離子交換Q內毒素

1. 什麼是內毒素如何解決

你好，我是葯物專業的，細菌內毒素經常出現在葯品中，這種內毒素就會成為葯品熱源來源，使人應用後產生發熱反映
消除的辦法很多，比如高溫，酸鹼法，凝膠過濾，離子交換等，由於其濾過性，基本不能採用過濾法。
檢查的方法目前應用最多就是家兔法
順便補充一下，內毒素是細菌體內的脂多糖

2. 為何在pH4.0的緩沖液中，內毒素還是會被CM陽離子交換介質所吸附呢

與CM陽離子交換介質吸附性無關，一般pH4.0的緩沖液具有很強的抑製作用，導致樣品陽性對照不成立。

3. deae陰離子交換柱去除內毒素需要在一定的緩沖體系中嗎

DEAE是陰離子交換柱，一般適合於等電點比較低的酸性蛋白。
另外DEAE在結合內毒素上有很好的效果，所以在很多蛋白去除內毒素時可以用到DEAE。

4. 請教-去離子水與內毒素

關於這個問題，我來想說一句：
去離子自水
（不管是
二級反滲透
還是
離子交換柱
）的生產中是不控制
細菌內毒素
這個指標的。但這並不代表細菌內毒素不合格，可通過檢測來知道能否合格（風險太大）。個人認為可通過增加超濾或使用
注射用水
來解決。

5. 什麼是變性內毒素它是怎麼產生的

㊣覓渡
中舉內毒素由脂多糖和蛋白質復合而成,主要存在於革蘭陰性菌中,有致熱、致休克等多種生物活性.血液中內毒素達一定濃度即形成內毒素血症,其可引起一系列病理生理改變包括膿毒症、休克、彌漫性血管內凝血、多器官功能障礙綜合征等.內毒素主要通過刺激單核細胞和巨噬細胞,使其產生白細胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN)等細胞因子而致病[1].脂多糖(LPS)是目前所知誘導IL-1和TNF最重要的因素[1].隨著人們對內毒素血症認識的不斷加深,抗內毒素葯物的研究也取得了重要進展細菌內毒素經常出現在葯品中，這種內毒素就會成為葯品熱源來源，使人應用後產生發熱反映消除的辦法很多，比如高溫，酸鹼法，凝膠過濾，離子交換等，由於其濾過性，基本不能採用過濾法。檢查的方法目前應用最多就是家兔法順便補充一下，內毒素是細菌體內的脂多糖細菌內毒素，英文稱作Endotoxin，是G-菌細胞壁個層上的特有結構，內毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細胞等，使之釋放出一種內源性熱原質，作用於體溫調節中樞引起發熱。內毒素的主要化學成分為脂多糖中的類脂A
細菌內毒素這個概念在1890年的時候就已被提了出來，它是在研究發熱物質過程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠傷寒桿菌提取出來，進行化學免疫學方面的研究，到1940年時候，Morgan使用志賀氏痢疾菌闡明了細菌內毒素是由多糖脂質及蛋白質三部分所組成的復合體，到了1950年以後，隨著生物學，物理化學，免疫學以及遺傳學等的進步發展，細菌內毒素的研究工作，尤其是其化學結構組成及各種生物活性間的關系也更加明確起來。
細菌英文叫Bacteria：為原核生物中的一類單細胞微生物由二分裂法繁殖。若按革蘭氏染色法可將細菌分為G+菌和G-菌兩大類。這兩類細菌細胞壁的結構和化學組成存在很大差異。唯有肽聚糖為其共同成分，但其含量的多少和肽鏈的性質有所不同，見下表：
細胞壁結構 革藍氏陽性菌 革藍氏陰性菌
厚度 厚，15—50 薄，10—15
肽聚糖含量 多，占胞壁乾重50—80% 少，占胞壁乾重10%左右
脂類含量 少，約1—4% 多，約11—22%
磷壁酸 有 無
外膜 無 有
脂蛋白 無 有
脂多糖 無 有
細胞壁較薄，厚約10－15nm，結構也較復雜。肽聚糖含量低，僅占細胞干生10％左右，層薄又較疏鬆，因肽聚糖之間僅四肽側鏈直接聯結，缺乏五肽橋；肽聚糖居於細胞最內層，外面由內向外還有脂蛋白，外膜和脂多糖的三層聚合物。
（1）脂蛋白（lipoprotein） 由類脂和蛋白質構成，聯結在外膜與肽聚糖層之間，類脂一端經非共價鍵聯結到外膜的磷脂上，另一端由共價鍵聯結到肽聚糖肽鏈中的二氧基庚二酸 殘基上，使外膜和肽聚糖層構成一個整體。
（2）外膜（outer membrane） 是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要結構，位於肽聚糖的外側，其結構類似細胞膜，為液態的磷脂雙層，其中鑲嵌一些特異蛋白質，穿透外膜的內外雙層，呈液態鑲嵌體。外膜中間有微小孔道，容許水溶性的小分子通過，以進行細胞內外的物質運輸和交換。除此之外，外膜還能防止胰蛋白酶和溶菌酶等進入，起到保護性屏障作用。（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS） 由多糖O抗原、核心多糖和類脂A(lipid A)組成（圖1-8），位於最外層。多糖O抗原向外，由若干個低聚糖的重復單位組成的多糖鏈，即革蘭氏陰性菌的菌體抗原（O抗原），有特異性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脫氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等組成，所有革蘭氏陰性細菌都有此結構。類脂A是以脂化的葡萄胺二糖為單位，通過焦磷酸酯鍵組成的一種獨特的糖脂化合物，具有致熱作用，是革蘭氏陰性細菌內毒素的毒性成分。
細菌內毒素即：許多病原性細菌所產生的毒素。
一般細菌毒素可分為兩類，一類為外毒素（Exotoxin）；它是一種毒性蛋白質，是細菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質。產生外毒素的細菌主要是革蘭氏陽性菌。如白喉桿菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數革蘭氏陰性菌。另一類為內毒素（Endotoxin）。是革蘭氏陰性菌的細胞壁外壁層上的特有結構。細菌在生活狀態時不釋放出來，只有當細菌死亡自溶或粘附在其它細胞時，才表現其毒性，內毒素的主要化學成分是脂多糖中的類脂A成分。

6. 如何製作氣凝膠

如何製作氣凝膠
氣凝膠又稱凍膠。溶膠或溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下互相連接，形成空間網狀結構，結構空隙中充滿了作為分散介質的液體（在干凝膠中也可以是氣體），這樣一種特殊的分散體系稱作凝膠。沒有流動性。內部常含有大量液體。例如血凝膠、瓊脂的含水量都可達99%以上。可分為彈性凝膠和脆性凝膠。彈性凝膠失去分散介質後，體積顯著縮小，而當重新吸收分散介質時，體積又重新膨脹，例如明膠等。脆性凝膠失去或重新吸收分散介質時，形狀和體積都不改變，例如硅膠等。由溶液或溶膠形成凝膠的過程稱為膠凝作用（gelation）。
[編輯本段]生物學和凝膠
生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理和化學特性，然後通過實驗選擇出最有效的純化流程。
1.測定——分子量、PI
當目標蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時，可用PAGE電泳方法或層析方法加以測定。分離范圍廣闊的Superose HR預裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質在多個含不同PH緩沖液的試管中，可簡易地測出PI，並選擇純化用緩沖液的最佳PH.
2.選擇——層析方法
若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：
一] 使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質如Superose、Sephacryl HR依據分子量將 樣品分成不同組份。
二] 用含專一配體或抗體的親和層析介質結合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯介質偶聯目標蛋白的底物、受體等自製親和介質，再用以結合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品。
三] 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用於純化流程中。
3.純化——大量粗品
處理大量原液時，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質。擴張柱床吸附技術利用多種STREAMLINE介質，直接從含破碎細胞或組織萃取物的發酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結合為一。提高回收率，縮短純化周期。
4.純化——硫酸氨樣品硫酸氨沉澱方法常被用來初步凈化樣品，經處理過的樣本處於高鹽狀態下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術，隨著介質種類不斷增多，漸被融入各生產工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質中選擇最適合介質及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。
5.純水——糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細胞膜組份、細胞、甚至亞細胞細胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質，專為俘獲整個細胞或大復合物，如膜囊等。
6.純化——膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應選用與目標蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質，籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。
7.純化——單抗、抗原 *單抗多為IgG.來源主要是腹水和融合瘤培養上清液。腹水有大量白蛋白、轉鐵蛋白和宿主抗體等。Mabselect、Protein G和Protein A對IgG的Fc區有專一性親和作用，能一步純化各種不同源的IgG.血清互補劑如小牛血清可先用蛋白G預處理，在培養前除去IgG.重組蛋白A介質 Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性，基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。
*疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG.宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。
*純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯介質如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯IgG，再進一步獲取IgG抗原。
*HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養的單抗IgM，結合量達5mg IgM.HiTrap IgY是專門用來純化IgY，結合量達100mg純IgY.
8.純化——重組蛋白 重組蛋白在設計、構建時應已融入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產物，擴張柱床吸附技術STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個快速表達、一步純化的融合系統。
一] GST融合載體使要表達的蛋白和谷胱甘肽S轉移酶一起表達，然後利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。
2. 蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達，以IgG Sepharose 6 FF純化。
二] 含組氨酸標記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。
9.純化——包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶於6M鹽酸胍或8M尿素中。高化學穩定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過濾介質很適合在變性條件下做純化。變性純化後的蛋白需要復性至蛋白的天然構象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發現有助包涵體蛋白的復性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高，復性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質很適合純化復性前的粗品，並可以1MnaOH重生。此方法純化後的包涵體蛋白，復性回收率明顯提高。
10.包涵體蛋白固相復性 *近年許多文獻報導將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質上，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質。去除變性劑後，蛋白在介質上成功復性，再將復性好的蛋白洗脫下來。固相復性避免了一般復性過程中蛋白質聚體的形成，所以復性得率更高，而且無需大量稀釋樣品，並將復性和初純化合二為一，大大節省時間及提高回收率。
*固相復性方法也被用於以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復性及純化包涵體形式表達的組氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復性及純化包涵體形式表達的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預裝柱均可反復多次重復使用，比一般試劑盒更方便、耐用。
11.純化——中草葯有效成分
中葯的化學成分極其復雜。傳統中葯多是煎熬後服用，有效成份多較為親水，包括生物鹼、黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸、多糖、肽和蛋白質。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能，例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨後，最後是甙元。 Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用於各種天然產物的分離，包括生物鹼、甙、黃酮、醌類、內脂、萜類、甾類等。
*生物鹼在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結構非常近似的生物鹼。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸等可溶於偏鹼的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。
*一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex，Sephacryl.若分子量在600KD以下，並需更高解析度，可選擇新一代的Superdex. 一般植物可能含水溶性、酸溶性、鹼溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進一步獲各組份純品。另外，多糖葯物需去除可引起過敏的蛋白質，傳統 Sevag方法用丁醇脫蛋白需反復數十次。陰陽離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中葯有效成分的檢測、分離和放大制備。由於中葯的成分非常復雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ，並可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比傳統硅膠反相層析更易於工藝優化及在位清洗，壽命也更長。
12.純化——肽類
肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機溶劑或促溶劑中復性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設計的凝膠過濾預裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。醫學都市多功能
13.純化——核酸、病毒
核酸的純化用於去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質粒DNA、噬菌體DNA和PCR產物等。病毒也可視作核酸大分子，和質粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。
14.純化——寡核苷酸寡酸苷酸多應用在反義（anti-sense）DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成後含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產物，並避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。
15.脫鹽、小分子去除
使用凝膠過濾介質Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達床體積30%.只需在進樣後收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡單直接。由於只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整個過程一般可於數分鍾至半小時完成。Sephadex G25系列介質專為蛋白質脫鹽而設計，預裝柱HiTrap Desalting（5ml）可用針筒操作。HiPrep Desalting（26ml）可在數分鍾為多至10ml樣品脫鹽。
16.疫苗純化 使用凝膠過濾介質Sepharose 4FF純化疫苗，去除培養基中的雜蛋白，處理量可大於床體積10%.柱高一般40-70cm，整個過程約半至一小時。目前使用此法生產的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
17.抗生素聚合物分析
中國葯典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產品的白分比，規定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。
18.純化-基因治療用病毒載體
SORRCE 15Q
19.純化-基因治療用質粒
Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游純化中，可應用不同層析技術在純化生物分子的同時，去除各種污染物。
1.去除——內毒素
內毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負電的復合大分子。
內毒素的脂肪A部份有很強的疏水性。但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒（17-1349-01）可選擇結合目標蛋白的介質而去除內毒素。
內毒素與陰離子交換介質Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結合。可在洗脫目標蛋白後用高鹽緩沖液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯內毒素底物如LAL，PMB，自動成親合層析介質結合內毒素。內毒素經常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加樣本黏度，令區帶擴張，反壓增加，降低解析度和流速。葯審和食檢對核酸含量也有嚴格限制。
胞內表達蛋白的核酸問題尤其嚴重。核酸帶陰電荷，在初步純化時利用陽離子交換介質如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads，SP或CM Sepharose FF，SP SepharoseXL結合目標蛋白，可除去大量核酸。
核酸在高鹽下會和蛋白解離，疏水層析介質很適合用來結合目標蛋白，在純化蛋白的同時去除核酸。
利用核酸酶將核酸切成小片斷，用凝膠過濾做精細純化時便很容易去除了。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成為病原，應盡量減除。結合不同層析技術，使用注射用水，用NaOH定期進行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外殼。可用與目標蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent）處理，使病毒失活，如Triton和Tween.再用適當的離子交換介質如CM Sepharose FF結合目標蛋白，去除S/D.
其它污染物可以改變pH和離子強度使其從目標分子中解離或失活，凝膠過濾介質Superdex及多種吸附性介質，SOURCE都是很好的精細純化介質，可去除多種微量污染物。
凝膠是指顆粒大小在1埃到10埃之間的混合物。高分子溶液和某些溶膠，在適當的條件下，整個體系會轉變成一種彈性的半固體狀態的稠厚物質，失去流動性。這種現象稱為膠凝作用,所形成的產物叫做凝膠或凍膠.
「氣凝膠」是指分散系為氣態的，如：雲，霧等，「固凝膠」有煙水晶等，「液凝膠」就是呈液態的膠體，如氫氧化鐵膠體 。
例：
食品級葡甘露膠（Gum Konjac-GM）
葡甘露膠（又稱：魔芋膠）系一種新型多用途微粒狀可食用膠。這里推出之葡甘露膠是以優質魔芋中提取的葡萄甘露聚糖為原料，經脫雜處理後採用先進技術加工而成，其中添加成分不含任何非食用化學配料或色素。與傳統的瓊脂、果膠、海藻膠等食品添加劑相比，葡甘露膠在膨脹率、粘度、增稠、穩定性及使用方便程度上皆顯著優於上述膠類，此外尚具有特殊的優點：無需添加任何凝固劑，在無糖、低糖或高糖條件下，在酸性、中性或鹼性條件下，常溫即可凝凍，凝膠性能理想；保持或強化了葡萄甘露聚糖所具有的降糖、降脂、減肥等保健功能，大大拓寬了魔芋應用的范圍；價格低廉、使用方便。
葡甘露膠能廣泛用於食品、飲料、醫葯、日用化工、科研等領域，作為瓊脂、果膠、海藻膠等的替代產品，價格低廉，且使用時無需改變原有的設備及工藝，能大幅度降低添加劑的使用成本，是一種理想的新型凝膠添加劑。為滿足不同產品開發的需要，一、凝膠（果凍）型：能與各種天然果汁、物料及色素良好混合，作為廣譜凝膠賦型劑，是製作果凍、水晶軟糖等的極佳原料，也可作為培養基支持體，且不需再添加其它任何膠類或鹼性成份；凝膠成型條件隨意、脫杯完整，凝膠強度高、韌性大。用量：0.7～0.9%。用法：在適量溫水中溶脹3～5分鍾，煮沸冷至70度左右時加入糖及各種配料，冷卻至室溫即成。
二、培養基型：用作替代瓊脂作為花卉及其它植物進行組織培養的支持體。組培苗根粗、苗壯，使用效果理想，成本大幅降低。用量：0.5～0.6％。用法：在溫水中溶脹3～5 分鍾，煮沸後冷卻即可。三、果肉（茶）飲料型：作為穩定劑與懸浮劑，替代瓊脂和羧甲基纖維素等，廣泛用於粒粒橙、果茶、果汁、豆奶、銀耳羹、八寶粥等異相懸浮劑等（或混合）飲料中，防止沉澱或分層。 用量：0.15～0.25％左右。用法：在適量溫水中充分溶脹後加入物料中。四、冷凍製品型：用於冰棒、冰淇淋等各種冷凍製品，可增大膨脹，減少冰晶，提高抗熱融性，使產品更加爽口。用量：0.15～0.25％左右。用法：在適量溫水中充分溶脹後加入物料中。五、增稠型：用於果醬、米、面製品中，可增大膨脹率，提高韌性，改善賦型和口感。是進口洋槐豆膠的理想替代物。用量：0.2～0.3％左右。用法：在適量溫水中充分溶脹後加入物料中。

7. 求助蛋白溶液內毒素去除的方法和原理

求助蛋白溶液內毒素去除的方法和原理
如果是大腸桿菌發酵後的蛋白溶液中內毒內素的含量非常高容,要去除需要進行多步處理,而且具體不同的蛋白處理的方法也不一樣.

我們也正在研究，具體是什麼蛋白呢？一般的蛋白如果是用親和層析純化的話，在層析過程中只要用大量的加Triton X-100的緩沖液沖洗就能將內毒素降低到葯典規定的范圍內了。

因為多粘菌素B親和層析柱存在安全隱患，我們不用。我們用一般的層析柱，像離子交換、金屬離子螯合層析等。

不好意思以前看過相關信息，但是現在我沒有相關資料，主要是多粘菌素B的脫落問題。

8. 離子交換層析在蛋白質分離中的應用

離子交換層析在蛋白質分離純化中有非常廣泛的應用，在樣品富集，回中度純化和精製階答段都可以採用。另外還可以利用離子交換層析去除DNA和內毒素。因此在生物製品工藝中應用非常廣泛。關鍵是要選擇合適的介質和分離條件。
你的問題范圍太廣，如果有具體的問題可以詳細討論。

9. 凝膠的生物

生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理和化學特性，然後通過實驗選擇出最有效的純化流程。
1.測定——分子量、PI
當目標蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時，可用PAGE電泳方法或層析方法加以測定。分離范圍廣闊的Superose HR預裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質在多個含不同PH緩沖液的試管中，可簡易地測出PI，並選擇純化用緩沖液的最佳PH。
2.選擇——層析方法
若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：
一 使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質如Superose、Sephacryl HR依據分子量將樣品分成不同組份。
二 用含專一配體或抗體的親和層析介質結合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯介質偶聯目標蛋白的底物、受體等自製親和介質，再用以結合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品。
三 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用於純化流程中。
3.純化——大量粗品
處理大量原液時，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質。擴張柱床吸附技術利用多種STREAMLINE介質，直接從含破碎細胞或組織萃取物的發酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結合為一。提高回收率，縮短純化周期。
4.純化——硫酸氨樣品
硫酸氨沉澱方法常被用來初步凈化樣品，經處理過的樣本處於高鹽狀態下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術，隨著介質種類不斷增多，漸被融入各生產工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質中選擇最適合介質及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。
5.純化——糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細胞膜組份、細胞、甚至亞細胞細胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質，專為俘獲整個細胞或大復合物，如膜囊等。
6.純化——膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應選用與目標蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質，藉此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。
7.純化——單抗、抗原
單抗多為IgG.來源主要是腹水和融合瘤培養上清液。在培養前除去IgG.重組蛋白A介質Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性，基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。
疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG.宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。
純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯介質如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯IgG，再進一步獲取IgG抗原。
HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養的單抗IgM，結合量達5mg IgM.HiTrap IgY是專門用來純化IgY，結合量達100mg純IgY.
8.純化——重組蛋白
重組蛋白在設計、構建時應已融入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產物，擴張柱床吸附技術STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個快速表達、一步純化的融合系統。
一 GST融合載體使要表達的蛋白和谷胱甘肽S轉移酶一起表達，然後利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。
2. 蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達，以IgG Sepharose 6 FF純化。
二 含組氨酸標記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。
9.純化——包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶於6M鹽酸胍或8M尿素中。一般包涵體蛋白樣品的純度越高，復性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質很適合純化復性前的粗品，並可以1MnaOH重生。此方法純化後的包涵體蛋白，復性回收率明顯提高。
10.包涵體蛋白固相復性
許多文獻報導將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質上，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質。而且無需大量稀釋樣品，並將復性和初純化合二為一，大大節省時間及提高回收率。
固相復性方法也被用於以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復性及純化包涵體形式表達的組氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復性及純化包涵體形式表達的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預裝柱均可反復多次重復使用，比一般試劑盒更方便、耐用。
11.純化——中草葯有效成分
中葯的化學成分極其復雜。例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨後，最後是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用於各種天然產物的分離，包括生物鹼、甙、黃酮、醌類、內脂、萜類、甾類等。
生物鹼在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結構非常近似的生物鹼。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸等可溶於偏鹼的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。
一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex，Sephacryl.若分子量在600KD以下，並需更高解析度，可選擇新一代的Superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、鹼溶性多種多糖。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中葯有效成分的檢測、分離和放大制備。由於中葯的成分非常復雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ，並可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比傳統硅膠反相層析更易於工藝優化及在位清洗，壽命也更長。
12.純化——肽類
肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機溶劑或促溶劑中復性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設計的凝膠過濾預裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。醫學都市多功能
13.純化——核酸、病毒
核酸的純化用於去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質粒DNA、噬菌體DNA和PCR產物等。病毒也可視作核酸大分子，和質粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。
14.純化——寡核苷酸寡酸苷酸
多應用在反義（anti-sense）DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成後含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產物，並避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。
15.脫鹽、小分子去除
使用凝膠過濾介質Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達床體積30%.只需在進樣後收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，HiPrep Desalting（26ml）可在數分鍾為多至10ml樣品脫鹽。
16.疫苗純化
使用凝膠過濾介質Sepharose 4FF純化疫苗，去除培養基中的雜蛋白，處理量可大於床體積10%.柱高一般40-70cm，整個過程約半至一小時。使用此法生產的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
17.抗生素聚合物分析
中國葯典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產品的白分比，規定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。
18.純化-基因治療用病毒載體
SORRCE 15Q
19.純化-基因治療用質粒
Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游純化中，可應用不同層析技術在純化生物分子的同時，去除各種污染物。 1.去除——內毒素
內毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負電的復合大分子。
內毒素的脂肪A部份有很強的疏水性。但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒（17-1349-01）可選擇結合目標蛋白的介質而去除內毒素。
內毒素與陰離子交換介質Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結合。可在洗脫目標蛋白後用高鹽緩沖液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯內毒素底物如LAL，PMB，自動成親合層析介質結合內毒素。內毒素經常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加樣本黏度，令區帶擴張，反壓增加，降低解析度和流速。葯審和食檢對核酸含量也有嚴格限制。
胞內表達蛋白的核酸問題尤其嚴重。核酸帶陰電荷，在初步純化時利用陽離子交換介質如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads，SP或CM Sepharose FF，SP SepharoseXL結合目標蛋白，可除去大量核酸。
核酸在高鹽下會和蛋白解離，疏水層析介質很適合用來結合目標蛋白，在純化蛋白的同時去除核酸。
利用核酸酶將核酸切成小片斷，用凝膠過濾做精細純化時便很容易去除了。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成為病原，應盡量減除。結合不同層析技術，使用注射用水，用NaOH定期進行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外殼。可用與目標蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent）處理，使病毒失活，如Triton和Tween.再用適當的離子交換介質如CM Sepharose FF結合目標蛋白，去除S/D.
其它污染物可以改變pH和離子強度使其從目標分子中解離或失活，凝膠過濾介質Superdex及多種吸附性介質，SOURCE都是很好的精細純化介質，可去除多種微量污染物。 凝膠是指顆粒大小在1埃到10埃之間的混合物。高分子溶液和某些溶膠，在適當的條件下，整個體系會轉變成一種彈性的半固體狀態的稠厚物質，失去流動性。這種現象稱為膠凝作用,所形成的產物叫做凝膠或凍膠.
「氣凝膠」是指分散系為氣態的，如：雲，霧等，「固凝膠」有煙水晶等，「液凝膠」就是呈液態的膠體，如氫氧化鐵膠體 。

10. 怎樣能去除水的的內毒素(求助)

去除水中的內毒素（熱源），可以選用超純水系統來去除。特別是在做細胞和組織培養、蛋白質分析和蛋白質純化等實驗時，內毒素（熱源）的存在會直接導致培養物的污染而失敗，為此，應該用超純水系統來除實驗室用水中的熱源。如果進水為自來水，則一般的順序是：1、預處理 2、RO（反滲透）3、初級純化（離子交換）4、雙波長UV燈消毒 5、超濾柱（去內毒素）6、終端過濾器（最後一道過濾）。這樣得出的水就是實驗室級超純水，一定會符合你的需要。 現在生產超純水的廠家很多，論售後服務等，比較優秀的 HEAL FORCE品牌，你可以考慮考慮。