氨基酸和蛋白质离子交换层析

① 蛋白纯化--色谱层析

蛋白纯化中的色谱层析技术主要包括凝胶过滤色谱、离子交换层析与亲和层析。

• 凝胶过滤色谱：

  • 原理：根据分子的流体动力学体积或大小差异来分离蛋白质。分子大小与凝胶孔径的差异导致其在色谱柱中的洗脱顺序不同。
  • 特点：设备简单，操作方便，重复性好，样品回收率高。适合分离蛋白质、核酸等大分子物质。但分辨率不高，尤其对于分子量相近的物质分离效果有限，且处理量小，样品粘度不宜太高，分离操作较慢。

• 离子交换层析：

  • 原理：通过离子交换剂与流动相中的离子进行可逆交换来实现分离。根据离子的可离解性、电荷与表面电荷分布的差异进行分离。
  • 特点：广泛应用于氨基酸、蛋白等生化物质的分离纯化。操作相对简单，但离子强度、pH、温度、溶剂等条件对分离效果有重要影响。

• 亲和层析：

  • 原理：利用分子间的特异性识别和相互作用来分离纯化物质，如酶与底物、抗原与抗体之间的结合。
  • 特点：具有高选择性、高分辨率与高结合载量的优点，可以一步完成高纯度的分离，适用于多种生物大分子的纯化。

② 离子交换层析可用于哪些种类蛋白质的分离

离子交换层析是利用蛋白质在不同PH带不同种电荷的方法，利用离子交换的方法分离专蛋白的。
离子交换属内的介质一般是树脂，阳离子交换型的，使用前树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3时，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而被“挂”在树脂上，再用洗脱剂洗脱。不同的氨基酸（带的电荷不同）与树脂的亲和力不同，要将其分离洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，反之亦然。

不同反荷离子与树脂亲和力是不同的，其强弱关系为阳性竞争离子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+ 阴性竞争离子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F- 如果某种离子溶液洗脱效果不好，可用另一种亲和力强的离子代替之，等电点＞7选择阳离子交换树脂，等电点＜7选择阴离子交换树脂。

③ 蛋白质水解产物阳离子交换柱层析时的洗脱顺序

pI 10.76的那个应该带正电荷。阳离子交换柱本身带负电荷。

④ 求问怎么用离子交换树脂层析分离混合氨基酸

离子交换树脂作为一种合成高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂根据所带基团可分为强酸（＝R＝SO3H）、弱（＝COOH）、强碱（＝N+＝R：）和弱碱（＝NH2＝NHR＝NR2）。离子交换树脂适用于分离小分子物质，如氨基酸、腺苷、腺苷酸等。然而，对于生物大分子如蛋白质，则不太适宜，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。因此，如果需要分离生物大分子，可以选择多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。

本次实验利用磺酸阳离子交换树脂（Dowex 50）分离混合氨基酸，包括酸性氨基酸（天冬氨酸）、中性氨基酸（丙氨酸）和碱性氨基酸（赖氨酸）。在特定的pH条件下，这些氨基酸解离程度不同，通过调整脱液pH或离子强度可以实现分离。实验中所用到的材料包括层析柱、恒流泵、梯度混合器、试管及试管架、紫外分光光度计、2mol/L HCl、2mol/L NaOH、0.1mol/L HCl、0.1mol/L NaOH、pH4.2的柠檬酸缓冲液、pH5的醋酸缓冲液、0.2％中性茚三酮溶液以及氨基酸混合液。

树脂处理步骤为：首先将树脂置于100ml烧杯中，加入25ml 12mol/L HCl搅拌2小时，倾弃酸液后用蒸馏水洗涤至中性。随后，再加入25ml 12mol/L NaOH搅拌2小时，倾弃碱液后用蒸馏水洗涤至中性。最后，将树脂悬浮于50ml pH4.2柠檬酸缓冲液中备用。

装柱步骤包括：取直径0.8cm～1.2cm、长度10cm～12cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的树脂悬浮液。关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，使树脂沉积至8cm～10cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，确保流出液pH为4.2，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。

加样、洗脱及洗脱液收集步骤为：打开山口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口。用长滴管将15滴氨基酸混合液直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol/L HCl 3ml，以10滴/分钟～12滴/分钟的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。当HCl液面刚平树脂表面时，用1ml pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2ml pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10滴/分钟～12滴/分钟并注意勿使树脂表面干燥。

在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10分钟，如溶液呈紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。在用pH4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部剩余的pH4.2柠檬酸缓冲液移去。于树脂顶部加入2ml 0.1mol/L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面步骤续用0.1mol/L NaOH洗脱并逐管收集，注意保持流速10滴/分钟～12滴/分钟，每管20滴。做洗脱液中氨基酸检验，在第三个氨基酸用0.1mol/L NaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。

最后，以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以-，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。

实验注意事项包括：保持流速10滴/分钟～12滴/分钟，并注意勿使树脂表面干燥。在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。