离子交换层析平衡体积不足

A. 离子交换层析分离提纯一种酶 未测出酶活的可能原因

1.高盐浓度可能导致酶出现盐析或变性
2.如果是比色法测酶活，可能是酶量较少，可以测下蛋白质含量

B. 离子交换层析的具体操作

对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。 加样：
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%。 已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：
C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1=A2时为线性梯度，当A1>A2时为凹形梯度，A1>A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：
①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤。
②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。
③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用0.002%氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些产品建议用0.02%叠氮钠。

C. 离子交换层析法分离纯化蛋白质有哪些局限性

1. 因为抄离子交换吸附蛋白质并不是特异性吸附，在某些情况下可能难以判断结合的蛋白质是否为当初设计的目的蛋白。

2. 离子交换吸附依赖于蛋白质表面的静电荷，如果蛋白质结构比较特殊，可能会有在各种pH都难以结合上离子交换层析的情况。

3. 离子交换层析对于等电点与目标蛋白接近的杂蛋白并没有很好的分离效果。

D. 请教：如何提高离子交换层析的分离度

离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。当pH较低时，负电基团被中和

E. 请教离子交换层析与亲和层析方面的问题

亲和层析是通过层析介质表面键合的配基与目标物质特异性吸附，然后非目标物流穿，再改变流动相是目标物质的特异性吸附消失，从而达到纯化目的。凝胶层析是通过层析介质孔径的设定，使分子量大小相差比较大的物质通过的路径不一样，从而达到分离效果。离子交换是通过层析介质表面的带电荷的基团与目标之间产生吸附，通过改变盐浓度使吸附力的大小改变，从而使不同的物质解吸的速度不一样，达到分离的效果。离子交换又分阴离子交换和阳离子交换。一般来说以上三种，离子交换应用面最广，亲和特异性最好，体积排阻的话只能对分子量差距很明显的物质进行分离。

F. 离子交换层析为什么在低离子强度下进行

离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是版由蛋白质多肽中带电权氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。当pH较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多; 在pH较高时，蛋白质的电性与低pH时相反。当蛋白质所处的pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的pH称为等电点。离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如DEAE-纤维素树脂;反之称为阳离子交换剂，如CM-纤维素树脂。不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此，可通过增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，便可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。

G. 在亲和层析时,为什么床体积比较小为什么无亲和力的物质往往只能产生一个层析峰

亲和层析利用的是目的物与固定相配基之间的亲和进行分离。如金属与蛋白相互作用，抗原抗体相互作用等。由于亲和层析吸附的只是目的物，与其他非特异的吸附填料如离子交换，疏水之类的比起来同等体积同等载量的胶，吸附的目的蛋白要比非特异的吸附填料要多。所以使用的体积要少一些。
而且相对来说，亲和层析填料的价格会比较高。。。
无亲和力的物质往往是不能与配基结合，在流穿峰里就出来了。
但事实上很难做到完全没有非特异性吸附。

H. 离子交换层析循环上样比不循环时吸附少

只能说你的样品中的杂质与树脂的结合能力比你的目的蛋白强，当你再次上样时，杂质取代了已经吸附上去的蛋白，从而造成树脂吸附量下降。

I. 离子交换层析的洗脱速度与床体积有关吗

离子交换设备运行的流速问题,从两个方面分析,一是只要管径与床层体积配套。二是压力与流量能满足设备的设计参数,就不会有应何问题…。一杰水质

J. 请用最简短的语言描述一下，离子交换层析的全部操作步骤。每个步骤用一两句话概括，不要写得太繁琐

平衡：用低盐的buffer平衡柱子。
上样：蛋白流过柱子。
淋洗：用上面同样的buffer淋洗几个柱体积。
洗脱：buffer中盐浓度递增，在某一个盐浓度处蛋白会被洗脱。收集样品。