蛋白質離子交換步驟

① 求離子交換色譜法分離蛋白質試驗步驟

離線pH梯度復-強陽離子交換色譜法制分離肽段混合物 這篇文獻能否幫助您？
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緩沖液和洗脫液最好一致。你自己查文獻看看選吧。

② 蛋白質的純化方法有那些呢具體步驟是什麼

蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：

（一）材料的預處理及細胞破碎

分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1. 機械破碎法

這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2. 滲透破碎法

這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3. 反復凍融法

生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。

4. 超聲波法

使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

(二) 蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。

（三）蛋白質粗製品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：

1. 等電點沉澱法

不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。

2. 鹽析法

不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。

3. 有機溶劑沉澱法

中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。

（四）樣品的進一步分離純化

用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。

③ 蛋白質純化的程序

分離純化某一特定蛋白質的一般程序可以分為前處理、粗分級、細分級三步。
前處理
分離純化某種蛋白質，首先要把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態釋放出來並保持原來的天然狀態，不丟失生物活性。為此，動物材料應先剔除結締組織和脂肪組織，種子材料應先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質的污染，油料種子最好先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。然後根據不同的情況，選擇適當的方法，將組織和細胞破碎。動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由於具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當的提取液一起研磨的方法或用纖維素酶處理也能達到目的。細菌細胞的破碎比較麻煩，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一個借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細胞破碎後，選擇適當的緩沖液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然後用適當介質提取。
粗分離
當蛋白質提取液（有時還雜有核酸、多糖之類）獲得後，選用一套適當的方法，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點沉澱和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適於用沉澱或鹽析法濃縮，則可採用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空乾燥或其他方法進行濃縮。
細分離
樣品經粗分級分離以後，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區帶電泳、等電點聚焦等作為最後的純化步驟。用於細分級分離的方法一般規模較小，但解析度很高。
結晶是蛋白質分離純化的最後步驟。盡管結晶過程並不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數量上佔有優勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白。由於結晶過程中從未發現過變性蛋白，因此蛋白的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定製品處於天然狀態的有力指標。
離子層析法
蛋白純化離子交換層析法有劑和離子交換劑當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
有機溶劑提取
蛋白質純化有機溶劑提取的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。

④ 為什麼說離子交換色譜法是分離蛋白質的最佳方法

它是根據蛋白質的組成物質氨基酸的物理性質（基於氨基酸電荷行為）為分離基礎的方法。相對透析和超過濾及凝膠過濾來說，可以針對多種蛋白質中的某一種（前提是知道蛋白質的氨基酸組成及其離子交換樹脂的親和度及洗脫強度）進行分離。（而透析和超過濾還有凝膠過濾方法更大的取決於相對分子質量及其結構 分離出的單一蛋白質純度相對要低 並且凝膠過濾要求凝膠對要求組分不能有吸附作用 適用性較低 ） 相對鹽溶和鹽析來說，分離單一蛋白質的純度要高，且更好的保留其天然理化性（鹽溶要求蛋白質分子吸附某一鹽離子從而改變其溶解性 但有些蛋白質吸附某些鹽離子後其蛋白質構象及理化性會發生改變）。 相對有機溶劑分級分離法，更好的保留其天然理化性（有機溶劑分類法易造成蛋白質不可逆變形 且適用范圍窄） 相對凝膠電泳和等電聚焦來說 更易於實現大量制備分離 且不改變蛋白質結構和功能（電泳會影響蛋白質結構 且操作繁瑣 成本高） 相對親和層析來說 它更加易於實現且成本低廉效果也不錯（親和層析需要制備其配體並與載體交聯 因而制備難且成本較高）
PS: 最好的分離方法不是例子交換色譜法 而是高效液相色譜法 相對離子交換色譜來說有著更高的效率、更高的解析度和過柱速度

⑤ 離子交換過程有哪幾個步驟

離子交換啟動再生程序,看你採用的是順流再生工藝還是逆流再生工藝,因兩種程序的過程步驟不同,同時還要已知手動或自動控製程序…以上這些不說明白,別人怎麼能給你一個正確答案…。一傑水質

⑥ 求求。。。進行蛋白質分離純化前，小試管預實驗法具體步驟望高手指點。

既然是小「試管」，應該是原核表達吧，一般多用lacZ啟動子來誘導表達，你沒多說專，我就按這屬個步驟來說：
1，檢測表達蛋白的可溶性：用新鮮菌種接種5ml或10ml搖菌，先37℃搖，3小時後誘導3h（這個溫度和時間有文獻參考是最好的），收菌體，用pbs洗2遍，再1mlPBS懸浮，破菌（超聲，或加溶菌酶，或試劑盒之類的），12000rpm離心20min，分別收集上清和沉澱。用1ml的pbs重懸沉澱，加SDS-PAGE的loading buffer至1X，沸煮5min，同時量上清也加loading煮沸，取適量上清和沉澱上樣跑SDS-page，看蛋白在上清和沉澱中的分布，一般選擇分布較多的做後續純化；如果上清中的量即使較少，但也夠用，優先選擇純化上清中的蛋白，因為是可溶性的，而沉澱中的是包涵體，會比較麻煩；
2，優化表達條件，這就要做多組對照時間，檢驗合適的表達溫度（這一步往往需要和1結合進行，有時37℃的包涵體在較低溫度下可能表現為可溶），擴菌時間和誘導時間。
基本如此吧，若有疑問，歡迎繼續討論，祝實驗順利！

⑦ 離子交換的基本步驟

含交換的離子先進入離子交換樹脂的孔徑內，浸潤，然後再相互作用，參考表面化學。

⑧ 建立離子交換法純化蛋白質的方法需要摸索哪些條件

1. pH值，緩沖液的pH值對於蛋白結合離子交換層析有非常大的影響，需要先摸索出合適的版pH值，既能權保證蛋白結合上離子交換層析，又不會出現不穩定沉澱的情況。

2. 鹽濃度，鹽濃度是離子交換層析洗脫的關鍵，需要摸索出蛋白能在什麼樣的鹽濃度下被洗脫，且洗脫後純度能夠達到最初的要求。

3. 柱體積，盡管各種離子交換層析均有理論結合蛋白量，但各種蛋白情況不一樣，需要摸索出能夠完全結合目的蛋白合適的柱體積。既不會太大造成洗脫濃度過稀，也不會太小造成目標蛋白過載。

4. 溫度，溫度可能會造成蛋白變性等等。

⑨ 離子交換過程的5個步驟

離子交換過程歸納為如下幾個過程1.水中離子在水溶液中向樹脂表面擴散2.水中離子進入樹脂顆粒的交聯網孔，並進行擴散3.水中離子與樹脂交換基團接觸，發生復分解反應，進行離子交換4.被交換下來的離子，在樹脂的交聯網孔內向樹脂表面擴散5.被交換下來的離子，向水溶液中擴散影響交換的主要因素有流速、原料液濃度、溫度等。流速原料液的流速實際上反映了達到反應平衡的時間，在交換過程中，離子進行擴散—交換—擴散一系列步驟，有效地控制流速很重要。一般，交換液流速大，離子的透析量就高，未來及交換而通過樹脂層流失的量增多。因此，應根據交換容量等選擇適宜的流速。原料液濃度樹脂中可交換的離子與溶液中同性離子既有可能進行交換，也有可能相斥，液相離子濃度高，樹脂接觸機會多，較易進入樹脂網孔內，液相濃度低，樹脂交換容量大時，則相反。但液相離子濃度過高，將引起樹脂表面及內部交聯網孔收縮，也會影響離子進入網孔。實驗證明，在流速一定時，溶液濃度越高，溶質的流失量液越大。溫度溫度越提高，離子的熱運動越劇烈。單位時間碰撞次數增加，可加快反應速率。但溫度太高，離子的吸附強度會降低，甚至還會影響樹脂的熱穩定性，經濟上不利，實際生產中採用室溫操作較宜。

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⑩ 怎樣使用離子交換析法分離不同的蛋白質

你好，離子交換內的介質一般是樹脂,陽離子交換型的,使用前樹脂先用鹼處理成鈉型。希望對你有所幫助。