内包材薄膜过滤法如何取样

A. 生物制品的无菌检查法的实验原理，准备工作及操作步骤

文献资料 - 医学书籍 - 中国生物制品规程
生物制品无菌试验规程

生物制品不得含有杂菌（有专门规定者除外），灭活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在制造过程中应由制造部门按各制品制造及检定规程规定进行无菌试验，分装后的制品须经质量检定部门做最后检定。各种生物制品的无菌试验除有专门规定者外，均应按照本规程的规定进行。

1抽样

1.1原液及半成品

原液及半成品应每瓶分别进行无菌试验，其抽样量应至少为0.1%，但不得少于1.0ml。

1.1.1大罐稀释的制品抽样数量不得少于10ml。

1.1.2原液及半成品每开瓶一次，应如上法抽验。

1.2成品

每亚批均应进行无菌试验，样品应随机抽取，应具有代表性（包括分装过程的前、中、后样品）。

1.2.1分装量在100支（瓶）或以下者抽检不少于5支，101～500支（瓶）者抽检不少于10支（瓶），501～10000支（瓶）者抽检不少于20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽检40支（瓶）。

1.2.2每瓶装量20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽检2瓶，200瓶及以上者抽检4瓶。6～20ml抽检量加倍。5ml和5ml以下者按1.2.1项抽检。

1.3凡规定需作支原体检查的制品，均应在半成品时按亚批进行检查，成品可不再做。

2无菌试验用培养基（培养基处方可附录1）

2.1检查制品中本菌是否存活应采用适于本菌发育生长的培养基（在半成品时检查，有专门规定者除外）。

2.2检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。检查不含汞类防腐剂制品中的需氧性和厌氧性杂菌时，该培养基中可不加硫乙醇酸盐。

检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。

检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含量，做成斜面。

2.3检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培养基。

2.4生物制品无菌试验用培养基亦可用经检定合格的干燥培养基配制。

2.5无菌试验培养基的灵敏度，乙型溶血性链球菌（32210株）应达到10-8，短芽胞杆菌（7316株）和生孢子梭状芽胞杆菌（64941株）应达到10-7，白色念珠菌（ATCc 10231）和腊叶芽枝霉应达到10-6。

2.6生物制品无菌试验培养基由质量检定部门与培养基制造部门会同进行灵敏度试验。每当更换主要原材料时，应进行灵敏度试验，合格后方可应用（灵敏度试验法见附录2、3）。

2.7各生产单位的质量检定部门应定期抽检无菌试验培养基的灵敏度，检定所应定期抽检各所的无菌试验培养基。

3无菌试验方法

3.1无菌试验取样、移种等全部操作，应在无菌操作室内或无菌条件下进行，无菌操作室应经常保持清洁，在每次操作前，应彻底消毒。

3.2菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品及粘稠不易过滤的血液制品应用直接接种法进行无菌试验。人白蛋白及人丙种球蛋白（包括各种剂型及应用途径的制品）应用薄膜过滤法进行无菌试验，其他血液制品亦可用薄膜过滤法或直接接种法进行。

3.3直接接种法

3.3.1菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素类制品

3.3.1.1每安瓿装量5.0ml以上者（不含5.0ml）取样不应少于1.0ml，装量在5.0ml以下者（含5.0ml）取样不得少于0.5ml，装量不足0.5ml者，全部吸取。

3.3.1.2含防腐剂的制品，接种量与培养基的比例：用苯酚或氯仿作防腐剂者至少为1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1:50。先按此比例接种于硫乙醇酸盐培养基内增菌，于20～25℃培育3～4天后移种至硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面、改良马丁培养基各2管，每管0.5ml。将硫乙醇酸盐培养基、适宜的琼脂斜面各1管置30～35℃培育，其余各管置20～25℃培育，培育时间除有专门规定者外共为8天。

3.3.1.3不含防腐剂制品，装量在5.0ml以下者（包括5.0ml）每10支安瓿混合，装量在5.0ml以上者每7支安瓿混合，将混合后的样品直接接种一组培养基，分别置20～25℃、30～35℃培育，培育时间共为8天。

作者：天使也美丽 2006-2-24 16:39 回复此发言

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2 生物制品无菌试验规程

3.3.1.4支原体培养基临用时将半固体煮沸10～15分钟后，冷却到56℃左右，加入未灭能马血清或灭能小牛血清和酵母浸液（培养基、血清、酵母浸液之比为7:2:1），并可酌情加入适量青霉素或醋酸铊，充分摇匀，等冷至35～37℃时种入待检样品0.5～1.0ml，共接种2支培养基，置35～37℃培育14天。

3.3.1.5 混浊和接种后不能判定结果的制品，可取规定量的样品接种于不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基（200ml）内进行增菌培养，3～4天后移种。培养基种类和支数、培育温度同3.3.1.2项，共培育8天后判定结果。

3.3.2血液制品

3.3.2.1取规定抽样数，按下列规定，从每瓶抽取样品，并全部接种完。

样品每瓶装量不足1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取1.0ml以上，每支装量为15ml的培养基，接种1.0ml。

样品每瓶装量以下者（不含）抽取5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽样，每支装量为40ml的培养基，接种5.0ml。

应接种的培养基支数依取样的总量而定。接种硫乙醇酸盐培养基与改良马丁培养基支数之比为2:1。

接种后将硫乙醇酸盐培养基总支数的1/2置30～35℃培育，其余置20～25℃培育，改良马丁培养基置20～25℃培育，培育时间不少于14天。

3.4薄膜过滤法

滤膜孔径为0.22～0.3μm。

取规定抽检样品数，每瓶装量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上者取半量加入灭菌薄膜过滤器内，加压或减压过滤。如为含汞防腐剂者，在样品过滤后，应用灭菌生理盐水或其他适宜溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。过滤后，无菌取出滤膜，分别放入硫乙醇酸盐培养基2支及改良马丁培养基1支（每支装量不少于40ml，高度不得低于7cm）。如果使用一个过滤装置，则将该膜剪成三等分，分别放入规定培养基中。将滤膜放入培养基后，一支硫乙醇酸盐培养基置30～35℃培育，其余各支培养基置20～25℃培育。培育时间不少于7天。

最好采用全封闭式一次性微孔过滤集菌器，要求每支培养器培养装量为100ml。

3.5检查厌氧性杂菌用培养基需加热驱氧者，必须冷却到45℃以下再行接种。

3.6冻干制品按使用说明书或瓶签规定的稀释量稀释后进行无菌试验。

4判定

4.1无杂菌生长判为合格（有专门规定者除外）。

4.2无菌试验发现杂菌生长，可复试。该制品量应加倍。若复试仍有同样杂菌生长，该制品判为不合格。如为不同杂菌生长，可第二次复试，复试样品为第一次复试量的2倍，若仍有杂菌生长该制品判为不合格。支原体阳性者不复试，该批制品判为不合格。

4.3成品无菌试验不合格的亚批数占整批的30%以上时，由质量检定部门会同有关部门根据具体情况，全部或部分废弃。

附录 1无菌试验培养基处方

1硫乙醇酸盐培养基

胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg） 15g
酵母浸出粉（或酵母透析液200ml） 5g
葡萄糖
5g

氯化钠
2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）
0.5g

硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）
0.5g

琼脂
0.65～0.75g

新鲜配制的0.1%刃天青溶液（或0.2%美蓝溶液0.5ml）
1.0ml

去离子水（或蒸馏水）
加至1000ml

最后pH7.1±0.2

2硫乙醇酸盐培养基（不含琼脂）

胰酪蛋白胨（或酪素胰酶消化液，以总氮计2000mg）
15g

酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）
5g

葡萄糖
5g

氯化钠
2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸盐酸盐）
0.5g

硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸0.6ml）
0.5g

去离子水（或蒸馏水）
加至1000ml

最后pH7.1±0.2

3 改良马丁培养基

葡萄糖
20g

蛋白胨
5g

酵母浸出粉（或酵母透析液100ml） 2g

磷酸氢二钾
1g

硫酸镁（含7分子结晶水）
0.5g

去离子水（或蒸馏水）

B. 水质检测时，我们用薄膜过滤法。但是我有几个问题向老师请教.

1 生物酶并没来有你想像的多 不会影响细自菌生长 而且薄膜过滤后会被滤掉只剩下微生物
2 营养琼脂和玫瑰红钠都不是选择培养基 有时候会有都长的情况 营养琼脂培养基建议加TTC让细菌更容易观察 也可以通过其他方式来判断~比如细菌菌落大小不一 一般比较小 边缘光滑 味道臭 真菌酵母菌菌落大 有的会长毛 有酒香或霉味。更准确的方法是用选择培养基进一步培养 或显微镜观察 最好是增加阳性对照试验

C. 药包材的分类有哪些取样原则又是怎样的

新版GMP第222条是对物料检验取样操作的规范要求，其中明确规定企业制定的取样操作规程应规定取样量，取样方法应当科学、合理，以保证样品的代表性。如何保证取样的代表性？对于药材和中药饮片，大多执行药典通则规定的取样原则。原辅料的取样，一般采取的是3件以内，逐件取样；超过3件，按总件数开根号加1进行取样。但对于包装材料，如何取样比较合理，业内做法不尽一致。不少企业的相关规程规定的取样件数比例与原辅料相同，但实际操作时却又未按规程执行。对此，笔者有以下几点思考。包装材料与原辅料的本质差异除了与药品直接接触的包装材料和容器外，药品生产企业使用的绝大多数包装材料与药品内在质量并无直接关系。药典相关指导原则中，对“药包材”的概念，就是指“直接与药品接触的包装材料与容器”，其它包材并不包含其中。即使与药品直接接触的包装材料，鉴于其在产品研发阶段，已经就其安全性、稳定性、功能性、保护性以及与所包装药品的相容性等进行了全面、系统的研究，因此，在不改变材质与供应商的情况下，包材总体上不会对产品安全带来大的影响。因此，对包装材料的取样原则不宜套用一般原辅料，既没有必要，在实际工作中也存在操作性不强的一面。有的企业未按规程规定件数对标签类包材进行取样，在认证检查过程中，被作为缺陷项目提出。因此，作为药品生产企业，有必要根据具体情况，天和医塑研究拟订有别于原辅料的包装材料取样原则。包装材料的合理分类对于企业使用的各类包装材料，有必要依据其对药品安全质量可能产生的影响，予以合理分类。笔者认为，对包装材料，同样可以根据其对药品质量及安全性影响程度，划分为A、B、C三类。A类即是直接接触药品的包材与容器，包括输液袋（瓶、膜及配件）、安瓿、药用胶塞、药用滴眼（鼻、耳）剂瓶、药用硬片、药用铝箔、药用软膏管（盒）、药用喷剂泵（阀门、罐、桶等）、药用干燥剂、口服制剂灌装瓶等。B类包材包括各类印刷性包装材料（如标签、说明书以及印有产品信息的包装材料等）。C类包材则主要指非印刷性的不直接接触产品的包装材料（如打包膜、胶带等）。依据包装材料的分类，再确定取样原则，既可以体现风险管理要求，又可以提高工作效率，确保实施GMP过程的务实、有效。

D. 微生物限度检查中用膜过滤法时，是把滤膜上有菌液的那面贴到培养基上，还把反面贴到培养基

微生物限度的方法有多种。如果是用膜过滤法的话，就你提到的问题，可以查询2010版的《中国药典》附录，里面有提到。应该是把滤膜接触到供试液的那面贴于培养基上。

E. 纯化水的微生物限度里的薄膜过滤法如何计数啊

一次两毫升水。把过滤完成的薄膜正面贴在R2A平板上，18小时后计数，每天数一次，可以用软件数，也可以人工数，用记号笔在碟子上打点。细菌三天，霉菌五天。

F. 纯化水微生物限度检查用薄膜过滤法怎么做

准备工作：

用纯化水浸泡滤膜，浸泡完全后放入滤杯中，包好滤杯，连同回量筒、培养基、平皿、答取膜器、三角烧瓶等一起121℃灭菌30min。

灭菌后的物品一并传入洁净室中，微生物限度过滤器上连好已经灭好的滤杯，用缓冲液先润湿滤膜，抽掉缓冲液，然后倒入供试液（10倍稀释），滤过，再用缓冲液冲洗滤膜。

过滤结束后取下滤膜平贴于R2A琼脂培养基平板上，32℃倒置培养5天。菌落计数（平皿上长几个菌结果就报几个菌）

(6)内包材薄膜过滤法如何取样扩展阅读：

薄膜过滤系统主要用于去除小颗粒及溶解盐，一般可分为微滤、超滤、纳滤和薄膜过滤反渗透。

微滤又称微孔过滤，它属于精密过滤，截留溶液中的砂砾、淤泥、黏土等颗粒和贾第虫、隐抱子虫、藻类和一些细菌等，而大量溶剂、小分子及少量大分子溶质都能透过膜的分离过程。

超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化

纳滤 ( NF，Nanofiltration)是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右。

参考资料来源：网络-薄膜过滤

G. 纯化水进行微生物限度检测，使用薄膜过滤法应该取多少

准备工作：用纯化水浸泡滤膜，浸泡完全后放入滤杯中，包好滤杯，连同量筒、培养基、专平皿、取膜器、三角属烧瓶等一起121℃灭菌30min。灭菌后的物品一并传入洁净室中，微生物限度过滤器上连好已经灭好的滤杯，用缓冲液先润湿滤膜，抽掉缓冲液，然后倒入供试液（10倍稀释），滤过，再用缓冲液冲洗滤膜。过滤结束后取下滤膜平贴于R2A琼脂培养基平板上，32℃倒置培养5天。菌落计数（平皿上长几个菌结果就报几个菌）

H. 微生物薄膜过滤法，夹膜技巧

（1）验证试验方法：试验原理同前述薄膜过滤法。验证供试品对薄膜过滤法有抑细菌和抑真菌特性时，与实际的无菌检查相同，在同一型号的每个过滤器或过滤筒内过滤规定定量的供试品（容器数及每容器的过滤体积），用淋洗液淋洗滤膜至少3次，每次淋洗液体积为100ml，在最后一次淋洗液中，接入验证用菌种（接种量为10—100CFU）；另取一过滤器或滤筒，不过滤供试品，重复以上淋洗操作，作为阳性对照。根据具体情况，可将整张滤膜或半张滤膜转移至100ml的指定验证用培养基内，或将培养基加入到装有滤膜的滤筒内。分别对表中所列菌种及相应的培养基逐一进行验证，并将容器置于适当的温度下培养，培养时间不超过14d。如果使用新的滤膜或滤过器（包括不同厂家或批号、型号），则要按上述薄膜过滤法的要求做 , 组试验，即样品试验组、蛋白胨对照组和阳性对照组重新进行验证确认。
（2）验证结果评价：如果供试品培养基容器内的培养基内明显可见微生物生长（混浊），并且与阳性对照容器内的培养结果相似，则在无菌检查试验中必须要过滤与验证试验相等量的供试品、淋洗液，淋洗相同次数及使用同量的培养基。如果与阳性对照容器内的培养结果相比，供试品容器内微生物生长现象不明显，则说明该检验量在此检验条件下有抑菌作用。应增加淋洗次数，重复以上实验。也可通过更换过滤膜并使用中和剂来消除产品的抑菌作用。USP规定，如果已淋洗了5次，并且每次淋洗液体积达到500ml，仍无法中和膜上的残余抑菌性物质，那么在无菌检查试验中就采用此淋洗次数与淋洗量作为最终淋洗方法。

I. 什么叫薄膜过滤法，具体怎么操作呀

5.7.7 薄膜过滤法：
5.7.7.1 本法适用于有抗菌作用或大容量的供试品。
5.7.7.2 按集菌使内用规程安装好集菌仪。
5.7.7.3 取供试品擦拭消容毒后，除去塑料盖，插好导管，进行抽滤，滤液从排液管排出。
5.7.7.4 同法操作将培养基抽到全封闭式集菌培养器中。
5.7.7.5 取需气菌、厌气菌培养基和真菌培养基各1管，同法操作加入相应的溶剂作阴性对照。
5.7.7.6 阳性对照管应根据供试品特性在接种橱内加入相应对照菌液1ml。（抗细菌药物以金黄色葡萄球菌为对照菌，抗厌氧菌药物以生孢梭菌为对照菌，抗真菌药物以白色念珠菌为对照菌）。
5.7.7.7 需气菌、厌气菌培养基管置30-35℃培养箱中，真菌培养基管置20-25℃培养箱中各培养7日；阳性对照管细菌应在培养24-48小时，真菌应在培养24-72小时有菌生长。

J. 薄膜过滤法原理

薄膜过滤法

采用薄膜过滤法，滤膜孔径不大于0.45um，直径约为50mm。选择滤膜材质时候应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用后，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润洗滤膜，供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1克或1ml供试品的供试液，加至适宜的稀释剂中，混匀过滤。若供试品每1克或1ml所含的菌数比较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用PH无菌氯化钠——蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。

阴性对照实验

取实验用的稀释液1ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

培养和记数：

培养条件和记数方法同平皿法，每片滤膜上的菌数不应超过100个

菌数报告规则

以相当于1克或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌生长以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或以<1

乘于稀释倍数的值报告菌数。