超滤浓缩液用PBS吹打

❶ 想请教用过Trizol法提取RNA，且结果比较理想的详细步骤及注意事项，是否可以共享一下，谢谢

我这边刚好在做，给你说下：
贴壁细胞的话去培养液，PBS洗一遍，加Trizol吹打下来。组织的话，在液氮里面捣碎，然后粉末放进Trizol,用超声粉碎器粉碎（超声每3秒，停10秒冷却，直到看不见组织碎末）。
（此步骤可以-80oC冻存，下面可以以后再做）
每1毫升Trizol加200微升氯仿（氯仿需饱和，可以在氯仿加一两公分高的水层，摇晃后静置分层，用时到下层取氯仿）
使出吃奶的劲把Trizol氯仿混合液摇成浑浊的乳液，每个样起码狂摇30秒（用手拿着，不能用漩涡混匀器）
静置3分钟，分层，进4度离心机，14000转15-30分钟。
取上层无色清澈液体，进新管。枪尖绝对不能贴壁，绝对不能碰触到极薄的乳白固态中间层，绝对不能吸到下层的红色液体。假定是1毫升Trizol200微升氯仿的量，你这里取个400-500微升就可以偷笑了，千万别贪心，造成污染。
加相等体积异丙醇，倒置数次混匀，不用太激烈。
（次步骤又可以-80oC冻存，下面可以以后再做）
进4度离心机，14000转10分钟，这个时候可以看见小沉淀物了，白色，看不见的话，产量就悲剧了。。。
弃上清，用1毫升75%酒精洗两次（加酒精，手摇看到沉淀物游来游去就可以了，然后离心弃上清）酒精尽量吸干净，但枪尖不要碰到沉淀物。
盖子打开，在通风橱里面晾干（一般5-10分钟。看到沉淀物从白色变半透明就赶快停了，干过头了等下难以溶解）
加干净的水（没有核酸酶的，你懂的）10-50微升依你产量而定啦。55oC水浴5-10分钟充分溶解。
大功告成，可以测浓度和各项指标，分装，冻存了。

如果需要用DNAse去DNA，加在异丙醇步骤前即可。

❷ 纯化的单克隆抗体，超滤浓缩的时候会把磷酸盐离心掉导致抗体的缓冲环境变成水吗

不会的。。。
超滤浓缩对于缓冲液成分不会有任何改变的，因为PBS中的磷酸根离子回也好答，氯离子也好，钠离子也好都是很小的离子，可以在溶液中自由扩散，不会因为超滤离心就被甩到下层滤液中去。
你可以做个简单的实验，取一定体积PBS溶液测一下pH值和电导率值，之后用超滤管去离心。取出上层未被滤完的溶液再测一下pH值和电导率值，会发现pH值和电导率值和之前测的是一样的。即可证明未被滤完的溶液还是PBS溶液，而不是水。

❸ 求助动物组织的DNA提取试剂盒

动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒

操作步骤：

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入休积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机
在室温下离心。

1. 样品的处理：
   a、细胞：取 1×10
   6-1×10
   7个悬浮培养细胞，12000rpm 离心 1min 收集细胞，贴壁细胞先用胰蛋白酶消化处
   理，再用预冷的 PBS 吹打成细胞悬液，然后 12000rpm 离心 1min 收集细胞，尽量除去上清，加 200ul 溶液 A，
   振荡至彻底混匀。
   b、组织：组织量不宜过大，一般不要超过 25mg，可以使用匀浆器匀浆，最好用液氮研磨成粉末状，再用
   预冷的 PBS 或无菌水充分悬浮，然后 12000rpm 离心 1min 收集细胞，尽量除去上清，加 200ul 溶液 A，振荡至
   彻底混匀。

2. 向悬浮液中加入 20ul 的 RNase A (10mg/ml)，55℃放置 15min。

3. 加入 20ul 的蛋白酶 K( 10mg /ml )，充分颠倒混匀，55℃水浴消化，细胞消化时间较短，组织消化时间较长，
   一般需要 1-3 个小时才能完成（鼠尾需要消化过夜）。消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。
   消化完全的指标是：液体清亮及粘稠。

4. 加入 200ul 体积溶液 B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可放置于 75℃ 15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的 DNA 量少及不纯，还有可能导致堵塞
   吸附柱。

5. 加入 200ul 无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响 DNA 的提取，可将溶液和絮状沉淀都
   加入吸附柱中。

6. 12000rpm 离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

7. 向吸附柱中加入 600ul 漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12000rpm 离心 1min，弃废液，将吸
   附柱放入收集管中。

8. 向吸附柱中加入 600ul 漂洗液，12000rpm 离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

9. 12000rpm 离心 2min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，
   否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR 等。

10. 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 50-200ul 经 65℃水浴预热的洗脱液，室温放置
    5min，12000rpm 离心 2min。

11. 可将离心所得洗脱液再加入吸附柱中，12000rpm 离心 2min，即可得到高质量的基因组 DNA。

注意事项:

1. 试剂盒拆封后，RNase A和蛋白酶K需放置-20℃保存。

2. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。

3. 如果试剂盒中的溶液出现沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影响效果。

4. 洗脱缓冲液的体积最好不少于50ul，体积过小会影响回收效率：洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要
   用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH 值低于7.0会降低洗脱效率。

❹ 超滤离心管怎么使用

蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用。
1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。
2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。
4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mg/ml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。
5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。
6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入MilliQ水到超滤管中，没过超滤膜，防止膜失水变干。
7、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。
8、倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将管芯浸入MilliQ水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用MilliQ水洗干净。
9、取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml
离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。

❺ 做MTT时用的三联液配方是SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml，没有异丁醇的话，用异丙醇行吗急！！！

应该明确实验前

1。选择适当浓度的细胞接种。的内贴壁细胞的96孔培养板中，在正常情况下，包括约105个细胞。但由于该地区有很大的不同，在不同的细胞附着在MTT法，预实验检测其贴壁率，倍增时间以及种子细胞的生长曲线的条件下，确定测试孔接种细胞数和温育时间，为了确保列车终止诱导的细胞过满。因此，在为了保证MTT晶体形成的细胞数成比例呈线性关系。否则，细胞的数目的敏感性降低太多，太少没有观察到差异。
2。集合中的药物浓度。请务必看到更多的文献，参考其他人的结果，然后给出一个比较大的范围内的第一次筛选。根据自己的筛选狭窄的浓度和时间范围再细筛的结果。记住！否则，可能会使用的时间和浓度的药物的有效浓度和时间。

3。设置的时间点。 OD值吗？在不同的时间点，输入Excel工作表中，并最终在不同时间点的抑制率变化的测量，绘制图形的变化，当曲线变得平坦（高原）的时间点，应使用最好时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制最明显的表现）。

4。孵化时间。 200UL 10 4-5电源增殖细胞的培养液中是难以维持68H，营养不足，细胞增殖阶段逐渐趋向G0期往往仍影响的结果，我们在48小时介质中被改变了。

5.MTT法只能测定相对细胞数和相对活力，不能绝对数量测定细胞。做MTT，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值增加。

6。理论未必全是。要根据自己的实际情况进行调整。

实验对照孔加药孔孔应设置为零。零孔加培养基，MTT，二甲亚砜。控制井和计量孔必须加细胞培养基中，MTT法，二甲亚砜，和不同的是添??加到媒体控制井，而溶解该药物中加入不同浓度的药物的给药组。

8。避免血清干涉。含15％FBS培养基中培养的细胞中时，高血清物质会影响试验井的光吸收值。将测试的灵敏度测试增加背景。因此，它通常是优选的是小于10％胎牛血清的培养液中。着色后，尽量吸净培养孔残余的培养基。

实验步骤

贴壁细胞：

1。上收集的细胞数，调整浓度的细胞悬浮液加入到每个孔100ul铺板所测试的细胞调节至密度为1000-10000孔（边缘？孔填充用无菌PBS中）。

2.5％CO2，37℃孵育，直到细胞单层覆盖的底部的孔（96 - 孔平底板），添加药物的浓度梯度，在原则上，细胞的粘附给药或两小时或半天的时间，但我们常在前一天下午铺板第二天早上剂量。一般为5-7梯度，每孔品100μl，位于3-5井。建议设5，否则难以体现

3.5％的CO2，并在37°C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察到的真实情况。

4。添加到每个的阱20ulMTT溶液（5mg/mL的，或0.5％的MTT），并培养4小时。用MTT反应的药物可以先离心丢弃培养基，用PBS仔细洗涤2-3次，然后添加到培养基中含有的MTT。

5。终止的文化，并认真吸收孔培养基。

6每孔加入150ul二甲亚砜，设置振动筛在低速振荡10分钟的晶体完全溶解。在OD490nm的酶联免疫吸附检测器测量的每个孔的吸光值。

7。同时置零孔（培养基，MTT，二甲亚砜），对照孔（细胞，相同浓度的药物溶出介质，培养基，MTT法，二甲亚砜）

悬浮细胞：

1）收集对数生长期细胞，调节细胞悬液浓度为1×106互补序列①1640（无血清）介质40ul;②加放线菌素D（有毒）10UL稀释培养基升的？克/毫升，需要预先测试，以找到最佳稀释,1:10-1：20）;③需要检测对象10UL;④细胞悬浮液50μl（即，5×104cell /孔）的100ul加入96 - 孔板（边缘？孔填充用无菌水）。建立控制每块板（加100（原液100 1640）。
2）在37℃，5％CO2孵育16-48小时，并在倒置显微镜下观察。

3）每孔加入10微升MTT溶液（5毫克/毫升，或0.5％的MTT），并培养4 h。 （悬浮细胞推荐WST-1，培养4小时后可以直接跳到步骤4），直接酶联免疫吸附测定的OD570nm 630nm的校准测量每孔的吸光度值）

4）离心（ 1000转x10min）仔细吸掉上清液，每孔加入100微升二甲亚砜中，设置摇动器在低速振荡10分钟，完全溶解的结晶。在酶联免疫吸附测定OD570nm（630nm的校准）测量的吸光度值？为每个孔。

5）设置零孔（培养基，MTT，二甲基亚砜）对照孔（细胞，相同浓度的药物溶出介质中，在培养基中，MTT法，二甲亚砜），每个设置的3个井。

MTT准备

MTT通常情况下，最好使用4℃避光过滤器后两周内，或配制成20,10,5保存在 - 20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量包装，用黑袋或黑纸，铝箔及包装暗，避免分解。我一般都把MTT粉包装EP管，现有的服务直接添加到培养板，不需要一下子有这么多的，特别是当它绝对MTT变为灰绿色不能重复使用。

MTT致癌性，使用时要小心的那种透明薄膜手套的最佳条件。被称为MTT需要无菌，MTT细菌，是非常敏感的;到96孔板一个PBS 黑暗中额外的时间并不重要，毕竟，时间是短暂的，你不用担心时，你可以把关了灯手术台。

制备MTT;溶解，还配备用盐水在60℃水浴中进行增溶。

PBS配方：

氯化钠8克

KCL0.2克

磷酸氢二钠1.44克

> KH2PO40.24克

调pH值7.4

给定容量1L

细胞接种（平台）

细胞30代不要使用，因为状态并不好，培养板中使用一个很好的（最好是进口板），坏板或重复使用的板仅做预实验。

最佳接种密度计算出来的按照预实验接种后，细胞生长抑制率（或增值率），因为关于OD值吗？细胞密度10000/ml的测量时间间隔呈直线关系最好的，最可靠的结果。如果店铺是太稀细胞的杀伤不会很明显，可能都过于密集的细胞凋亡，细胞生长速度过快的营养是不够的，最后导致死亡。过密或过少的细胞，细胞增殖将是过快或过慢，差线性关系，其增值率。因此，MTT细胞的密度使用更10000/ml的，100ul /孔。

细胞密度的特点，不同的细胞，如果细胞刺激作用的药物，那么细胞浓度为小点，如果你这样做对细胞有抑制作用的药物，然后取更大一点细胞浓度，因此，与对照的差异，该数据是更好。悬浮细胞的各孔中的细胞数达到105，贴壁细胞103-104。

其他的声音：

第一个单元格播种密度不能太一般每孔1000就足够了，我想，宁少勿多。特别是对肿瘤细胞。 10000 /孔是太高，所以，即使药物，MTT法不能表达的最佳点板浓度在4000-5000 /孔，太少的SD值。

2.MTT本身是一个相当厚的实验约10％，增殖率的波动也就不足为奇了。特别是新手，有20％的波动也是常见的，因此它可能是由于技术原因，特别是种板技术必须过关的。

我MTT法检测肿瘤细胞，这些细胞长一开始我100000/ML浓度的疫苗接种，结果细胞长的太满，结果梯度也没有线性关系。调整后的浓度使用了40000?80000/ML浓度MTT法，做的好点的是60000?70000/ML组的浓度。 40000 / M的基团的浓度，是因为这些细胞是以下，药物作用或只是没有一个有良好的线性关系的梯度，根据细胞生长速度，以及药物的特性（的时间依赖关系，并的浓度依赖性的药物），以确定培养的时间是48小时或72小时。

一定要注意避免细胞的细胞悬液混合沉淀下来，在每个孔中的细胞数的范围，收到了一些必要再混合均匀。移液管操作要熟练，避免人为错误。虽然更准确比移液管移液管，但如果操作不熟悉，CV将在8％左右。此外，吹了太多的时间，也影响细胞活力。因此，熟练的鞋，尽快在黑板上。

让我谈谈我的一点经验：

1。狗新花样不能太多悬挂的总的3-4倍，吸液管液量可能会比较容易混合。 10毫升优选地安装的悬浮液中3?4毫升：该悬浮液的离心管太少容易吹气泡，悬浮液的特定也是不容易被风吹到单细胞悬浮液。 。 。

移液管移液管最好在1毫升左右：吸入过量的液体，看起来液管余下的数，如吹打容易起泡吸管吸了很多量过小，强度移液是不够的，将移液不均匀。如果吸液量1毫升稻草，总液量，在约5ml的好处

吸气时，悬挂在底部，然后抬起，但吹了下来，不留液体的表面，否则容易一拳砸的气泡。

4。狗新花样，你可以数100吹打均匀（前约30-50倍的吹打加细胞基本上差不多均匀。加细胞分别接种2孔反复移液管移液3次3次后，他们把他们的枪挂在5秒内的细胞悬液，然后划出一定的速度悬浮液）。

用吸头，每孔加入到细胞中不要太猛了，否则你会发现细胞在想要添加的移液管尖中的孔的底部的势头由于收集了一堆，一般在这种不均匀的分散液接触抑制周围的孔的底部的中心，影响细胞的生长。因此，速度不能太快，也不能太慢。我习惯了增加每块板水平握手后，左一个右其次，移动的答复中，细胞可以均匀地分散这些。 （铺板技术是MTT法的关键，也是基础，我们必须练好，一旦学生振荡器和混合与旋涡细胞，最后一个单元格都死了，使用这种方法是不建议混合细胞
BR />加入MTT

个人认为MTT最关键的是你的手机号码和MTT适当的比例补充说，真正起作用的，和具体的细胞数量之间的关系和真正的工作真的不好确定，我认为MTT支付超过最低量好一些

MTT各种报告的MTT，一般是过度10UL不够的，如果你不使用96孔板， MTT按照10％的比例超过100ul培养基地。，加入MTT振荡让MTT和媒介组合，但这个应该不大。

有个别的孔，如立即加入MTT变蓝黑色，污染的可能性是很大的，另一个在前面的MTT摊薄细胞仍然需要适当的方法来过滤消毒。可以加MTT前显微镜下才能看到，如果有一个孔染菌，染菌孔附近往往是 />
血清白蛋白对大多数的药物的组合的效果，它是可能的分开的药物和MTT一起看到的将反应MTT法不能反应，不必除去水培的含有药物的溶液，直接加。

上层清液

争：

1加DMSO液体吸掉，但培养液，紫色晶体吸收之前，该第一的平板离心机，2000转，5分钟，然后吸掉上清液（如果是悬浮细胞，此方法建议在2500rpm 10分钟离心分离的悬浮细胞，并做MTT的最好的圆底96孔板中的96 - 孔板，注意不要结晶颗粒吸掉上层清液后，建议每孔吸出150-160ul）

2。每次我都会MTT和孵育4小时，然后离心1000G 5分钟枪小心吸去上清液，或将一小部分蓝水晶吸出，所以还是建议翻转颠倒了！

另外，我们可以直接在板翻转颠倒（垫层滤纸）2-3倍的方式“吸”是不容易使细胞脱离出来。轻拍，或倾斜一点帮助吸液管，紫色晶体几乎没有可见的列，但你自己的细胞贴壁的前提下，比较监狱，半贴壁生长的细胞容易脱落。药物作用时间长，阴性对照组的细胞可能是由于过多离开MTT加入后形成的结晶漂起来，所以不能直接排放

MTT，这一步必须小心，不要使用贴在墙上倒立的方式，因为是不强大的单元格将被倒掉，从而影响OD值吗？悬浮细胞，不拍打上清液。 ，离心后，不拍打这种方法杀了人。

5。加入MTT反应完成后3-4h后，在96孔板的作用是从孵化器中删除要轻柔，避免振荡结晶，它溜了。您可以尝试在96孔板倾斜30度角，然后的枪口慢慢吸一些细胞排球吸，有些人会用移液器吸头吸病人，枪口下的强度和方向，以确保每个孔是不要让吸头接触到孔??底，一次后倾斜孔板，不反复倾斜的平直，这样也会使晶体脱落。

6。移液与医用注射器登上教训针对角线的经验教训沿着培养基MTT的墙壁，好像我1毫升针小心地吸可靠的比其他的方法，一般不吸紫色晶体。

避免上层清液和改进的方法

一般容易发现，即使贴壁细胞在96孔板离心式离心机，的MTT溶解在DMSO，结果是没有好，不能得到预期的结果重复性差。

解决方法1：以下文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT法，中国期刊的药品，1993,24（10）:455-457 BR />
具体方法如下：

三溶解液：10％SDS，溶于蒸馏水中，5％异0.012mol/LHCL的。

三联溶解解决方案：SDS10g，异丁醇5毫升的10M盐酸0.1毫升双蒸水溶解配成100mL溶液

操作：细胞悬浮在培养板中，加一定密度的解决方案，90ul /孔;管理，然后（悬浮细胞）在同一时间或4h后（贴壁细胞）通过加入不同浓度的药物10UL /空穴，位于三井。另外，每块板另一个没有零孔（仅添加到培养基中，无细胞和药物）培养2d后加入MTT溶液20ul /孔，和文化继续4小时，然后加入上述的三重液体品100μl/孔，在37℃静置过夜，用酶测定的标准仪器孔A570值？

优点：简化操作，提高了可靠性。

解决方法2：日本同事有一个新的试剂CCK-8试剂，CCK -8试剂可用于简单和准确的细胞的增殖和毒性分析其基本原理是：含有的试剂WST-8 [化学名称：2 - （2 - 甲氧基 - 4 - 硝基苯基） - 3 - （4 - 硝基苯基）-5 - （2,4 - 二磺酸苯基）-2H-四唑单钠盐]，这在电子载体1 - 甲氧基-5 - 甲基硫酸盐吩嗪二甲基（1 - 甲氧基PMS）线粒体脱氢酶的作用降低的高度水溶性的黄色染料（甲臜染料）A的产生与活细胞的数目的数目成正比，所以此功能可以用于直接的细胞增殖和毒性分析CCK-8试剂已预先装入的细胞增殖和毒性分析所需的组件，未经稀释，然后缓冲区或中等，没有任何放射性同位素和有机溶剂的CCK-8试剂。因此，没有特别的技能，你可以让每一个用户准确，可重复的实验结果。

★优势 / a>
1，简单的一个步骤的结果

2，节省时间，不需要预制开放

3，安全没有必要放射性同位素，有机溶剂
>
4，迅速消除溶解除沉操作

5，高灵敏度，灵敏度比MTT

6，重复性几个不错的步骤，无损，准确

是比较昂贵的，如果充分的资金，这是件好事。

★细胞增殖实验使用：

1，接种细胞悬液100μL96孔板，预先放置在37℃，在5％CO 2培养箱培养。

2在每个孔中引入CCK-8试剂10μl的。

培养板在孵化器1-4个小时。

4，测定吸光度在450nm波长为600nm或600nm的波长参考。

解决方法3：使用MTS / a>
解决方案4：

加入DMSO

放弃孔内液体，最好不要更换相同数量的实验DMSO加入DMSO清洁，直接加入到DMSO首先，除去上清液，沉淀将难溶于培养基颜色检测测量时，将影响最终的结果，但前提是不能使细胞与吸掉，因为错误是远大于培养基中没有放弃一个干净的错误，所以，以确保细胞的前提下，尽可能不虹??吸的培养液虹吸如果培养溶液不是一次性清洁空白孔应留下的培养液相同量的，所以检测时的培养液的影响，可以除去尽可能多的DMSO的量为100ul或150ul

1。添加的DMSO后使用振荡器轻轻振摇5 - 10分钟时间控制密切越好，放置时间长了会影响结果，该值将过大，其结果是不可靠的。
2。后加入DMSO排球反复抽吸溶，尽快解散后检测。实验孔是小的，它建议，这种方法，因为其更好的效果比振荡溶解。

3，或者在37度把培养箱中培养15分钟，溶解结晶

振荡，让甲溶解，以便更好地测量的吸光度振荡96孔板具体地说，振荡器，目的：凿孔泡沫。气泡的存在下，由于其光的反射和折射效果（原则读者是通过特定波长的测量样品中的特定物质样品的吸光度推测）的浓度，会导致结果抵消了测定OD值吗？

至于测定给出的波长是不同的颜色溶液，DMSO，溶解紫（红）色，490nm处的最大吸收值，而在ATCC的MTT试剂盒使用的是不DMSO，它的测定波长为570（在ELISA实验，OPD为底物测得的波长为492，选择的TMB底物溶液是450）; SDS和酸化异丙醇选择570nm的，并建议作为参照波长等于655nm。

DMSO溶解经过10分钟内测，越放颜色越深，SDS溶解液测定吸光值，其值在三天内保持不变。

细胞密度太大测定吸光度细胞密度过大，吸光率也小;另一个细胞状态的关系，细胞状态不好的吸光度值低;少量的细胞，或短的时间内培养的OD值会比较低。每个洞之间的差异尤为明显说明可能存在的污染，空白孔的OD值过高，很可能是细菌的污染。

井直接OD值差别一般应在0.1-0.15不同的考虑：1。种子细胞不统一或疫苗接种时，应保证每一个孔一般为1000-10000元以及细胞细胞计数，加入细胞悬液培养基中定容，轻轻吹打几次，使细胞均匀分布的，因此，这是更好的不是直接加入预定体积的细胞悬浮液，接种疫苗应加入含有血清的介质2。粘附时间:18-24小时，如果没有，而不是悬浮细胞可虹吸
/>一般，为了实验的精度，和各浓度可提供5-6井可以最终的统计，可以除去的最大值和最小值，或荒谬的值？其特征在于，所述数据被除去，这些离谱数字细胞污染，是否在培养过程中细胞的死亡，文化，蒸发过度的附加组件的MTT溶液是不准确的，在5％二氧化碳培养箱中培养，在37°C，无论是时间常数（1-4小时）有密切的关系，当然的OD值的测定仪器状态是正常的，是非常重要的！（一般热身20分钟）。

MTT吸光度误差在0.2至0.8之间。分析化学相关的兰伯特Beer定律，朗伯 - 比尔定律骨密度分析偏差，通常在标准曲线的情况下是不是线性的，尤其是吸光物质的浓度较高时，可以清楚地看出通过原点到浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲）情况称为朗伯 - 比尔定律的偏离定量的曲线的弯曲部，将产生较大的误差。骨密度分析仪测量不准确的误差的主要来源。光度计具有一定程度的测量误差。这些错误可以是来自于光源不稳定，变化的实验条件下偶然不准确的读数。

光度计透射的标尺刻度是均匀的。吸光度标尺刻度不均匀。波动对传动比一定值时，读出的相同的工具;吸光度读数波动不再是一个固定的值。吸收更大的错误读数波动而引起的透光率或大或小，浓度测量误差大，更大的吸光度，最好的光度当选的吸光度读数不下降在中间规模的要被测量的透射率T在15％至65％的范围内的溶液，或在两端时的吸光度，A是在0.2?0.8之间，为了确保较小的相对误差的甲= 0.434（或透射比T = 36.8％），最小相对误差的测量。

其他的声音：

最好的570nm波长过滤器，MTT吸光度测量。在此波长的峰值，在其他词语具有大致490nm处与其他波长的高灵敏度，但我的经验的灵敏度降低了一半。
2 BIO-TEK，我们使用ELx800，一般值2是可靠的，如果该值是要考虑它是否是一个错误在实验过程中，我已经看到了花园的一些职位OD值可能与活细胞数在0.2-1.2范围内具有良好的线性关系，复孔太大的区别，但OD值在0.3-0.9范围内的好，如果你的OD值？此范围之外的，做实验，细胞计数可能不适合，你应该调整细胞的数量。边缘效应
/>

孔一般只有空白，非培养细胞，或这四条线中的数据将是高或低的由圆圈包围的96孔板，96孔板的培养箱中因为缺乏湿度，和孵化器具有一定的温度，由于温度梯度，使得边缘的孔蒸发更快，导致的各个组成部分中的培养基中的浓度增加，导致这种现象的不同的细胞状态，它是必要的，以保证湿度的培养箱中，并以降低的频率和持续时间的开关培养箱。方法：所有周围的圆形孔的孔板，“否”，的影响是非常大的，最外面的圆必须添加水，PBS或培养液中，只要你能防止水分蒸发。

如何计算的IC50后的寇方法：

（1）lgIC50 = XM-I（P- （3-PM-PN）/ 4）

XM：LG的最大剂量

I：LG（最大剂量/相邻剂量）

P ：正反应速率和

PM：最大的阳性率

PN：最小阳性率

例如：各组浓度0.1,0.01， 0.001,0.0001,0.00001,0.000001，稀释10倍，与最大浓度为0.1的抑制率分别为0.95，0.80，0.65,0.43,0.21,0.06到

计算公式：
PM =在
Pn的0.95
= 0.06

P = 0.95 +0.80 +0.65 +0.43 +0.21 +0.06 = 3.1

XM = lg0.1 = -1

LGI = lg0.1/0.01 = 1

lgIC50 = -1-1 *（3.1-（3-0.95- 0.06）/ 4）= -3.6025

IC50 = 0.00025

（2）Bliss法：自己的检查书

（3）IC50计算软件，请参阅下文附件

（4），使用EXCEL趋势线寻求IC50约LD50的方法与此类似！

（5）网上寻求IC50或EC50： HREF =“htt??p://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm”目标=“_blank”> http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat / JavaStat-j.htm

结果统计

数值应用SPSS软件进行方差分析，P <0.05显著差异（P <0.01）的差异是非常显著的时间为横轴，吸光度值上的垂直轴绘制以x±s行细胞生物学，具体评价式IC50的细胞死亡的抑制率％= OD控制基团-OD实验组/ OD控制组

可以做excel表格两两比较，T-测试，你可以参考你的数据应该是指多个样本T检验，方差分析软件SPSS或SAS。
/>口复用：

板使用一个很好的（最好是进口板），坏板或重用板仅做预实验。一般贴壁细胞生长的重用培养板效果不是很好，因为培养板表面涂了一层的贴壁细胞的物质，在生产，可能会失去清洁后悬挂或半悬浮培养细胞的生长也建议不要使用太多次，甚至进口的板子，次数不超过3次，最终测量值的1/3，什么最好的价值。

板块强烈建议不要重复使用：泡沫酸，但泡完酸板是非常有利于细胞的生长，会有不良帖子壁，细胞生长缓慢，等.2，非常彻底的消毒有关的董事会，如果存在的话，那么运行的风险.3重复使用洗板。不干净，在训练过程中容易出现杂质

再利用的做法：

洗涤2％的NaOH浸泡4小时，然后浸泡4小时1％盐酸，水为15倍，用蒸馏水洗涤三次，干燥，UV照射过夜（UV多于两个小时消毒罐）

实践：

气泡酸2-4小时，老师让我们做了四个多小时（普通玻璃仪器过夜）。捞出，冲洗，干燥，紫外线照射过夜。估计收集在一起与其他钴60辐照灭菌。
/>做法：

做MTT用水和清洁剂的水冲洗板，然后用洗衣粉水（注意最好让清洁剂的第一打开）几个小时。，冲洗

❻ 请教细胞培养用的PBS浓度

好养贴壁细胞的，请问应该用什么浓度的胶原
解决方案如下：
1.如果你手上这支细胞已经传代次数很多的话,建议复苏一支新的细胞,这是最直接的方法
2.检查培养基、胰酶、pbs中是否有污染
3.如果只有手头上的细胞,那么检测一下是否有支原体或者病毒感染,黑胶虫实际是一种细胞残留的胶质成分并不是一种污染源但是视野中会有黑色点状物好像悬浮细胞但略小,注意区别
4.贴壁不佳可以在传代或复苏前选用包被液包被培养瓶,增加细胞贴壁性,一般用多聚赖氨酸包被,效果很好,可以一试
5.有时候细胞分裂是贴壁-悬浮-分裂-再贴壁的一个过程,悬浮细胞不一定都是死细胞,可能是正在分裂的细胞,一般来说贴壁好的细胞换液一次总会有大概5-15%再次悬浮,少量的话不必过分担心
补充你的问题：观察消化时间是以你的细胞在加入胰酶后变圆开始到细胞间连接消失细胞脱落为消化完成,消化时间过短镜下观察可能会有贴壁残留,消化过久会损伤细胞导致状态不佳,建议两步法消化,效率比较高,吹打以吹散细胞为目的不必太过用力,其实吹打对细胞的损伤相比胰酶是很小的,稍加注意即可

❼ 293T人胚肾细胞能用1640培养基培养吗

293T细胞的培养 ： 293T细胞是由293 细胞派生, 表达SV40 大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。 293T 为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。 培养条件为: 完全培养基: 高糖 DMEM, 10% 胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。 传代方法为: 1．吸掉293T 细胞培养瓶内的培养液; 2．吸取适量的无Ca2+ 和Mg2+ 的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍; 3．加少量的0.05% 胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2 的培养瓶加1 ml, 75 cm2 的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s; 4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液; 5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。 6、传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。有些同学反映293T 细胞容易结团不易被吹打开来。如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml 移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 7、加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。一般293T 细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90% 融合, 再以1∶4~1∶8 的比率传代。合适的传代周期为2~3 天。 8、传代过程中, 消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。 完成传代后放入培养箱前： 应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。冷冻293T 细胞的冻存液可以用95% 小牛血清加5% 二甲基亚砜, 复苏率很高。 293T细胞的生长状态直接关系到包装病毒和转染的效率, 应尽量选择传代次数少, 培养总时间短的细胞。从细胞形态上看, 相差显微镜下观察立体感强并且形态良好的细胞产病毒率或者转染效率都很高。 虽然293T细胞的应用非常广泛, 几乎每个实验室都有一株自己的293T 细胞株, 但是经常有同学提出: 为什么在正常的培养条件下, 细胞却很难传代下去, 包装病毒效率很低, 对转染效率也不满意呢？ 事实上, 引起类似问题的元凶是一种生物界最小的原核细胞生物－支原体。支原体污染后, 它们不会使细胞死亡而是与细胞长期共存, 培养基不发生浑浊, 细胞无明显变化, 外观上给人以正常感觉, 但事实上细胞正在受到到多方面影响, 如引起细胞变形, 影响DNA 合成, 抑制细胞生长等。我们曾经收集到四株分别来自四个不同实验室的293T 细胞, 经检测均为支原体阳性, 令人惊讶的是这四株细胞都已经不是典型的293T 细胞形态, 每两株之间比较竟然形状各不相同, 很难相信这是同一种细胞！这些支原体阳性细胞普遍传代周期长, 显微镜下观察细胞碎片多, 长期支原体感染已经使这些细胞羸弱不堪, 胞内DNA 和蛋白质合成受到严重的影响。 因此, 有效地防治支原体污染, 杜绝交叉感染对提高实验效率, 稳定实验结果至关重要。我们的经验是把防治支原体污染作为细胞培养的一项日常工作, 除了对细胞培养设备环境的清洁外, 还需在器材消毒, 操作员培训, 严格把关新引入细胞株的质量等方面做大量细致的工作

❽ 抗体透析时夹透析袋的夹子开了，抗体进入了5mM PBS透析液中怎么办如何从透析液中提取抗体呢

这个基本没有办来法。
你透析源液多在体积？如果体积小一点的话。你先把透析液分装一下。－20冻起来.留下一小部分用于你的实验看一看。如果行的话就这样用。如果浓度太低，那就没办法。
当然，你也可以试着用A蛋白纯化柱或者G蛋白纯化柱试着回收，但一个这种柱子太贵，另一个，能否回收得到还是个问题。

❾ 牛血清白蛋白的提取和鉴定方法(设计性实验报告)

牛血清白蛋白的提取操作步骤：

1、盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（2000r/min）10min，将上清液倾入试管中。

2、取干净的比色板，在各孔内滴加一滴纳氏试剂 

3、取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。

4、每隔2分钟检查一次，更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化并记录，直至袋内盐分透析完毕。

5、将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。

牛血清白蛋白的鉴定方法：

1、点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处做点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。标准液点一次，待测液点三次。

2、电泳将点样后的膜条致于电泳槽架上，放置时膜条无光泽面向下，点样端致于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将模条取出。

3、 染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟后取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液1、2、3中各漂洗5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。

4、鉴定比较样品和待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。

(9)超滤浓缩液用PBS吹打扩展阅读：

牛血清白蛋白

牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/1000ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。

血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 Da，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。

❿ 超滤离心管怎么使用

蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号的、不同体积大小和超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用。
1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。
2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。
4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mg/ml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。
5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。
6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入MilliQ水到超滤管中，没过超滤膜，防止膜失水变干。
7、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。
8、倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将管芯浸入MilliQ水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用MilliQ水洗干净。
9、取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml
离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。