A. 磺酸基阳离子交换键合硅胶色谱柱，怎样维护保养及活化
在使用系统之前，首要任务是检查色谱柱是否受到微生物污染，否则可能会导致柱子堵塞，使得柱压升高到无法接受的水平。首先，不连接检测器，正向安装色谱柱，使用纯甲醇以0.6ml/min流速冲洗大约10倍柱体积。接着，连接检测器，继续使用纯甲醇以相同流速冲洗约20倍柱体积。随后，改用去离子水以相同流速冲洗约20倍柱体积。
为确保色谱柱的最佳性能，建议连接保护柱（通常由制造商提供），然后用选定的洗脱液以0.6ml/min流速平衡柱子至少1小时。在用分析洗脱液进行平衡前，如果洗脱液中含有缓冲盐，应先使用不含缓冲盐的同比例洗脱液过渡，冲洗约10倍柱体积，以避免缓冲盐在分析柱内析出。
在进行洗脱液选择时，需注意阳离子交换柱多使用柠檬酸或酒石酸缓冲液（或其混合溶液）、邻苯二甲酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5；阴离子交换柱则多使用磷酸缓冲液、硝酸铵溶液（1mMol/L），邻苯二甲酸缓冲液，pH范围同样从2.5到6.5。绝对禁止使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸的分解产物会改变固定相的性质。洗脱液在使用前必须通过0.45um滤膜过滤并彻底脱气，以避免检测和泵送问题。
为了提高分析的稳定性，建议在室温条件下使用色谱柱，如果需要，可以将柱温设置为高于室温5～10℃。避免在40℃以上使用，以防损坏色谱柱。
在使用过程中，切勿超过色谱柱的耐受最高压力。调整流速时，应采取小的间隔变化以避免柱床扰动。更换柱子时，务必先将流量降至0，等待洗脱液完全流出柱子，压力变化到0（约2min）后再进行更换。
防止将来自流动相或样品中的疏水性或与流动相极性差别很大的化合物进入色谱柱，尤其要避免导入颗粒杂质，以防止操作压力增高，污染物难以或不能去除。
分析完毕后，采用与C18柱类似的净化程序，首先用去离子水以0.6ml/min流速冲洗约20倍柱体积，然后用甲醇以相同流速冲洗约10倍柱体积，确保纯甲醇饱和后密封保存。
对于长时间保存后的重新使用，重复上述步骤即可。
B. 离子交换层析速问速答
离子交换层析是一种基于样品的带电性质进行分离的技术，主要用于蛋白纯化。以下为离子交换层析的问答，旨在深入理解该技术。
01、离子交换层析分为哪几种？
离子交换层析根据配基的不同，主要分为阳离子交换层析和阴离子交换层析。阳离子交换柱可以吸附带正电荷的蛋白，而阴离子交换柱则吸附带负电荷的蛋白。
02、如何选择阳离子还是阴离子？
蛋白是两性分子，具有等电点（PI）。当缓冲液的PH值低于蛋白的等电点（PI），蛋白带正电荷时，应选择阳离子交换柱；反之，当PH值高于等电点（PI），蛋白带负电荷时，选择阴离子交换柱。
03、强和弱离子交换剂的区别？
强离子交换剂在PH范围内载量恒定，弱离子交换剂载量随PH变化。优先使用强离子交换剂，若选择性不足，尝试使用弱离子交换剂。
04、如何选择缓冲液的PH值？
建议使用PH 6-8的中性缓冲液。通常，选择与等电点相差1个PH值的缓冲液作为初始尝试。为了达到最佳分离效果，通常需要进行PH条件的摸索。
05、若不知道蛋白的等电点？
大多数蛋白的等电点低于PH 7，可以使用Q柱进行尝试，缓冲液使用PH 7。也可以选择离子交换试剂盒进行摸索。
06、缓冲液的配置？
请参照说明书，注意在添加氯化钠后调整PH。
07、初次实验的标准条件？
开始使用缓冲液A：20-50 mM，洗脱缓冲液B：20-50 mM + 1M NaCl。
08、样品未结合？
可能原因包括：样品盐浓度太高、PH优化不足、缓冲液含有带电物质（如去垢剂）、柱效下降。解决方法包括CIP清洗。
09、结合后无法洗下？
尝试增加洗脱液盐浓度、评估蛋白稳定性、优化PH值。
10、纯度不足？
解决方法包括：采用线性梯度洗脱、优化缓冲液条件、使用更高分辨率产品、增加分子筛、疏水等多步纯化。
C. 将四种核苷酸吸附于阴离子交换柱上时，应将溶液调到什么 ph
① 电泳分离4种核苷酸时应取pH3.5 的缓冲液，在该pH时，这4种单核苷酸之间所带负电荷版差异较大权，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为：UMP>GMP>AMP>CMP；
② 应取pH8.0，这样可使核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂柱。虽然pH 11.4时核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对分离不利。
③ 当不考虑树脂的非极性吸附时，根据核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度，则洗脱顺序为CMP>AMP> GMP > UMP，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：CMP> AMP > UMP >GMP。
D. 离子交换层析具体操作
离子交换层析操作详解
1. 预处理和装柱是离子交换层析的关键步骤。首先，对于离子交换纤维素，需要流水冲洗去除碎屑，以确保均匀度。若产品已溶胀，可跳过这步，但需确保其成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂通常采用“碱-酸-碱”处理，转变成-OH-或盐型，阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，变为-H-型。装柱前，平衡至所需的pH和离子强度，并减压排除气泡。为了防止颗粒分层，装柱时需适当加压，确保柱床紧实，以提高分辨率。装好后，需用起始缓冲液淋洗，直至达到平衡状态方可使用。
2. 加样与洗脱阶段，样品应与起始缓冲液保持相同的pH和离子强度，选择的pH值应在交换剂与结合物相反电荷的范围内，同时离子强度要低，可通过透析、凝胶过滤或稀释来调整。不溶物需预先除去。合适的上样量是关键，一般不超过柱子的负荷能力，上样量通常为交换剂总量的1%-5%。洗脱样品时，可通过改变pH或离子强度，或采用阶段洗脱或连续梯度洗脱法，后者通过控制两个容器中缓冲液浓度的梯度变化来达到最佳分离效果。在洗脱过程中，需确保洗脱液体积充足，梯度上限足够高且上升速度适中，以防止目的物过早或过晚解吸。
3. 洗脱后的分析，以5-10毫升/管收集洗脱液，通过检测方法（如生物活性测定或免疫学测定）确定目的物位置，然后进行回收。对于离子交换剂的再生，如纤维素可用NaCl和NaOH溶液处理，脂溶性物质则需非离子型去污剂或乙醇清洗。保存时，需添加防腐剂，阴离子交换剂通常使用氯已定，阳离子交换剂则使用乙基硫柳汞，有些产品可添加叠氮钠。
离子交换层析操作需严格把控各个步骤，确保样品处理得当，洗脱过程有效，以实现理想的分离效果。
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1