『壹』 在石蜡切片HE染色过程中，切片标本为什么要经过固定，脱水，包埋和染色等过程
首先，固定使标抄本中蛋白袭质等物质变性，在后期处理中，不会改变形态及性质；脱水：在用石蜡包埋使，如果标本中含有水，石蜡就不能浸入标本中，所以，脱水一方面是使下一步包埋石蜡浸入标本，另一方面是为了染色，水会使染色剂稀释或失色；包埋：在切片时，之所以标本能够切成薄薄的一片，就是标本中浸入了石蜡，有了与石蜡相似的性质，能够切成很薄的一片；染色是为了用显微镜观察标本，如不进行染色，在标本切成很薄的片后，在显微镜下是透明的，不能观察。
『贰』 石蜡切片免疫组化组织脱水透明可以用氯仿吗
光学显微标本的制作技术【实验目的】了解光学显微镜切片制作技术的基本方法步骤。【实验原理】采用光学显微镜研究一般生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察清楚的，多数动、植物材料都必须经过某种处理，将组织分离成单个细胞或薄片，光线才能通过细胞。为了适应这个需要，就产生了光学显微镜制片技术。光学显微镜的制片技术方法可分为两大类：一类是非切片法，另一类是切片法。非切片法，是用物理或化学的方法，使细胞彼此分离，如有分离法、涂布法、压碎法等。非切片法的操作比较简单，能保侍细胞的完整，但是细胞之间的正常位置往往被更动，无法反映细胞之间的正常联系。它可以与切片法配合使用，各取其长处。切片法，是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片（二）材料：洋葱根或小鼠肝（三）试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、鸡蛋、纱布、加拿大树胶、麝香草酚【方法与步骤】光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，18切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。这种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等，水和塑料也可作为包埋剂。根据包埋剂的不同，分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有长处，可以根据需要选用，但是使用得最多的还是石蜡切片技术。石蜡作为包埋剂，有其独特的优点，例如：石蜡能切出极薄的蜡片（2～10μm）；切片时能连成蜡带，便于制作连续切片；操作较容易，组织块可以包埋在石蜡中长期保存。然而石蜡切片的制作过程较长，步骤很多，一步不慎往往导致前功尽弃，而且这些处理引起组织块或多或少地收缩，切片时受湿度影响比较大，这些不足之处必须在制片过程中认真对待，尽量减小它的不良影响。石蜡切片的制作过程主要包括：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏等步骤。1．取材材料的好坏直接影响到切片的质量，无论取哪一种动植物材料，以下几点是必须注意的。（1）植物材料选择时须尽可能不损伤植物体或所需要的部分；动物材料取用时常对动物施以麻醉，常用的麻醉剂有氯仿和乙醚，或将动物杀死后迅速取出所需要的组织。（2）取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。（3）切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。（4）切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2。2．固定组织和细胞离开机体后，在一定时间内仍然延续着生命活动，会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映它生前的正常状态，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织和细胞，阻抑上述变化，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。这种处理就是固定。除了上述作用外，固定剂会使组织适当硬化以便于随后的处理，还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。固定剂的作用对象主要是蛋白质，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作时不加考虑，如要观察这些物质，可用特殊的方法将其固定下来。固定剂的作用表现在对材料体积的改变、硬化的程度、穿透的速度以及对染色的影响等方面。这些作用的好坏、大小，都依所固定的材料性质而定，同样一种固定液对某一材料来说是良好的，但对另外一些组织可能就不很适用。良好的固定剂必须具备的特征是：穿透组织的速度快。，能将细胞中的内含物凝固成不溶解物质，不使组织膨胀或收缩以保持原形，硬化组织的程度适中，增加细胞内含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存剂作用。固定剂有简单固定剂和混合固定剂的划分。简单固定剂即单一的固定剂，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有：Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等。固定剂的种类甚多，我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。19固定时，须注意以下几点：（1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的10～15倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液。（3）材料固定后如不立即下沉，可将其中气泡抽出。（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。（5）一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合。（6）固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。3．脱水生物组织中含有大量的水分，它和石蜡是不能相溶的，致使在包埋时石蜡无法渗入组织内部，因此须使用脱水剂将水分除尽，这就是脱水的作用。脱水剂必须能与水以任何比例相混合。脱水剂有两类：一类是非石蜡溶剂，如乙醇、丙酮等，脱水后必须再经过透明，才能透蜡包埋；另一类是兼石蜡溶剂，如正丁醇，脱水后即可直接透蜡。常用的脱水剂是乙醇，因为它价格便宜，易于得到。为了避免剧烈的扩散引起的组织的强烈收缩，脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般组织从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水；对于一些柔软的组织应从15％开始。脱水时间依据组织的类型和大小而定，一般各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。丙酮也是很好的脱水剂，其作用和用法与乙醇相同，不过其脱水力和收缩力都比乙醇强。甘油常用于藻类、菌类及柔弱材料的脱水。二氧六环为无色的石蜡溶剂，对组织没有收缩及硬化等不良后果，但其蒸气有毒，使用时须小心。正丁醇可与水及乙醇混合，亦为石蜡溶剂，其优点是很少引起组织块的收缩与变脆。叔丁醇的性质、作用和用法同于正丁醇，但因其价格昂贵而很少使用。4．透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。透明剂的种类很多，较常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，这样可减少上述的缺点。透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。20甲苯的一般性质与二甲苯相似。用法亦同，唯沸点较低，透明较慢，但不会使组织变脆。苯的用法同于二甲苯，对组织的收缩作用小，但须警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿适于大块组织的透明。5．透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在50～60℃之间，应根据材料本身的硬度、切片的厚薄和当时的气温条件来选用。一般动物材料最常用的石蜡熔点为52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的则用52～54℃的；室温10～19℃时选用52～54℃的石蜡可顺利切片，冬季可用熔点46～48℃的石蜡，夏季可选56～58℃的。石蜡的优劣与切片的成败密切相关。鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕，30～35℃放置24h且无气泡和不透明的晶状小点出现，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。这种石蜡即为品质优良。含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30min（注意别超过发火点），使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除灰尘等颗粒。透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。纯石蜡应处理2～3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15～30min。透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。具体做法是；先准备好纸盒（具体折法见图1-3及说明），将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶。以后切片时引起碎裂。6．切片（1）石蜡块的固着与整修在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修。固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘，这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片子。整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于在蜡带上识别切片。（2）切片机和切片刀切片机是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一张合乎厚度要求的切片。切片刀与切片的质量直接相关。切片前必须磨刀，方法是：将切片刀装上刀柄、刀背夹、滴少许石蜡油在平滑的磨刀石上，将刀贴着磨刀石以背向刀口方向磨，使用完毕后应及时用二甲苯将石蜡油擦净。（3）切片方法切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。（4）切片中存在的问题及补救方法石蜡切片是很不容易掌握的，有时很容易成功，有时则由于某种因素而造成切片的质量低劣，甚至完全失败。现将切片时经常遇到的一些缺点、可能的原因以及补救法列于表1-3。表1-3石蜡切片可能产生的问题和解决方法缺点：石蜡带弯曲不直原因：1．石蜡块上下两边不平行2．石蜡块的上下两边不和刀口平行3．刀口锋利不一，局部产生差异4．蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度不一致5．材料未居蜡块正中央6．材料大而形不正补救法：1．取下台木，将两边修干2．调节标本台，使两者平行3．移动刀片，改用新的刀口4．待蜡块冷却后再切，或重新包埋5．用刀片切去部分石蜡，使材料居中6．在大的一边切去少许石蜡缺点：切片分离、不能连成带状原因：1．室温过低2．石蜡过硬3．材料边缘留蜡太少4．刀的角度不适合补救法：1．在切片机上方开一电灯或提高室温2．在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面3．重新包埋4．矫正刀的角度缺点：切片卷起呈圆筒状原因：1．室温过低2．石蜡过硬3．刀口太钝4．刀的倾角太大补救法：1．提高室温2．加软蜡3用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3片即成带4．减小倾角缺点：切片粘附于切片刀，皱摺在一起原因：1．室温过高2．石蜡过软3．刀口上留有一层石蜡4．刀口钝补救法：1．降低室温2．将蜡块投入凉水中稍浸耒—增加3．切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去刀口的石蜡4．磨刀或移动刀口缺点：切片纵裂原因：1．刀有缺口2．石蜡块中含有颗粒、杂质3．刀口留有碎屑或细丝4．组织太硬补救法：1．可移动刀口2．将颗粒拽去3．清洁刀口4．让包埋块在水中浸泡缺点：切片有横纹原因：1．刀和台木的固定螺丝太松2．刀口倾斜度太大3．刀口有石蜡屑补救法：1．旋紧螺旋2．可放平1—2。后再切3．用氯仿拭去缺点：切片厚薄不匀原因：1．切片机有毛病2．夹刀不当3，未旋紧标本台螺旋4。石蜡块过硬补救法：1．矫正切片机装置2．对症治疗3．旋紧螺旋4．将石蜡块在水中浸泡缺点：每张切片厚薄不匀原因：1．刀口震动，是由于材料过硬2．刀的倾角太大补救法：1。在蜡块表面涂一层火棉胶2．减小倾角缺点：材料发生裂隙破碎或脱落原因：1．脱水不干净2．有透明剂残留3．石蜡透入时，温度过高或时间过长4．由于脱水剂和透明剂的影响，使组织变硬发脆5．材料太硬或太粗补救法：1．无法弥补2．增加浸蜡时间，重新包埋3．无法补救4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明5．在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液缺点：切片时发生沙沙声原因：1．组织块过硬2．包埋温度过高3，材料内留有结晶体补救法：1．浸泡水中软化2．无法补救3．无法补救缺点：石蜡块将蜡带抬起原因：1．由于摩擦而产生静电荷所致2．石蜡块上面附有石蜡碎屑3．刀口上附有石蜡碎屑补救法：1．提高室温2．用刀片将碎屑清除3．用二甲苯或氧仿清除7．贴片切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。贴片一般有捞片法和烫板法。捞片法比较简单，首先将切片分割开，投入到48℃的温水浴中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（将鸡蛋一个打破入杯中，去除蛋黄留下蛋白，用筷子充分调打成雪花状泡沫，然后用双层纱布过滤至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一体积的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存几个月到一年。）或5％明胶水溶液的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于室温下放置一昼夜后使其彻底干燥。烫板法，是将涂有粘片剂的载玻片上涂上水，把已分割好的切片贴上去，再置载玻片于35℃恒定的烫板上让切片摊干，并倾斜或用吸水纸吸去水分，最后将载玻片再度放烫板上晾干。要注意，不管是使用捞片法还是烫板法，所用的载玻片必须洁净，不能有油污（检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水，若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁，有残留油脂等物在上面）；切片的光面应朝下，否则染色过程中切片容易脱落。8．染色组织切片是无色透明的，必须进行染色后才能观察到各种微细结构。染色方法很多，但是染色剂往往是水溶液，因此切片必须经过脱蜡而再度复水。这方法即为脱水、透明的逆过程。由于切片十分菲薄，处理的时间大大减少，一般每级停留约2～5min。染色是一个复杂的过程，兼有物理和化学作用，对其中的机制目前了解得不很清楚。研究细胞器和细胞内的重要组分都有很多现成的方法，例如显示DNA的Feulgen反应，显示RNA的Brachet反应，显示多糖的PAS反应，显示蛋白质的Millon反应和显示某些酶的钙—钴法等，可以根据不同的要求来选用。9．透明染色后的切片须再次经过脱水、透明。标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地显示出来。10．封藏封藏的目的是使制成的切片能够永久保存，封藏剂必须能与透明剂互溶，对染色无影响，折射率近似玻璃和具有粘性的物质，常用的封藏剂有加拿大树胶和中性树胶。封片的方法是：将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在标本上的二甲苯尚未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片，避免产生气泡，也不得拖动盖玻片，以免将标本破坏。树胶量视盖玻片大小而定，勿使过多过少。贴上标签，注明材料、染色法，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石蜡切片。
『叁』 我在做石蜡切片，把胚胎包埋在1.5%琼脂里，然后脱水，分别是10%，30%，50%，70%，80%
说明
石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
取材
应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。
固定
用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10%福尔马林（4%甲醛）或10%磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，不仅适用于常规H精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为1小时至24小时。
洗涤与脱水
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。该步骤称作洗涤多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；使用酒精或酒精混合液固定的组织，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，若不除去水分则无法进行以后的透明、浸蜡与包埋处理，原因在于透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不能脱尽，苯类无法浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混。为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。
透明
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，最长为数小时。
浸蜡与包埋
用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种，可根据季节及操作环境温度来选用。
切片
包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。
贴片与烤片
用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除
『肆』 小鼠肝组织石蜡切片具体怎么做
一般来说是要的，但也要根据具体实验要求决定（比如你要观察一些什么东西啦，对结构的完整性要求有多高啦）甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。
注意：1.材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。
2.固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。
过程：
1.取材
2.固定
3.洗涤与脱水
4.透明
5.浸蜡与包埋
6.切片
7.贴片与烤片
8.切片脱蜡及水化
9.染色
10.切片脱水、透明和封片
切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。
『伍』 跪求，真的很感谢 ，石蜡切片制作中 ，封片前制好的切片需要再次脱水吗。为什么
需要。
切片一系列工作完成后，就要进行染色和封片了。由于要染色的切片尚包在石蜡中，而所用的染色液都为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水。与固定的组织块脱水、透明的步骤相反，石蜡切片先在二甲苯中溶去石蜡，再经过各级酒精，下行至水。
染色后，如果组织片中有水分，则光不宜通透，在显微镜下观察不清组织的结构，所以必须经过脱水。
给你我们学校的实验讲义看看吧～希望对你有帮助～有不懂的地方问我～
实验一 石蜡包埋切片技术
实验目的：1、学习石蜡包埋切片技术的基本原理和基本步骤；
2、掌握石蜡包埋切片技术。
实验原理：
大家在生物学实验时，曾经观察过动物组织和植物组织的切片。通过光学显微镜，我们可以观察到细胞内部的结构（例如细胞核、细胞质、肌肉组织的横纹等）、细胞相互间的联系以及组织的构成等。那么，如何来制作这种切片呢？其过程是比较复杂的，我们利用3—4次实验来学习组织切片的制作。
大家知道，我们要在显微镜下研究生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察的，因为整个动、植物体大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，一定要经过特殊的处理，使要观察的材料先减少它的厚度和体积，使光线能透过才能用显微镜观察。通常应用的有两种方法：一种是非切片法，即用物理或化学的方法将生物体组织分离成为单个细胞或薄片，例如我们在生物学实验曾做过口腔上皮的观察、洋葱鳞茎表皮的观察。这种方法的不足之处在于细胞彼此间相互的联系不一定观察到。另外一种为切片法，即用刀将标本切成薄片。
非切片法比较简单，一学就会，我们这里不作介绍。
切片法也分徒手切片法和切片机切片法。最简单的切片法是将新鲜植物材料直接用刀切成薄片，称之为徒手切片法。切片机切片法是用特殊的切片机来切片，切片的厚度可薄到几个微米。因此，切片机的发明与应用也是细胞学诞生的重要因素。
切片机切组织用的也是刀（切片刀），所要切的组织要有一定的软硬度，如刀切肉（新鲜、冷冻）。但大部分生物材料比较柔软，所以为了能切出薄片，必须先使所切材料有一定的软硬度。一些包埋剂可以达到这个目的，如石蜡，它融化时可渗入到组织内部；凝固时，使整个组织有一定的软硬度，正好能切出很薄的切片，故称为石蜡包埋切片法。另外还有火棉胶包埋切片法（火棉胶做包埋剂）、冰冻切片法（使组织冷冻到一定的硬度）等。其中最常用的切片方法还是石蜡包埋切片法，我们这里重点学习石蜡包埋切片技术。
实验器材：
（一）小鼠、小广口瓶、标签、量筒、烧杯、95%酒精、无水酒精、蒸馏水、手术刀、剪刀、镊子、平皿、石蜡块、滤纸、甲醛液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。
（二）恒温箱、融蜡、纸盒、烫板、支架、酒精灯、火柴、小镊子、滤纸。（擦载玻片、磨刀、液体石蜡）。
（三）手术刀、木板、酒精灯、火柴、锯条、木块、塑料板、切片刀、切片机、毛笔、小镊子、载玻片、蛋白甘油、恒温水浴箱、温度计、大白盘。
实验步骤：
制作小鼠肝、脾、肾、小肠等切片。
1、取材：取材是指从动物或植物体上割取所要观察的组织材料，比如植物的茎、叶，动物的肝脏、小肠等。
取材时应注意以下几点：
（1）新鲜：在割取材料时应愈快愈好，否则动植物体的细胞成分、结构及分布等就会发生改变。
（2）防止人为损伤：如生拉硬拽、挤压等，以免出现人为损伤。
（3）大小：0.5 cm × 0.5 cm × 0.2cm。
2、固定：机体死亡或组织离体后，组织细胞由于血液供应停止，即可发生缺氧，导致生物氧化过程停止。相反，细胞内的无氧酵解酶类活跃，使组织内蛋白质、糖、脂肪降解，导致组织发生自溶。另外，组织也可因污染细菌而发生腐败。因此，为了使细胞和组织结构保持生活时的状态，必须进行适当的固定。固定的目的在于保存组织内细胞的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。
固定组织的物质——固定剂——具有凝固或沉淀组织蛋白的作用，因此能抑制酵解酶类的活动和细菌的繁殖，从而呈现对组织的固定作用。
固定剂的种类很多，最常见的有乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞和锇酸等8种。各种固定剂对蛋白质、脂肪、糖等作用不同，因此，单一的固定剂不能保存所有的成分，故多用混合固定剂。
各种书籍对固定剂的介绍特别多，如化学性质、固定的原理、固定组织的优缺点等，由于时间的所限，我们这里不作详细介绍，仅介绍几种常见的固定液及其配方和用途。
（1）10%福尔马林液：1份甲醛液 + 9份蒸馏水
市场上出售的甲醛液约含37-40%的甲醛，10%福尔马林液实际上仅含3.7-4.0%的甲醛。
适用范围：各种组织。但是经10%福尔马林液固定的组织，细胞核染色较好，而细胞质染色较差。
处理：组织块一般固定16-24h，长时间亦可，甚至可用来长期保存组织块。短时间固定的组织块不需水洗，可直接转入70%酒精脱水。
（2）Bouin氏液：苦味酸饱和水溶液（1.22%） 75ml （15）
甲醛液 25ml （5）
冰醋酸 5ml （1）
适用范围：各种动物组织及植物组织的根尖，是动物组织良好的固定液。
处理：固定24h，也可在此液长期保存。流水冲洗或不经水洗直接入70%酒精脱水。
（3）Zenker氏液： 甲液：氯化汞（升汞） 5g
重铬酸钾 2.5g
硫酸钠 1g
蒸馏水 100ml
乙液：冰醋酸 5ml
使用前将甲、乙两液混合。
适用范围:为一般动物组织的优良固定液，经其固定的组织，细胞核及细胞质染色颇为清晰。
处理：固定时间为16-24h，然后流水冲洗一夜以洗去氯化汞，再入70%酒精脱水。切片染色前要用碘液除去汞沉淀。
（4）Gendre氏液： 苦味酸饱和酒精液（8.96g/100ml95%酒精） 85ml
甲醛液 10ml
冰醋酸 5ml
适用范围：用于检查动物组织中的糖原（因为糖原溶于水）。
处理：固定3-6h，直接转入95%酒精脱水。
（5）Carnoy氏液： 无水乙醇 60ml
三氯甲烷 30ml
冰醋酸 10ml
适用范围：用于检查动物组织的核酸、糖原等。
处理：固定2-6h，直接转入95%酒精脱水。
还有多种多样的其它固定液。固定液的选择应根据所要固定的材料以及检查的目的而定。
3、冲洗：材料自固定液中取出后，需立即冲洗，使其中所有的固定液全部除去，以妨碍染色。
有些固定液，如10%福尔马林液、Bouin氏液固定的材料，若时间较短的话可不必冲洗。但时间过长亦需冲洗。
冲洗的方法：组织块放在瓶内，胶管插入瓶内接通自来水，瓶口用纱布包住。流水冲洗一夜，即能达到冲洗的目的。
4、脱水：脱水的目的在于使组织中的水分完全除去。因为组织块将来要在石蜡
中包埋，而水和石蜡是不相溶的。必须经过脱水后，才能进入包埋阶段。
常用的脱水剂有乙醇、丙酮、正丁醇等，最常用的还是乙醇。利用脱水剂吸水的特性，在各级浓度脱水剂中逐渐吸取组织中的水分。乙醇脱水的过程一般从70%乙醇开始，经80%、90%、95%、100%（二次）而完成脱水过程。每向后转移前，须先将组织块上的液体用吸水纸吸干，以免影响后续乙醇的浓度。
脱水时应注意：（1）在高浓度或无水乙醇中，每级停留的时间不宜太长，否则可使组织收缩变脆，影响切片；（2）如需过夜，应停留在70%乙醇中，也可长期保存，可防止因时间倒不开而影响后续步骤。
5、透明：脱水后是否可以进入包埋呢？但因脱水剂与石蜡也不相溶，因此在包
埋前，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于石蜡的物质——透明剂——来起中间置
换作用。
所以，透明的目的在于使组织中的乙醇或丙酮被透明剂所代替，以使石蜡能很顺利地进入组织中。另外，还能增强组织的折光系数，故称透明剂。
透明剂的种类很多，常用的有二甲苯、甲苯、苯等。二甲苯为最常用的透明剂，二甲苯能溶于醇及醚，亦为石蜡溶剂，但不溶于水，它的透明力很强。
透明过程：一般经过1/2二甲苯-1/2无水乙醇，两次二甲苯。
透明彻底的标准：胃、肠、结缔组织等比较透明；肝、肾、心、肌肉等组织呈暗红色浸油状态，则说明脱水、透明良好。如果组织进入二甲苯30min以后还不变色，或中心有白色，说明水分未脱净，应返回无水乙醇继续脱水。透明这一步至关重要，若透明时间不足，则石蜡进不去，不能切片；若透明时间过长，则使组织收缩变脆、变硬，切片易碎。这一步要靠经验。
6、浸蜡：浸蜡就是将石蜡透入整个组织的过程。
所谓石蜡包埋切片法，是用石蜡来浸透、包埋组织块，再进行切片和染色的
制片方法。
石蜡为最常用的包埋剂，有几种不同熔点的石蜡，通常所用的石蜡的熔点为54-58℃。
浸蜡过程：在60℃的温箱内已融化的石蜡中经两次各1h，使石蜡浸透组织。
浸蜡时注意温度不宜过高，浸蜡时间亦不宜过长，否则会引起组织变硬、变脆，影响切片。
7、包埋：包埋就是被石蜡浸透的组织连同溶化的石蜡，一起倒入一定形状的器皿（如纸盒、平皿）中，然后使其凝固成蜡块的过程。
包埋的过程：（1）折叠纸盒；
（2）用酒精灯加热温台及纸盒；
（3）往纸盒中倒入溶化的石蜡；
（4）放入组织块，切面向下，并拨正位置；
（5）蜡块凝固。
从取材到包埋是一个连续的过程，往往连续几天，如果没有计划、没有完善的安排，就有可能和其他上课时间发生冲突，或造成半夜出勤。有时单凭记忆，把前后顺序颠倒或超过了规定时间，会造成实验失败。因此需预先编制一个日程表。
【建议时间】
乙醇脱水：70%：16：30
80%：第二天7：20
90%：9：20
95%：11：00
100%(Ⅰ):12:00
100%(Ⅱ):13:00
透明：1/2二甲苯-1/2无水乙醇：14：00
二甲苯（Ⅰ）：14：20
二甲苯（Ⅱ）：14：40
浸蜡：石蜡（Ⅰ）：15：00
石蜡（Ⅱ）：16：00
包埋：17：00
注意事项：（1）动作要迅速；（2）融蜡别滴到桌面、地上。
8、切片：在包埋后，就可以进行切片。在切片之前，还需对包埋好的组织块进行修整，并贴附于木块上，才能进行切片。
修块：以每一组织块为单位，用小刀将组织块大体修成长方形或梯形，组织的周围须留1-2mm宽的蜡边。
固着：用酒精灯烧热金属片，将组织块切面的对立面稍烫熔一下，并立即贴于木块上。
切片机的构造：
切片机是用来做各种组织切片的一种仪器，其样式很多，性能也不一样，一般可分为两大类型，即滑行式切片机与旋转式切片机。我们使用的是旋转式切片机。其主要结构分为3部分：（1）控制切片厚度的微动装置；（2）供装置切片刀的夹刀部分；（3）供装置组织块的夹物部分。旋转轮每旋转一次，微动装置就按所调节好的切片厚度以水平方向将组织块向前推进一片的厚度。
切片操作：
（1）固定切片刀：刀刃向上，保持水平。调好角度，一般在4-6度。
（2）固定组织块。
（3）调整所需要的切片厚度：一般在6-10微米。
（4）移动持刀器，或拔开齿轮上的牵引钩，前后转动齿轮以移动组织块固定器，调节组织块表面和刀刃的距离，以刚要接近时为止。
（5）调整组织块与刀刃之间的角度和位置：组织块的切面及上下边须与刀刃平行。
（6）粗切：右手摇轮，左手转动齿轮，慢慢将组织块切到组织本身。
（7）切片：右手转动摇轮，转一圈可切下一片，切第二片与第一片连在一起，即成连续切片。左手用镊子或毛笔提起切片的下端，轻轻向自身方向拽，使切片成连续的带状。
（8）展片：停止切片，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带跳起，靠刀刃的一面向下，慢慢接触40-45℃的水面，借助水的表面张力使其在水面展开。如有小的皱褶，用小镊子轻轻分开。应注意：水温过高，易使切片全部融化；水温过低，切片不宜伸展。
（9）贴片：即将切片贴在载玻片上。先将连续切片分成一片或小段。将载玻片1/2处均匀涂一层薄薄的蛋白甘油（等量的鸡蛋清和甘油混合而成，防止脱片。切勿涂得过多！），将载玻片垂直插入水中，以涂有蛋白甘油的面贴近组织片，提起载玻片使组织片贴附在载玻片上。用小镊子将切片摆在载玻片1/3和2/3的交界处，并摆正位置。然后在52-60℃恒温箱烤干。
整个石蜡包埋切片技术至此全部结束。
实验二 苏木精-伊红染色
实验目的：1、了解染色的基本原理和基本方法；
2、掌握苏木精-伊红染色方法。
实验原理：
一、染料的一般知识
1、染料的染色原理：（1）化学作用：染料的性质有酸、碱、中性之别，那么组织中的碱性部分（如细胞质）易和酸性染料亲和而发生作用，组织中的酸性部分（如染色质）易和碱性染料亲和而发生作用。（2）物理作用：指吸附或溶解作用。组织蛋白和某些染料有相互吸附的作用。
2、媒染剂、促染剂和分化剂
媒染剂：某些天然染料（如苏木精），本身无着色性，要与其他物质结合后才具有着色性，这些被结合的物质称为媒染剂，如许多铁盐、铬盐及钾盐等。
促染剂：是促进染料着色性的物质，如冰醋酸是伊红的促染剂。
分化剂：能使切片上需要显示的结构清晰，而使不需要显示的结构脱去颜色的物质。如1%盐酸酒精。
一、苏木精-伊红染色（H.E染色）
所做出的石蜡包埋切片可应用的染色方法很多，应根据不同的检查目的而选用不同的染色方法。而最为常用的染色法为H.E染色。
1、苏木精(苏木素、苏木紫)（hematoxylin）：为从苏木中提取。苏木精本身不是染料，不能直接染色，必须经氧化才能染色。可以在空气中自然氧化，但需时很长，所以一般都是加氧化剂（如碘酸钠）氧化。同时，被染材料又须经媒染剂作用后才有着色能力，所以在配制苏木精染液时，都加有媒染剂。苏木精液主要着染细胞核。
有数种不同配方的苏木精液。
Mayer(梅耶)氏苏木精液：
苏木素 1g
硫酸铝钾 50g （媒染剂)
碘酸钠 0.2g
水合氯醛 50g
柠檬酸 1g
蒸馏水 1000ml
2、伊红（曙红）(eosin)：又分几种，如伊红Y、伊红B等。
伊红对细胞质、肌纤维、胶原纤维具有着色性。
一般用0.5%伊红/70%乙醇液或1%伊红水溶液。
由于苏木精着染细胞核，伊红着染细胞质，所以这种方法称为双重对比染色法。
实验材料：石蜡切片、盖玻片、小镊子、大镊子、树胶、滤纸、纱布、染色缸、二甲苯、乙醇系列、Mayer氏苏木精液、0.5%伊红酒精液（或1%伊红水溶液）、1%盐酸酒精、蒸馏水、显微镜。
实验步骤：
1、切片脱蜡、复水：
由于要染色的切片尚包在石蜡之中，而所用的染色液都为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水。与固定的组织块脱水、透明的步骤相反，石蜡切片先在二甲苯中溶去石蜡，再经过各级酒精，下行至水。
把玻片放入盛有二甲苯的染色缸中以溶去石蜡（20min），再经第二缸二甲苯（10min）。经100%、95%、90%、80%、70%各级酒精、蒸馏水入水，每级3-5min。
2、入苏木精液染5-7min。
3、流水洗去附着染液，（在1%盐酸酒精中蘸3-4下），然后流水冲洗20min使切片由淡红色变为灰兰色。
4、入伊红染液5-7min。
5、脱水、透明：
如果组织片中有水分，则光不宜通透，在显微镜下观察不清组织的结构，所以必须经过脱水。透明剂能增强组织的折光系数。这样，才能在显微镜下观察。
在70%、80%、90%的酒精中每级各蘸3—4下，再经95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精，每级各5min。在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中分别透明10min。
6、封片：
从二甲苯中取出载玻片，未等二甲苯挥发，在组织切片上滴加适量树胶，上面再加盖玻片（倾斜放下）封固。
封片目的：（1）便于保存；（2）应用合适折光率的封藏剂使组织结构能在镜下很清晰地显示出来。
结果：细胞核呈蓝色至深蓝色，细胞质呈淡红色或红色。
作业：1、为什么生物体的组织要经过如此繁琐的步骤才能观察其组织结构？
2、查阅文献，有哪些文章采用石蜡包埋切片和H.E.染色？
3、通过查阅文献，谈一下石蜡包埋切片和H.E.染色的用途。
『陆』 石蜡切片固定后50%脱水,时间不合适,再回去固定可以么
脱水时间不合适就脱到70-75%的酒精浓度，在酒精中保存就行了
『柒』 制作石蜡切片之前忘记脱水了有没有什么补救的办法，实验效果会有什么影响
应该会有影响吧，为了实验结果，还是重新做一次吧。那样的结果会好一些的。
『捌』 石蜡切片最常用的脱水剂
该步骤称作洗抄涤多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；使用酒精或酒精混合液固定的组织，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，若不除去水分则无法进行以后的透明、浸蜡与包埋处理，原因在于透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相溶合，水分不能脱尽，苯类无法浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混。为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。
『玖』 为什么用酒精进行石蜡切片脱水,而不是选用其他试剂
便宜，无毒，并且效果好
『拾』 肝脏组织存放太久补救方法
一定会的,组织里面有水分,结冰会破坏里面的细胞,HE染色一般是要进行石蜡切片吧,得先固定