8.0），3个侧链3（1/3ε- NH3+）（pKa=10.53）,因此pI>最大的pKa值（10.53）]

6、一个多肽可还原为两个肽段，它们的序列如下：链1为Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg- Arg-
Val-Cys；链2为Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys。当用嗜热菌蛋白酶消化原多肽（具有完整的二硫键）时可用下列各肽：（1）（Ala、Cys2、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)；（4）(Cys2、Phe)。试指出在该天然多肽中二硫键的位置。（结构如下图）
S-S
Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val_Cys

S

S

Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys
S-S
解：嗜热菌蛋白酶作用专一性较差，根据题中已知条件：
（1）消化原多肽得到（Ala、Cys2、Val），说明链1在2位Cys 后及11位Val前发生断裂，2位Cys与12位Cys之间有二硫键；
（2）由链1序列可得该肽段序列为：-Phe-Pro-Lys-Arg-；
（3）由（1）（2）可知该肽段(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)中必有一Cys来自链2，另一Cys为链1中8位Cys，即链1中8位Cys与链2中的一个Cys有二硫键；
（4）嗜热菌蛋白酶能水解Tyr、Phe等疏水氨基酸残基，故此肽（Cys2、Phe）来自链2，结合（3）中含Tyr，可知（3）中形成的二硫键为链1 8位Cys与链2中3位Cys与链2中3位Cys之间；（4）中（Cys2、Phe）说明链2中1位Cys与5位Cys中有二硫键。
综合（1）、（2）、（3）、（4）可得结果。

7、一个十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列产物：
NH4+ Asp Glu Tyr Arg
Met
Pro Lys Ser
Phe
并观察下列事实：（1）用羧肽酶A和B处理该十肽无效；（2）胰蛋白酶处理产生两个四肽和游离的Lys；（3）梭菌蛋白酶处理产生一个四肽和一个六肽；（4）溴化氢处理产生一个八肽和一个二肽，用单字母符号表示其序列为NP；（5）胰凝乳蛋白酶处理产生两个三肽和一个四肽，N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH时携带-1净电荷，在pH12时携带-3净电荷；（6）一轮Edman降解给出下面的PTH衍生物：
写出该十肽的氨基酸序列。[Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro]
解：（1）用羧肽酶A和B处理十肽无效说明该十肽C-末端残基为-Pro；
（2）胰蛋白酶专一断裂Lys或Arg残基的羧基参与形成的肽键，该十肽在胰蛋白酶处理后产生了两个四肽和有利的Lys，说明十肽中含Lys-…或-Arg-…-Lys-Lys-…或-Arg-Lys-…-Lys-…Arg-Lys-…四种可能的肽段，且水解位置在4与5、5与6或4与5、8与9、9与10之间；
（3）梭菌蛋白酶专一裂解Arg残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生一个四肽和一个六肽，则可知该十肽第四位为-Arg-；
（4）溴化氰只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键，处理该十肽后产生一个八肽和一个二肽，说明该十肽第八位或第二位为-Met-；用单字母表示二肽为NP，即-Asn-Pro-，故该十肽第八位为-Met-；
（5）胰凝乳蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生两个三肽和一个四肽，说明该十肽第三位、第六位或第七位为Trp或Phe；
（6）一轮Edman降解分析N-末端，根据其反应规律，可得N-末端氨基酸残疾结构式为：-NH-CH(-CH2OH)-C(=O)-，还原为-NH-CH(-CH2OH)-COOH-，可知此为Ser；
结合（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）可知该十肽的氨基酸序列为：
Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro

8、一个四肽，经胰蛋白酶水解得两个片段，一个片段在280nm附近有强的光吸收，并且Pauly反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性。另一片段用溴化氰处理释放出一个与茚三酮反应呈黄色的氨基酸。写出此四肽的氨基酸序列。[YRMP]
解：胰蛋白酶酶专一水解Lys和Arg残基的羧基参与形成的肽键，故该四肽中含Lys或Arg；一肽段在280nm附近有强光吸收且Pauly反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性，说明该肽段含Tyr和Arg；溴化氰专一断裂Met残基的羧基参加形成的肽键，又因生成了与茚三酮反应呈黄色的氨基酸，故该肽段为-Met-Pro-；所以该四肽的氨基酸组成为Tyr-Arg-Met-Pro，即YRMP。

9、蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一个十八肽，其序列为CNCKAPETALCARRCQQH，已知蜂毒明肽形成二硫键，不与碘乙酸发生反应，（1）问此肽中存在多少个二硫键？（2）请设计确定这些（个）二硫键位置的策略。
[（1）两个；（2）二硫键的位置可能是1-3和11-15或1-11和3-15或1-15和3-11，第一种情况，用胰蛋白酶断裂将产生两个肽加Arg；第二种情况和第三种，将产生一个肽加Arg，通过二硫键部分氧化可以把后两种情况区别开来。]

10、叙述用Mernfield固相化学方法合成二肽Lys-Ala。如果你打算向Lys-Ala加入一个亮氨酸残基使成三肽，可能会掉进什么样的“陷坑”？
解：（1）用BOC保护Ala氨基端，然后将其羧基挂接在树脂上；
（2）除去N端保护，将用BOC保护的Arg用缩合剂DDC与Ala相连；
（3）将把树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通人干燥的HBr，使肽与树脂脱离，同时保护基也被切除。
若打算向Lys-Ala加入一个亮氨酸残基使成三肽，可能的坑为：Leu可能接在Arg的非α-氨基上。

② fmoc 法化学合成大约多少钱

肽涉及物体内各种细胞功能物性物质结构介于氨基酸蛋白质间类化合物,由种氨基酸按照定排列顺序通肽键结合现已发现离百种存于体肽于肽研究利用现空前繁荣景象
肽全合仅具重要理论意义且具重要应用价值通肽全合验证新肽结构；设计新肽用于研究结构与功能关系；肽物合反应机制提供重要信息；建立模型酶及合新肽药物等
肽化合技术论液相固相都已熟近几十固相合肽更其省、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广突优势肽合规并扩展核苷酸合等其机物领域本文概述固相合基本原理、实验程其现状进行析并展望今发展趋势
1．固相合基本原理
肽合重复添加氨基酸程合般C端（羧基端）向N端（氨基端）合肽合溶液进行自1963Merrifield发展功固相肽合经断改进完善今固相已肽蛋白质合用技术表现经典液相合比拟优点其基本原理：先所要合肽链羟末端氨基酸羟基共价键结构同溶性高树脂相连结合固相载体氨基酸作氨基组份经脱氨基保护基并同量化羧基组反应接肽链重复（缩合→洗涤→保护→洗涤→轮缩合）操作达所要合肽链度肽链树脂裂解经纯化等处理即所要肽其α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护称BOC固相合α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护称FMOC固相合
2． 固相合具体试验程
2．1树脂选择及氨基酸固定
固相合与其技术主要特征固相载体能用于肽合固相载体必须满足要求：必须包含反应位点（或反应基团）使肽链连些位点并除；必须合程物理化条件稳定；载体必须允许断增肽链试剂间快速、受阻碍接触；另外载体必须允许提供足够连接点使每单位体积载体给用产量肽并且必须尽量减少载体束缚肽链间相互作用用于固相合肽高载体主要三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍物些树脂导入反应基团才能直接连（第）氨基酸根据所导入反应基团同些树脂及树脂衍物氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂BOC合通选择氯甲基树脂Merrifield树脂；FMOC合通选择羧基树脂王氏树脂 氨基酸固定主要通保护氨基酸羧基同树脂反应基团间形共价键实现形共价键种：氯甲基树脂通先制保护氨基酸四甲铵盐或钠盐、钾盐、铯盐适温度直接同树脂反应或合适机溶剂二氧六环、DMF或DMSO反应；羧基树脂则通加入适缩合剂DCC或羧基二咪唑使保护氨基酸与树脂形共酯完氨基酸固定；氨基树脂或酰肼型树脂却加入适缩合剂DCC通保护氨基酸与树脂间形酰胺键完氨基酸固定
2．2氨基、羧基、侧链保护及脱除
要功合具特定氨基酸顺序肽需要暂参与形酰胺键氨基羧基加保护同氨基酸侧链性基要保护反应完再保护基除同液相合固相合采用烷氧羰基类型作α氨基保护基易发消旋早用苄氧羰基由于需要较强酸解条件才能脱除所改叔丁氧羰基（BOC）保护用TFA（三氟乙酸）脱保护适用含色氨酸等酸稳定肽类合1978chang MeienloferAtherton等采用Carpino报道Fmoc(9-芴甲氧羰基)作α氨基保护基Fmoc基酸稳定能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脱近Fmoc合广泛应用 羧基通用形酯基进行保护甲酯乙酯逐步合保护羧基用通皂化除或转变肼便用于片断组合；叔丁酯酸性条件除；苄酯用催化氢化除 于合含半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基氨基酸肽说避免由于侧链功能团所带副反应般需要用适保护基侧链基团暂保护起保护基选择既要保证侧链基团参与形酰胺反应要保证肽合程受破坏同要保证肽链裂解能除用三苯甲基保护半胱氨酸S-用酸或银盐、汞盐除；组氨酸咪唑环用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保护通催化氢化或冷三氟乙酸脱精氨酸用金刚烷氧羰基（Adoc）保护用冷三氟乙酸脱
2．3肽反应
固相接肽反应原理与液相基本致两相应氨基保护及羧基保护氨基酸放溶液内并形肽键要形酰胺键经用手段羧基化变混合酸酐、泼酯、酰氯或用强失剂（碳二亚氨）形称酸酐等形酰胺键其选用DCC、HOBT或HOBT/DCC称酸酐、化酯接肽应用广
2．4 裂解及合肽链纯化 BOC用TFA+HF裂解脱侧链保护基FMOC直接用TFA根据条件同其碱、光解、氟离氢解等脱保护采用合肽链进步精制、离与纯化通采用高效液相色谱、亲层析、毛细管电泳等
3．固相合特点及存主要问题
固相合于肽合显著优点：简化并加速步骤合；反应简单反应器皿便进行避免手工操作物料重复转移产损失；固相载体共价相联肽链处于适宜物理状态通快速抽滤、洗涤未完间纯化避免液相肽合冗重结晶或柱步骤避免间体离纯化量损失；使用量反应物迫使别反应完全便终产物高产率；增加溶剂化减少间产物聚焦；固相载体肽链轻度交联聚合链紧密相混彼产种相互溶剂效应肽自聚集热力利反应适宜 固相合主要存问题固相载体间体杂肽离造终产物纯度液相合物必需通靠离手段纯化
4．固相合研究发展前景
固相肽合已经40历史现能合些较短肽链更谈随所欲合蛋白质同合试剂毒性昂贵费用副产物等直都令痛问题物体内核糖体合肽链速度产率都惊否能物体合蛋白质原理些启发应用固相肽合（树脂）令兴趣问题许今肽合发展
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感觉问题主意不是很清晰

③ 芋螺毒素的毒素制备

制备芋螺毒素的方法主要有三种方法。第一种是自天然芋螺毒管中直接提取，此方法获取量非常少，且由于海洋生态的破坏使得野生芋螺数量急剧减少，该法会进一步加剧芋螺资源恶化，因此靠分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产并不现实，但提取到的少量天然毒液可通过一系列仪器分析手段得到单个毒素肽的氨基酸序列，再根据所得序列人工合成这些肽，可进一步用于活性测试和结构分析。第二种是基因工程方法，即将芋螺毒素的基因转化到微生物中使其表达，后期再进行分离纯化。由于部分芋螺毒素的N端为Cys，酰胺化C端，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决酰胺化C端问题，且芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象，使得分离纯化较为困难。但随着基因工程技术的日新月异，用芋螺毒素成熟肽基因，加接原核或真核生物的信号肽，或同时转入酰胺化酶基因，可望生产出大量廉价的重组芋螺毒素。 从芋螺的毒管中可提取少量天然芋螺毒素，大多从野生芋螺的死体毒管中提取。或者引诱活体芋螺刺捕猎物，用乳胶套收集喷射的毒液，可收集到几微升毒液。为了充足供应芋螺，美国研究人员在农场里尝试芋螺的养殖，只养了Conuspurpurascens一种，但还不能辨别活芋螺的性别，也未观察到芋螺的交配行为，这说明暂时无法人工繁殖芋螺。因而，靠从芋螺体内分离提取获得大量的芋螺毒素用于研究和生产是不现实的，天然来源的芋螺毒素十分有限，这制约了芋螺毒素研究的开展和应用。但获得的少量天然毒液可用高效液相色谱仪进行分离和分析，通过质谱仪和序列分析，可得到单个毒素肽的氨基酸序列。
研究中使用的芋螺毒大多数是毒液排出管抽提物。对于大多数芋螺种来说，这些抽提物勉强用于研究。但也有例外，如一种产自东太平洋猎食鱼的种类称为紫纹芋螺（C.purpurascens），其抽提物量不足以用于生化研究。可以先将紫纹芋螺饲养在水中洞穴中，用吹胀的塑料套子在金鱼身上摩擦，芋螺从沙子中跑出来，吸吮着套子，随套子浮在水面上。或Eppendorf试管，挖去盖子，放一些鱼鳍在试管中，再在鱼鳍上面放上一层薄膜，芋螺试图吸吮试管，便将毒液排入试管中。每收集3-5mL毒液需要耐心地多次用这种方法不停地累积。 芋螺毒素是基因直接表达的产物，现代基因工程技术也促进了芋螺毒素的研究与开发。在研究芋螺毒素基因的结构和生物合成过程，寻找新芋螺毒素基因，研究其分子遗传学机制，蛋白质折叠机制方面有重要的应用，且已取得了较快的进展。构建芋螺毒素cDNA文库，从中筛选新芋螺毒素基因已成为研究新芋螺毒素及其分子特征的重要途径之一。
芋螺毒素在体内先合成较大的无活性多肽前体，它们由50~80个氨基酸残基组成，含有典型的信号肽序列区和可变区，在近成熟肽区位置，有标准的蛋白质水解信号，这些信号肽序列在所有超家族成员中具有保守性。同一超家族的芋螺毒素成员具有高度保守的信号肽序列和高度保守的二硫键连接方式。如MVIIC，MVIID，SⅥA，SⅥB和SO3是根据已知ω-毒素毒素肽氨基酸保守序列，合成特定的探针，从中筛选出来的。其他国家已构建了织锦芋螺（C.textile），幻芋螺（C.magus），地纹芋螺（C.geographus），金翎芋螺（C.penaceus）等几种芋螺的cDNA文库。同时根据信号肽及3’端非翻译序列，设计芋螺毒素各个超家族基因的特异PCR引物，从cDNA和基因组DNA中克隆新型毒素基因成为可能，且是分离芋螺毒素基因的主要方法。
研究人员从3种芋螺（C. livi-s、C.abbreviatus和C.ebraeus）中测出了284个四环芋螺毒素前体蛋白基因序列，又从另外5种芋螺（C. arena-tus，C.pennaceus，C. tessulatus，C.ven-tricosus和C. textile）中获得了170个芋螺毒素的cDNA序列。他们都在GeneBank中申请了序列号。中国海南浅纹芋螺（C.striatus）和织锦芋螺（C. textile）中也分别发现了6种新O-超家族毒素的cDNA序列和2种α-CTX。地纹芋螺（C.geographus）基因组DNA则用PCR法克隆到新型α-CTX GIC。
中国海南产的大理石芋螺（Conus marmoreus Linnaeus）、幻芋螺（Conus magus Linnae-us）、信号芋螺（Conus litteratus Linnaeus）、勇士芋螺（Conus miles Linnaeus）、独特芋螺（Conus caracteristicusFischer）、织锦芋螺（Conus textileLinnaeus）、桶形芋螺（ConusbetulinusLinnaeus）、疣缟芋螺（Conus livi-sHwass）等共12个种中分别发现了具有药用功能的35种O-超家族芋螺毒素肽及其基因。根据毒素基因推测出相应的毒素氨基酸序列，通过人工合成或基因体外重组表达出这些芋螺毒素，进一步研究其活性，这些毒素即是新药开发的候选药物和先导药物。但部分ω-芋螺毒素的N端为Cys，C端酰胺化，加之原核表达系统无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决C-端酰胺化问题，且ω-芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，难于形成特定活性构象。 采用人工化学合成的方法，即通过分离天然芋螺毒素后测序或采用基因克隆方式获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素，较多使用的是多肽固相合成法。与传统的多肽液相合成法相比，该法具有如下优越性：只需经过过滤和冲洗，就可以将产物多肽从可溶性试剂中分离开来；易于使用自动化设备；过量的反应试剂促使反应彻底进行；反应产物多肽一直结合在固相载体上，损失量将达到最小。根据氨基端保护基的不同，固相合成芋螺毒素常用方法为Fmoc法和Boc法。Fmoc法具有反应条件温和、副反应少等特点，大多芋螺毒素的合成都采用该方法。合成后将肽链从树脂上裂解下来，常用的裂解剂为reagentK试剂（trifluoroaceticacid∶water∶ethanedithiol∶phenol∶thioanisole，90∶5∶2.5∶7.5∶5）。接着脱去侧链保护基、复性、纯化，即可得到与天然毒素活性相同的肽，也可以合成其同系物进行结构和功能的研究。但由于ω-芋螺毒素氨基酸残基较多，一般都在25个以上，其人工合成的产率较小，纯度也低，合成的肽还需氧化折叠才能形成正确的构象。氧化折叠的方法有空气氧化法、DMSO、DTT/cysteine、gluthatione氧化法等。
研究人员在合成ω- CNVIIA时，对这几种氧化折叠方法作了比较，发现gluthatione氧化法效果最好。随后进行纯化，即可得到具有天然毒素活性且纯度较高的多肽，最后利用NMR技术进行构象分析。因此，人工合成芋螺毒素的成本较高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。但由于芋螺毒素药物的用量小，效果好，价值高，可部分满足市场需求。 随着对芋螺毒素研究的深入和多肽合成技术的进步，芋螺毒素的合成方法也不断改进。Ale-wood小组将硒代半胱氨酸引入，合成了3个α-芋螺毒素ImI的类似物。具体操作是用硒代半胱氨酸代替了其中的1对或者2对半胱氨酸，形成二硒键替代了原有的二硫键，显著提高了芋螺毒素的氧化折叠效率，NMR和CD谱都表明类似物和天然的ImI在结构上十分相似，并且保持了原有的生物活性。可采用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸合成了μ-芋螺毒素SIIIA类似物，并且使用同位素标记了1对半胱氨酸，在提高了合成效率的同时确定了二硫键的连接。
有研究人员在利用微波合成法合成了α-芋螺毒素MII的过程中，比较了使用微波合成法和经典的固相合成法。结果表明使用微波合成的产率更高，从77%~89%提高到75%-93%。更重要的是使用微波加热缩短了每个反应周期的时间，由1-2h减少到12-15 min。如果把微波用于环状肽α-芋螺毒素IMI合成，合成效率也有所提高。此外，芋螺毒素的合成还有很多其它的策略，如μ-MrIA和α-MII采用N-C骨架环化的方法合成。还有科学家利用内酰胺、硫醚等代替二硫键，研究芋螺毒素的折叠产率。 芋螺毒素的化学合成是获得芋螺毒素的重要方法，也是进一步研究芋螺毒素活性与结构的基础。关于芋螺毒素线性肽的合成研究已较深入，合成过程中最主要的问题是二硫键如何正确连接。针对不同的芋螺毒素合成，一般是在原有研究基础上，进一步摸索适宜的保护基团和折叠方法。在线性肽的合成过程中，应优化反应试剂，减少副产物的形成，缩短反应时间，提高合成效率。
自从20世纪80年代中期合成α-芋螺毒素GI和MI以及ω-芋螺毒素GVIA以来，有数百种芋螺毒素肽都通过多肽固相合成法（solidphase peptide synthesis，简称SPPS）合成。方向是从C端到N端。每一个氨基酸连接由以下几个过程组成：首先是去保护，即保护氨基酸必须用一种碱性溶剂去除氨基的保护基团；其次是氨基酸活化，即下一个连接的氨基酸羧基被一种活化剂所活化；最后是偶联，活化的单体和游离的氨基反应，形成肽键。以上3步循环进行，直至所需的肽合成完毕。
在合成过程中，氨基酸保护基团对合成有着重要影响，特别是一些易于氧化的氨基酸，如Met，Trp等，选择适宜的保护基团可以减少副反应发生。由于芋螺毒素富含半胱氨酸，所以在合成时半胱氨酸保护基团需要慎重考虑。在固相合成中，半胱氨酸有10种以上的保护基团供选择。这些保护基团对酸碱或金属离子的稳定性不同，可以根据这一特点脱去保护基团，从而可以形成游离的巯基、硫醇盐或者直接脱去保护基团且同时形成二硫键，在这个过程中，切割液起着决定性作用。S-Trt、S-Tmob、S-Xan是芋螺毒素合成中常用的半胱氨酸保护基团，对酸不稳定，因此可与其它的保护基团一起用TFA等切割液脱去形成游离的巯基。S-Acm对酸很稳定，可用于Boc或Fmoc合成中，一般用I2或者Tl（tfa）3直接脱去并同时形成二硫键，也可以在汞盐的条件下脱去并形成游离的巯基，这时要注意His，Met，Trp或者Tyr，它们都有可能被氧化。在Boc合成中，最常用的保护基团是S-MeBzl和S-MeOBzl，它们都对TFA很稳定，但可以用HF脱去。若S-Fm用作半胱氨酸的保护基团，就能先于树脂被脱除。适宜的氨基酸保护基团可以减少合成过程中的副反应，提高合成效率。
由于天然芋螺毒素含有特定的二硫键连接方式，因此如何合成特定二硫键连接方式的多肽成为合成中最大的难题，也是限制获得大量天然芋螺毒素的关键因素。在芋螺毒素合成过程中，二硫键形成一般通过以下两种方法：第1种为游离的巯基形成二硫键；第2种为半胱氨酸脱保护直接形成二硫键；，因芋螺毒素一般含有多对二硫键，一般情况下需综合使用上述两种方法。游离的巯基形成二硫键在芋螺毒素的合成过程中，半胱氨酸的保护基团如果是S-Trt、S-Tmob、S-Xan等，经过切割后就会形成游离的巯基，这些巯基需进一步自由氧化形成二硫键。这是芋螺毒素合成最常用的策略。游离的巯基形成二硫键的方法有多种，如空气氧化法、二甲基亚砜氧化法、固相埃尔曼试剂法、铁氰化钾氧化法等。一般认为此法形成的终产物受热力学控制，反应产物为水，纯化步骤少。但由于芋螺毒素含多个半胱氨酸，自由氧化后会形成多种同分异构体。含两对二硫键可以形成3种异构体，如α、ρ、τ、χ等家族芋螺毒素。如果含有6个半胱氨酸理论上会形成15种异构体。研究者已经摸索多种方法，研究体外条件下二硫键形成的机制。结果表明芋螺毒素本身的性质和外界因素都对二硫键的连接有着一定程度的影响。如Shigeiu等研究了盐浓度和温度对ω-芋螺毒素MVIIC折叠的影响。结果显示在5℃时氧化的效果最好，天然构象的产率随着温度的上升而下降，而2.0mol·L-1（NH4）2SO4可以大大提高ω-芋螺毒素MVIIC的正确折叠效率。Cruz等研究了去污剂对疏水性δ-芋螺毒素PVIA氧化折叠的影响，结果表明加入去污剂后天然产物的比例大大提高。Miloslavina等研究了离子化溶液对芋螺毒素折叠的影响，结果表明离子化溶液可以提高亲水性和疏水性肽的氧化折叠效率。此外，前体肽和二硫键异构酶作用以及酰胺化等对芋螺毒素二硫键形成也都有一定程度的影响。半胱氨酸脱保护定点形成二硫键芋螺毒素含有多对半胱氨酸，每一对半胱氨酸可以采用不同的基团保护，合适的脱保护试剂脱去保护基团，定点形成二硫键，这是形成芋螺毒素二硫键正确连接的常用方法之一，此法可以定点形成二硫键，为构象研究提供了方便，但也需要注意Met、Trp等这些敏感的氨基酸可能会发生副反应。含有2对二硫键的α-芋螺毒素GI即采用此种方法被合成，其半胱氨酸分别用Acm和MeBzl保护，用HF/anisole脱去MeBzl保护基团，铁氰化钾氧化形成第1对二硫键，然后利用I2脱去Acm并且直接形成第2对二硫键，合成α-芋螺毒素GI时，在脱去MeBzl的同时，树脂也被切割。而Alewood等对定点合成α-芋螺毒素GI进行了进一步探索，即首先在树脂上形成二硫键，最后切去树脂，具体为先用巯基乙醇/DIEA/DMF脱去Fm保护基团形成第1对二硫键，之后再利用I2脱去Acm并且直接形成第2对二硫键，最后才使用HF脱去树脂。
另外，还有一种新的定点形成二硫键的方法，称为一罐法（One-pot method）。即两对半胱氨酸分别用t-Butyl和4-methylbenzol基团保护，在5%DMSO/TFA和25℃条件下，t-Butyl保护基团被脱除，再将温度升高到70℃脱去4-methylbenzol基团。研究人员利用两步法和一罐法均合成了α-芋螺毒素ImI，并且比较二者合成效率，结果表明一罐法合成效率更高。
O-、M-等超家族芋螺毒素比较特殊，因为含有3对二硫键，一般自由氧化和定点形成二硫键相结合来合成。如ω-芋螺毒素MVIID，此肽含有6个半胱氨酸。首先用S-Trt保护Cys1，Cys3，Cys4，Cys6，Cys2，Cys5用S-Acm保护。先用切割液脱去树脂和S-Trt保护基团，形成4个游离的巯基，空气氧化形成2对二硫键，剩下的1对保护基团采用I2脱去并形成第3对二硫键。含有3对二硫键的芋螺毒素还可以采用三步法合成，即每一步都形成1对二硫键。Durieux等利用S-Trt，S-Acm和S-MeOzl3种保护基团，分3步切割形成二硫键合成了ω-芋螺毒素MVIIA。

④ 如何脱除boc 酸酐阿

我做boc保护浓缩后产率超过1，有东西没洗掉，James-CG(站内联系TA)BOC酸酐与柠檬酸分解掉rava(站内联系TA)若Boc2O过剩，可以洗掉部分，但不会彻底，残留是一定的；Boc2O和氨基等摩尔量的话，基本上不会有多余。
柱分离可将其余其他杂质除尽。大蜜桃(站内联系TA)可以简单的，粗略的过一下柱子，boc酸酐在柱子上会被分解掉的。tqg2468(站内联系TA)柠檬酸可以洗掉TEA，不大能洗掉多少BOC酸酐。

简单的柱分离吧，BOC酸酐的极性很小的，石油醚就可以冲出来的寂如秋叶(站内联系TA)boc酸酐沸点只有57度，在溶剂存在的情况下，随便蒸蒸就没了，工业生产中用到它的时候，大部分也如此处理，这也是boc酸酐广泛应用的一个原因:)寂如秋叶(站内联系TA)另，采用柠檬酸洗是为了防止boc脱掉，因为Boc对酸敏感，用盐酸的话很容易脱掉xiaoqihu(站内联系TA)用水是不能洗掉Boc酸酐的
简单的办法，把你的产物浓缩到没有溶剂，然后加入正己烷，分液，然后再用正己烷洗几遍，即可chjw2010(站内联系TA)碱性条件下用PE/EA3:1萃取几次就可以了，然后水相酸化萃取产品就可以了huangchk(站内联系TA)N,N-二甲基乙二胺搅拌后用稀酸水洗除去

⑤ 多肽固相合成法的侧链保护

His是最容易发生消旋化的氨基酸，必须加以保护.
对咪唑环的非π-N开始用苄基(Bzl)和甲基磺酰基(TOS)保护.但这两种保护基均不太理想.TOS对亲核试剂不稳定，Bzl需要用氢解或Na/NHs除去，并且产生很大程度消旋.Boc基团是一个较理想的保护基，降低了咪唑环的碱性，抑制了消旋，成功地进行了一些合成.但是当反复地用碱处理时，也表现出一定的不稳定性.哌啶羰基在碱中稳定，但是没能很好地抑制消旋，而且脱保护时要用很强的亲核试刘如.
对咪唑环π-N保护，可以完全抑制消旋，π-N可以用苄氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保护，(Bum)可以用TFA脱除，Bom更稳定些，需用催化氢解或强酸脱保护，Bum是目前很有发展前途的His侧链保护基，其不足之处在于Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度较差. Arg的胍基具有强亲核性和碱性，必须加以保护.理想的情况是三个氮都加以保护，实际上保护1或2个胍基氮原子.保护基分四类：(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺酰基(4)三苯甲基.
硝基在制备、酰化裂解中产生很多副反应，应用不广.烷氧羰基应主要有Boc和二金刚烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦联反效率不高，哌啶理时不处稳定，会发生副反应；Adoc保护了两个非π－N，但有同样的副反应发生.对磺酰基保护，其中TOS应用最广，但它较难脱除.近年来2，3，6-三甲基-4-甲氧苯横酰基(Mtr)较受欢迎，在TFA作用下，30分钟即可脱除，但是它们都不能完全抑制侧链的酰化发生.三苯甲基保护基可用TFA脱除.缺点是反应较慢，侧链仍有酰化反应，且其在DCM、DMF中溶解度不好. 固相中的接肽反应原理与液相中基本一致.将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内，并不形成肽键.要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，其方法是将它变成混合酸酐，或者将它变为活泼酯、酰氯，或者用强的失去剂(碳二亚胺)也可形成酰胺键。
碳二亚胺是常用的活化试剂，其中Dcc使用范围最广，其缺点是形成了不溶于DCM的DCH，过滤时又难于除尽.其他一些如二异丙基碳二亚胺(DCI)、甲基叔丁基碳二亚胺也用于固相合成中，它们形成的脲溶于DCM中，经洗涤可以除去.其他活化试剂，还有Bop(Bop－C1)、氯甲酸异丙酯、氯甲酸异丁酯、SOC12等.其中Dcc、Bop活化形成对称酸酐、SOC12形成酰氯，其余三种形成不对称酸酐。 '[)V#e'{8E2c 活化酯法在固相合成中应用最为广泛.采用过的试剂也很多，近来最常用的有HOBt酯、ODhbt酯、OTDO酯等.
HOBt酯反应快，消旋少，用碳二亚胺很容易制得；ODhbt酯很稳定，容易进行分离纯化，与HOBt酯具有类似的反应性和消旋性能，它还有一个优越之处，在酰化时有亮黄色、耦联结束时颜色消失，有利于监测反应；OTDO酯与ODhbt酯类似，消旋化极低，易分离，酰化时伴有颜色从桔红色到黄色的变化等. b1Z7n+k:E5w3n2E2l7 将碳二亚胺和α－N保护氨基酸直接加到树脂中进行反应叫做原位法.。
用DIC代替Dcc效果更好.其他的活化试剂还有Bop和Bop-C1等.原位法反应快、副反应少、易操作.其中DIC最有效，其次是Bop、Bop-C1等.遗憾的是Bop酰化时生成致癌的六甲基磷酰胺，限制了其应用. Fmoc法裂解和脱侧链保护基时可采用弱酸.TFA为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；条件温和、副反应较少.不足之处：Arg侧链的Mtr很难脱除，TFA用量较大；无法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用强酸脱保护的方法：如用HF来脱除一些对弱酸稳定的保护基，如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl(苄基)保护基等，但是当脱除Asp的吸电子保护基时，会引起环化副反应.而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫醚存在时，脱保护速度很快.此外，根据条件不同，碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也有应用.
固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。

⑥ 多肽合成的介绍

多肽合成是一个来固相合成源顺序一般从C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点，从而大大的减轻了每步产品提纯的难度。多肽合成总的来说分成两种：固相合成和液相多肽合成。

⑦ 我想把BOC基团除掉，然后再接上其他的基团。请各位道友推荐一个简单有效的方法，侧链上有一个酰胺键。

加NaOH水解就可以将BOC去掉

⑧ 多肽合成仪的历史背景

多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。
1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成(SPOS)，为此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基(Z)在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基(BOC)用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124个氨基酸)。
1972年，Lou Carpino首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。 第一代多肽合成仪产生时间为上世纪六十年代末至七十年代初。
代表产品是Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer和Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer。如今该两家公司均以放弃了多肽合成仪的研发与生产，我们只能在早期的学术文献中找到其设计原理与研究情况。虽然随着生产工艺的改进和发展，第一代多肽合成仪已全部退出了市场。但1990年以前的众多肽化学文献都是在此实验设备上运行研发而来，第一代的多肽合成仪为之后的合成仪研发与制造产生了重大意义。 第二代多肽合成仪诞生在上世纪八十年代。
代表产品是Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90。标志性特点是温和反应法合成多肽，一般可分为单纯氮气鼓泡和摇动式两种。PS3 的设计原理是采用氮气鼓泡的反应方式来对反应物进行搅拌，即合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出，在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。这样设计的好处是结构简单，成本低，但反应相对温和：1）有时候多肽-固相载体在静电作用下会“抱团”，使其不能与液相充分混合，在这种情况下需要调高氮气的压力以消除静电作用；而在静电作用消除后要把压力立刻调低，不然的话较高的压力会把多肽-固相载体“吹”到反应器液面上方。由于多肽-固相载体具有较强的粘壁性，一旦被粘到反应器液面上方就再也无法下来，也就是无法再参加反应。显然第一代机器是无法自动作这样的压力调整的，这就是造成反应“死角”的重要原因。反应死角会降低多肽合成的效率和多肽的纯度，有的甚至造成合成的失败。2）长时间氮气鼓泡会使溶液挥发，液面降低后一部分多肽-固相载体就粘在液面上方，也无法再参加反应。3）氮气消耗量大，运行成本增大。ACT90的设计原理是反应器在直立下围绕原点作左右摆动，或者圆周运动。ACT的多肽合成仪同样具有反应温和的特点，即转动角度与速度都不能够完全达到氨基酸耦合的极限，反应往往需要更长的时间。 第三代多肽合成仪诞生在上世纪九十年代
代表产品是美国Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 与C S Bio公司的CS336无死角多肽合成仪。ABI433的设计原理是反应器上方相对固定，而下方作圆周360度快速旋转，带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动，一直达到反应器的最上方。换句话说，溶液可以达到反应器内部的任意点，真正做到了无死角。由于搅拌速率可达每分钟1800转的高速，反应得以充分完全。由于无死角的搅拌方式保证的肽的合成纯度，ABI433型多肽合成仪（其退出多肽合成仪市场后最后一款仪器）至今在世界上还占有着很大的比例。当然，ABI产品的售价也是最高的。由于部件使用频率高，电磁阀会经常损坏，而ABI将7个电磁阀做成模块化的设计，坏掉一个电磁阀必须要更换整个模块，无形中增加了维修成本。
CS336的设计原理是反应器中点为圆心，上下做180度旋转搅拌，搅拌速度可达180rpm，同时其采用了氮气鼓泡反应方式的优越性，将氮气吹动作为可选反应方式融入反应方法中，多肽合成仪在科研领域的高耦合率效果得到充分体现。 多肽合成仪以固相合成为反应原理，在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知顺序（序列，一般从C端-羧基端 向 N端-氨基端）不断添加、反应、合成，操作最终得到多肽载体。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成，但对于某些短肽，tBoc因其产率高的优势仍然被很多企业所采用。
具体合成由下列几个循环组成：
1） 去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去 除氨基的保护基团。
2） 激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
3） 洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA） 洗脱和脱保护。 反应器
数百年来，制药业的反应器/反应釜 设备以玻璃材质最为常见，因其完全透明且耐腐蚀，而被众多化学、生物学专家沿用。多肽合成的过程需要操作人员直观监测，同时合成后可进行在线切割（切割试剂TFA的强腐蚀性对反应器材质有了极大限制），这些要求限制反应器以玻璃材质最为适用。玻璃材质的反应器在制造工艺上有极大的难度限制：①烧制工艺：磨口精度要求极高，正如很多国产设备都无法达到要求出现漏液漏气现象，玻璃壁均匀程度等。②配合搅拌柄以及密封装置的成套加工工艺③防爆处理
氨基酸储罐
用来储存氨基酸粉末或预先活化溶解好的氨基酸溶液。小型合成仪的氨基酸储罐一般在20－40个之间以保证无人监控下的全自动缩合反应顺利进行。大型合成仪根据生产规模的不同，配置也各不相同。
溶剂储罐
用来储存多肽合成过程中需要的有机溶液，如DMF,PIP等。
量筒
用来测量氨基酸溶液与其他试剂的合成量，需有精密型传感器设计刻度并回传信息至电脑控制程序。因早期的恒压法测定偏差过大且操作繁琐，而采用此方法测定。触发器的数量根据不同客户的要求而定，不同的品牌也略有不同。
转液瓶
感应器
多端触发器自感应定量量取法，直观、科学、相对误差最低。代替早期的恒压法，避免了每日进行的大量的数学运算，操作更为简单，测定误差值可控制在1%。
废液桶
废液桶通常选择容积较大的HDPE桶，保证通风良好，同时需安装感应器装置时刻检测废液情况，避免溢出。 电磁阀
多肽合成仪中的电磁阀属于敏感配件，其控制液路的串联与闭路，在氨基酸转移与量取，溶剂转移与量取两步骤中起到至关重要的作用。不同品牌的合成仪对电磁阀的设计与排布也略有不同。
控制面板
控制面板内往往含有光敏组建，部分控制电磁阀以及感应器控制组。与电脑主机的控制系统、合成仪统一的链接在一起，完成多肽合成的全过程。
软件系统
多肽合成仪的操作软件。不同品牌合成仪所注册的软件也不同。 a) UV Monitor
在多肽合成仪中，在线检测耦合效果的装置，如UV Monitor往往是选配装置，客户可根据实验的需要选购。其功能是让操作者直观的看到多肽合成的每一部氨基酸偶联效果，从而针对特定的序列做合成设置的调整，最终达到最佳合成效果。
对于不熟悉多肽合成仪操作的用户来说，UV Monitor是相当重要的。
b) 试剂检测
没有选购在线检测附件的多肽合成仪用户，也可以采用试剂检测方法做基本的耦合效果测定实验。
固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为Kaiser方法，其检测结果，如果有游离氨基的时候，显示兰色，或红褐色（pro，ser，His）。
Kaiser试剂包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后，重蒸后再使用。检测过程，取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有兰色，或树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。

⑨ 多肽合成的基本原理是什么

多肽合成

多肽合成又叫肽链合成，是一个固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的称为液相合成法。合肥合生生物多肽的合成主要分为两条途径:化学合成多肽和生物合成多肽。

多肽合成的原理

多肽合成就是如何把各种氨基酸单位按照天然物的氨基酸排列顺序和连接方式连接起来。由于氨基酸在中性条件下是以分子内的两性离子形式(H3+NCH(R)COO-)存在，因此，氨基酸之间直接缩合形成酰胺键的反应在一般条件下是难于进行的。

氨基酸酯的反应活性较高。在100℃下加热或者室温下长时间放置都能聚合生成肽酯，但反应并没有定向性，两种氨基酸a1和a2的酯在聚合时将生成a1a2…、a1a1…、a2a1…等各种任意顺序的混合物。

为了得到具有特定顺序的合成多肽，采用任意聚合的方法是行不通的，合肥合生生物而只能采用逐步缩合的定向多肽合成方法。一般是如下式所示，即先将不需要反应的氨基或羧基用适当的基团暂时保护起来，然后再进行连接反应，以保证多肽合成的定向进行。

式中的X和Q分别为氨基和羧基的保护基，它不仅可以防止乱接副反应的发生，还具有能消除氨基酸的两性离子形式，并使之易溶于有机溶剂的作用。

Q在有的情况下也可以不是共价连接的基团，而是由有机强碱(如三乙胺)同氨基酸的羧基氢离子组成的有机阳离子。Y为一强的吸电子基团，它能使羧基活化，而有利于另一氨基酸的自由氨基，对其活化羧基的羧基碳原子进行亲核进攻生成酰胺键。

由此所得的连接产物是N端和C端都带有保护基的保护肽，要脱去保护基后才能得到自由的肽。如果肽链不是到此为止，而是还需要从N端或C端延长肽链的话，则可以先选择性地脱去X或Q，然后再同新的N保护氨基酸(或肽)或C保护的氨基酸(或肽)进行第二次连接，并依次不断重复下去，直到所需要的肽链长度为止。

对于长肽的多肽合成来说，一般有逐步增长和片段缩合两种伸长肽链的方式，前者是由起始的氨基酸(或肽)开始。每连接一次，接长一个氨基酸，后者则是用N保护肽同C保护肽缩合来得到两者长度相加的新的长肽链。

对于多肽合成中含有谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸等等带侧链功能团的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。

多肽的固相合成

多肽的合成是氨基酸重复添加的过程，通常从C端向N端(氨基端)进行合成。多肽固相合成的原理是将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸N端为合成起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽。

1、Boc多肽合成法

Boc方法是经典的多肽固相合成法，以Boc作为氨基酸α-氨基的保护基，苄醇类作为侧链保护基，Boc的脱除通常采用三氟乙酸(TFA)进行。多肽合成时将已用Boc保护好的N-α-氨基酸共价交联到树脂上，TFA切除Boc保护基，N端用弱碱中和。

肽链的延长通过二环己基碳二亚胺(DCC)活化、偶联进行，最终采用强酸氢氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMSA)将合成的目标多肽从树脂上解离。在Boc多肽合成法中，为了便于下一步的多肽合成，反复用酸进行脱保护，一些副反应被带入实验中，例如多肽容易从树脂上切除下来，氨基酸侧链在酸性条件不稳定等。

2、Fmoc多肽合成法

Carpino和Han以Boc多肽合成法为基础发展起来一种多肽固相合成的新方法——Fmoc多肽合成法。

Fmoc多肽合成法以Fmoc作为氨基酸α-氨基的保护基。其优势为在酸性条件下是稳定的，不受TFA等试剂的影响，应用温和的碱处理可脱保护，所以侧链可用易于酸脱除的Boc保护基进行保护。

肽段的最后切除可采用TFA/二氯甲烷(DCM)从树脂上定量完成，避免了采用强酸。同时，与Boc法相比，Fmoc法反应条件温和，副反应少，产率高，并且Fmoc基团本身具有特征性紫外吸收，易于监测控制反应的进行。Fmoc法在多肽固相合成领域应用越来越广泛。

多肽液相分段合成

随着多肽合成的发展，多肽液相分段合成(即多肽片段在溶液中依据其化学专一性或化学选择性，自发连接成长肽的合成方法)在多肽合成领域中的作用越来越突出。其特点在于可以用于长肽的合成，并且纯度高，易于纯化。

多肽液相分段合成主要分为天然化学连接和施陶丁格连接。天然化学连接是多肽分段合成的基础方法，局限在于所合成的多肽必须含半光氨酸(Cys)残基，因而限定了天然化学连接方法的应用范围。天然化学连接方法的延伸包括化学区域选择连接、可除去辅助基连接、光敏感辅助基连接。

施陶丁格连接方法是另一种基础的片段连接方法，其为多肽片段连接途径开拓了更广阔的思路。正交化学连接方法是施陶丁格连接方法的延伸，通过简化膦硫酯辅助基来提高片段间的缩合率。

其他多肽合成方法

1、氨基酸的羧内酸酐法(NCA)

氨基酸的羧内酸酐的氨基保护基也可活化羧基。

NCA的原理:在碱性条件下，氨基酸阴离子与NCA形成一个更稳定的氨基甲酸酯类离子，在酸化时该离子失去二氧化碳，生成二肽。生成的二肽又与其他的NCA结合，反复进行。

NCA适用于短链肽片段的多肽合成，其周期短、操作简单、成本低、得到产物分子量高，在目前多肽合成中所占比例较大，技术也较为通用。

2、组合化学法

20世纪80年代，以固相多肽合成为基础提出了组合化学法，即氨基酸的构建单元通过组合的方式进行连接，合成出含有大量化合物的化学库，并从中筛选出具有某种理化性质或药理活性化合物的一套多肽合成策略和筛选方案。

组合化学法的多肽合成策略主要包括:混合-均分法、迭代法、光控定位组合库法、茶叶袋法等。组合化学法的最大优点在于可同时合成多种化合物，并且能最大限度地筛选各种新化合物及其异构体。

3、酶解法

酶解法是用生物酶降解植物蛋白质和动物蛋白质，获得小分子多肽。酶解法因其多肽产量低、投资大、周期长、污染严重，未能实现工业化生产。酶解法获得的多肽能够保留蛋白质原有的营养价值，并且可以获得比原蛋白质更多的功能，更加绿色，更加健康。

4、基因工程法

基因工程法主要以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。有研究者通过基因工程法获得了准弹性蛋白-聚缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-缬氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。

利用基因工程技术生产的活性多肽还有肽类抗生素、干扰素类、白介素类、生长因子类、肿瘤坏死因子、人生长激素，血液中凝血因子、促红细胞生成素，组织非蛋白纤溶酶原等。

基因工程法合成多肽具有表达定向性强，安全卫生，原料来源广泛和成本低等优点，但因存在高效表达，不易分离，产率低的问题，难以实现规模化生产。

5、发酵法

发酵法是从微生物代谢产物中获得多肽的方法。虽然发酵法的成本低，但其应用范围较窄，因为现在微生物能够独立合成的聚氨基酸只有ε-聚赖氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和蓝细菌肽。

合肥合生生物主要提供：多肽合成、定制多肽、同位素标记肽、人工胰岛素、磷酸肽、生物素标记肽、荧光标记肽（Cy3、Cy5、Fitc、AMC等）、目录肽、偶联蛋白（KLH、BSA、OVA等）、化妆品肽、多肽文库构建、抗体服务、糖肽、订书肽、药物肽、RGD环肽等。请移步网络搜“合肥合生生物”即可

⑩ 哪位高手能帮我简述固相肽合成技术

ziyirenjiajia 你好！
多肽合成技术
多肽药物的研究与开发将作为二十一世纪高新技术竟争的主要项目之一。生物活性多肽在内源性物质中占有非常重要的地位，除酶、受体、金属蛋白等生物大分子外，许多合成或分离的多肽对生理过程或病理过程，对疾病的发生、发展或治疗过程有重要意义。

氨基酸彼此以酰胺键（也称肽键）相互连接的化合物称作肽。一种肽含有的氨基酸少于10个就称作寡肽，超过的就称为多肽。多肽与蛋白质只有肽链长短之别，二者间并没有严格的区分。蛋白质是生命存在的最基本形式。可见多肽是生命之"桥"，蛋白质工程从某种意义上而言就是研究多肽。

伴随着分子生学物、生物化学技术的飞速发展，多肽研究取得了惊人的、划时代的飞跃。人们发现存在于生物体的多肽有数万种，并且发现所有的细胞均能合成多肽。同时，几乎所有的细胞也都受多肽调节，它涉及激素、神经、细胞生长与生殖等各个领域，21世纪是一个多肽的世界，人们研究多肽，也渴望着将多肽应用到医疗、保健、检测等多个领域中去，为人类造福。

事实上，肽类药物开发与应用已走出科学家们的实验室，变成了现实，并发挥着其独特的功效。例如，神经紧张肽（NT）能降低血压，对肠和子宫具有收缩作用；内啡肽和脑啡肽的衍生物有着很强的镇痛作用；促甲状腺素释放激素（TRH）是一种能促进产妇乳汁分泌的多肽；能治疗糖尿病、胃溃疡、胰腺炎的多肽是一种环状的14肽；临床上常用的催产素是一种多肽；已获广泛应用的白蛋白多肽、胸腺肽、血清胸腺因子（FTS）等均可以引起免疫T细胞的分化；近日来在中国及日本已开始使用的糖肽辅助治疗肿瘤，其作用机理是使淋巴系统活化等等。应用多肽技术开发的医用蛋白质芯片（肽芯片）只有指甲盖大小，放置了与肾炎、胃溃疡和胃癌等相关的抗原分子，只要通过芯片阅读仪便可检测到有关疾病的功能状态与变异情况。其功能已相当于一个大型或中型实验室、化验室，效率是传统医学检测的成百上千倍，受检者几乎没有任何痛苦。肽芯片的广泛应用，已在医学临床检测业引发一场技术革命。

自从1963年MERRIFIELD发展成功了固相多肽合成（SPPS）方法以来，经过不断的改进和完善，到今天这个方法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。

固相合成的主要设计思想是：先将所要合成肽链的未端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上。氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基，并同过量的活化羟基组分反应接长肽链。重复（缩合—洗涤—去保护—中和和洗涤—下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度；最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。

http://www.pharmco.com.cn/technical-3.htm

多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。它是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，出现了一个空前的繁荣景象。
多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。
多肽的化学合成技术无论是液相法还是固相法都已成熟。近几十年来，固相法合成多肽更以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽合成的常规方法并扩展到核苷酸合成等其它有机物领域。本文概述了固相合成的基本原理、实验过程，对其现状进行分析并展望了今后的发展趋势。
1．固相合成的基本原理
多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的，但自从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复（缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保护的称为FMOC固相合成法，
2． 固相合成的具体试验过程
2．1树脂的选择及氨基酸的固定
将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸。根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如Merrifield树脂；FMOC合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂。 氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾盐、铯盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF或DMSO中反应；羧基树脂，则通常加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰肼型树脂，却是加入适当的缩合剂如DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。
2．2氨基、羧基、侧链的保护及脱除
要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反应完成后再将保护基因除去。同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰基类型作为α氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。最早是用苄氧羰基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。1978年，chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脱去，近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。 羧基通常用形成酯基的方法进行保护。甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；苄酯常用催化氢化除去。 对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应，又要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。如用三苯甲基保护半胱氨酸的S-，用酸或银盐、汞盐除去；组氨酸的咪唑环用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保护，可通过催化氢化或冷的三氟乙酸脱去。精氨酸用金刚烷氧羰基（Adoc）保护，用冷的三氟乙酸脱去。
2．3成肽反应
固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的失去剂（如碳二亚氨）形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。其中选用DCC、HOBT或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。
2．4 裂解及合成肽链的纯化 BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，FMOC法直接用TFA，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。
3．固相合成的特点及存在的主要问题
固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。 固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。
4．固相合成的研究发展前景
固相多肽合成已经有40年的历史了，然而到现在，人们还只能合成一些较短的肽链，更谈不上随心所欲地合成蛋白质了，同时合成中的试剂毒性，昂贵费用，副产物等一直都是令人头痛的问题，而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的，那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在固相多肽合成（树脂）上，这是一个令人感兴趣的问题，也许是今后多肽合成的发展。
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