离心超滤步骤

⑴ 蛋白质分离纯化的四种方法

1、盐析法：

盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法：

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。

3、蛋白质沉淀剂：

蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

(1)离心超滤步骤扩展阅读：

蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。

机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20% ，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。

人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。

⑵ 超滤离心管用材要求

⑶ 蛋白质分离提纯方法

1、盐析法：

盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法：

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。

3、蛋白质沉淀剂：

蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

(3)离心超滤步骤扩展阅读：

吸附层析

1、吸附柱层析

吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

2、薄层层析

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。

3、聚酰胺薄膜层析

聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。

层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。

⑷ 想问一下超滤离心管怎么使用啊还有它能不能重复使用

可以的,先用超声波洗干净,再用高压灭菌锅灭菌后,备用即可

⑸ 【求助】超滤离心是怎么回事

超滤离心机是使用带超滤膜的离心管，这个膜有分子量的区别，可以截留大于回膜孔径的答分子，一般的离心机就可以了，还要选好你的离心管体积，这样才能和你离心机配套使用 情非所属(站内联系TA)一般一百左右一根，特殊的可能更贵，有50ml，10ml，一般的离心机都可以，只要管子能套上，同一种物质在膜完好不堵塞的情况下可以重复下，但是不能太多次数，两三次就好了！

⑹ 求助：第一次使用超滤离心管应该怎么处理

可能不同厂家的产品保存运输条件不一样。
如果有甘油等保护剂，那就一定要洗干净再加样品。版权
干的超滤管也要先润湿再用，否则可能不能完全利用膜面积。
最好，用样品buffer润洗下再加样，最大程度保证蛋白活性。尤其是用过后保存在NaOH或乙醇中后。
一般还是离心机甩一下好，使膜充分浸润。

降低吸附的办法有：
1，蛋白浓度不要过低
2，尽量选用纤维素的低吸附超滤管
3，用前可以用Tween 80等去垢剂润洗（不影响蛋白活性的前提下）
4，加入保护蛋白，如BSA(不影响蛋白后续使用的前提下)

用完保存在20% EtOH中，4C保存，防止长菌，依不同样品可以重复使用不同的次数。

⑺ 【求助】超滤能否脱盐和浓缩一步完成啊

昨天有个millipore的技术人员就是这样说的~HarveyWang(站内联系TA)本人主要是从发酵液中提取酶,文献上一般的步骤是先用硫酸铵沉淀,然后透析,再用超滤浓缩,最后冷冻干燥, 这要看你需要做多大的体积了。:) (1)硫酸铵沉淀法：我的观点是，如果你1000 mL的发酵液的话，硫酸铵沉淀可以用，但是这浪费多少硫酸铵啊？！做学术研究可以，如果你的课题是计划做提取酶的工艺和中试的话，这种硫酸铵沉淀并不有太大的实用性。 （2）超滤步骤的选用要看你的酶溶液有多大的体积。 如果发酵液的酶的量并不是很浓的话，例如50 mL 10 mg/L的酶量，用这种超滤膜会损失掉大部分你的目地酶，都粘到膜上去了，很难洗下来（稀的NaOH可以）。不能轻信某品牌销售说的话，用用就知道了。如果你的浓缩液体积比较大，例如100-500 mL，酶的浓度也很高，这是可以用超滤膜的。 （3）对于小体积的脱盐透析，透析袋很好用的。这里是指10 mL-100 mL。从操作方便性上看，这个在小型试验中我最喜欢用。好简单啊。。。。 自己顶一个,解答的详细的有重奖!(金币可以再加) （1）发酵液的酶蛋白浓度大约是多少，纯度是多少？发个SDS-PAGE看看，注明上样量。 （2）硫酸铵沉淀后和透析后可上离子交换，这可以浓缩10-1000倍，还可以有纯化效果，然后再冷冻浓缩啊。HarveyWang(站内联系TA)哈哈哈哈，回帖就有金币拿:Ddaidai0124(站内联系TA)本人现在只是小规模的提取酶,马上要上发酵罐,需要大规模的提取酶液,不是做酶学性质,所以酶的纯度要求不高,和工业用酶的纯度差不多就可以了!希望大家推荐个适合工业化提取酶液的工艺,主要考虑成本问题.请版主帮忙在增加悬赏金币20个lvgl158(站内联系TA)起码知道 它的分子量 才能知道是否可以用同一个膜 如果小于一万可能就有点难度 可以先用少量的硫酸铵澄清 离心后 进行超滤 在超滤前 必须的保证液体 清澈hezhao999(站内联系TA)体积的在200ml以上用超滤仪，200ml以下可以用超滤离心管，如果不知分子量选用1000的膜完全可以了，如果知道分子量，则选择酶分子量1/5的超滤膜。zhaocy8903(站内联系TA)多大规模的发酵 多大规模的发酵

⑻ 用超滤离心法测包封率脂质体需不需要稀释

超滤离心前应该可以根据需要进行稀释，也可以不稀释。
超滤离心后，内如果是取收集的离容心液进行检测的话，建议取离心液进行定量稀释，比如到固定体积的量瓶中，以便根据稀释倍数确定离心液中的药物浓度从而计算包封率。

⑼ 离心管和离心超滤管分别是做什么用的,这个两个有什么区别!

离心管就是一个简单的可以承受高转速压力的管子,比如离一些样品,分离出上清沉淀专.离心超滤管会有一个属类似于内管和外管的两个部分,内管中是带有一定分子量的膜,当高速离心时,分子量比它小的就漏到下面的管子（即外管）中了,分子量比它大的就截留在上面（即内管中）,就是超滤的原理.常用于浓缩样品.

⑽ 蛋白质的纯化实验

一、仪器设备
色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、铁架、铁夹及水平仪；部分收集器（fraction collector, 需准备干净试管约100 支）；浓缩用离心机 （低速5,000 rpm）；浓缩用离心管Centriprep-30 （Amicon 4322） 请注意其使用方法。

二、药品试剂
胶体Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 预先以缓冲液buffer A-150 平衡好，并且使完全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用量。b. 胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。c. Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。Buffer A-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合 （Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每组取0.4 mL.含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 kD）， vitamin B12 （1 350）。

三、管柱装填

1. 以纯水冲洗玻璃管柱 （以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并请了解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接部分收集器，并以bufferA-150 试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则可控制溶离的进行。 注意系统的摆设要适当，不要装置于交通要冲。

2. 依预估量取出Sephacryl 胶体，注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡；将瓶中的胶体上下震荡，使的完全悬浮，但勿产生太多气泡。

3. 在管柱内加入约10 cm 高缓冲液，然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱，一直加到管柱顶端，开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时，可于顶端添加胶体，以达所要高度；胶体高度约90 cm。

4. 胶体完全沈降后，小心以buffer A-150 加满管柱，关闭出口，装上顶端端盖并连通缓冲液瓶，打开出口以重力流洗。 调整缓冲液瓶高度，使流速约每五~六秒一滴，并设定收集体积为2.5 mL/tube。

5. 胶柱流洗约100 mL 后，关闭出口，拆开顶端端盖，先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1 cm 高，注意勿破坏胶体表面平整； 然后打开出口，使液面下降至胶体面，再关闭出口，准备注入样本。

四、样本色析进行

1. 以微量移液器或滴管吸取样本 （样本体积不得超过胶体总体积的3%），沿着胶体上方管壁缓慢加入，注意切勿破坏胶体的平整表面。

2. 打开出口，同时开启部分收集器；当样本完全没入胶体时，关闭出口，缓缓加入与样本相等体积的buffer A-150，打开出口待其慢慢进入胶体中，如此重复二次。不得扰动胶体表面，造成凹陷。

3. 暂时关闭出口，将液面高度加满至管柱顶端，并把顶端端盖锁上；然后打开出口开始溶离，调整缓冲液瓶的高度，使流速为6 s 一滴。

4. 要留心观察前面几个分划，确定整个系统运转无碍，小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜，收集约80 管。
10） 收集试管，进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定，并请作图。

5. 收集GUS 活性区，以Centriprep-30 浓缩至10 mL 后，加buffer A-0 稀释至20 mL，保留100 μL。

6. 管柱请再以buffer A-150 流洗100 mL 后，小心放置一旁，准备以后进行分子量测定。

五、分子量测定

1. 进行分子量测定前一天，请先以buffer A-150 流洗100 mL，并检查胶柱内有无气泡产生，若有严重的气泡或干裂，必须重新装填管柱。

2. 取标准分子量溶液0.4 mL,加上纯质目标酶0.5 mL （以亲和层析法所得的AF 部份），如上法注入管柱中，立刻开始进行胶体过滤，并收集各分划。请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。

3. 收集所得，进行蛋白质定量分析，可定出数个蛋白质尖峰，以作为分子量依据；另以目测法，决定红色高峰的管数，则可定出vitamin B12的溶离管数。利用以上数据，可画出分子量与溶离管数间的直线关系，作为分子量判定的标准校正线。

4. 同样的一批分划，请进行酶活性分析 （GUS），则可定出酶的溶离体积，对照上述标准校正线，则可求出酶的分子量。

六、拆除管柱及保存胶体
1. 若管柱长期不用，应当自管柱中取出胶体，以缓冲液清洗后，置冷藏室中保存，但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧，有时可能不易取出，要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。

2. 胶体可以加0.01% NaN3防止霉菌生长，但使用前记得要洗去；再度使用时，请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒，若有结块而不易打散者，也不要使用。