细胞涂片长久保存中性树脂

1. 血细胞涂片可以选用的固定液可以有哪些

固定剂
用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。
1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。
（1）10%钙-福尔马林液（浓甲醛10ml，饱和碳酸钙90ml）。
（2）10%中性缓冲福尔马林液（浓甲醋10ml，0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml）。
（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛40g, 0.1mol/L PBS液pH7.4 500ml，两者混
合加热至60℃，搅拌并滴加1N NaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量1000ml）。
（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，浓甲醛10ml，蒸馏水加至100ml）。
戊二醛是二醛基化合物，交联结合力比甲醛大，Bullock认为交联过强，可出现组织改变和空间遮蔽现象，影响组织的抗原性。但McDonald等认为，该试剂用于PAP法免疫酶标记效果仍满意。
（5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。浓甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸钠1.25g ,蒸馏水90ml）。
有人认为此固定液悬液是较理想的固定液，标记IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。也有人认为它减弱细胞的抗原性，上皮细胞可产生非特异性荧光，故不宜用于免疫荧光标记。氯化汞是一种强蛋白凝固剂，但对组织穿透性弱，且使组织收缩，故与甲醛混合使用。
（6）醋酸-甲醛液（浓甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理盐水加至100ml）。
Bullock等认为此液固定效果良好，组织可不经消化，胞浆IgA、IgG、IgM、IgD和K、λ、J链标记均呈阳性，且背景染色极淡。如标记IgG用PAP法第一抗体仅为甲醛升汞液的1/10。此液内醋酸既可防止组织收缩，又可暴露胞浆免疫球蛋白抗原决定簇。
（7）Bouin’s液。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致IgG γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。
（8）Zamboni’s液。
该固定液可用于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存优于纯甲醛，也适用于光镜免疫细胞化学研究。采用2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。固定时间6-18h。
（9）PLP液（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液）。
该固定剂适用于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氧基与醛基结合，从而与糖形成交联。组织抗原大多数是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定液有选择性地使糖类固定，既稳定缺的，又不影响其在组织中的位置（固定剂7-9配制法见附录1）。

2. 血细胞涂片可以选用的固定液可以有哪些

1、95%酒精：
是最常用的细胞学固定液，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋沉淀后，能溶于水，因此，经95%酒精固定的涂片，染色前没有必要经过水洗。此固定液适用于苏木素-伊红染色和巴氏染色。固定时间根据标本的不同，时间也不尽相同，一般标本固定时间为15-30分钟，痰标本需要更长一些时间。经过95%酒精固定的标本，细胞核保存较好，结构清晰，颜色鲜艳。如果在95%酒精液内加入聚乙二醇更佳，可以保护细胞免受空气干燥后的人工假象。
2、乙醚酒精液（1：1）：
其效果与95%酒精相似，但由于乙醚有很强的吸水性和特有的刺激性气味，容易挥发，长期低浓度吸入，有头痛、头晕、疲倦、嗜睡、蛋白尿、红细胞增多等不良反应。长期皮肤接触，可发生皮肤干燥、皲裂。所以现在已经逐渐被95%酒精所代替。
3、甲醇：
固定时间快，细胞收缩小，细胞核保存较好，结构清晰，染色鲜艳。常作为穿刺细胞涂片的固定液。对抗原保存较好，可作为细胞涂片免疫组化的固定液。缺点是具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对中枢神经有一定的伤害。甲醇的毒性与其代谢产物甲醛和甲酸的蓄积有关。以前认为毒性作用主要为甲醛所致, 甲醛能抑制视网膜的氧化磷酸化过程,使膜内不能合成ATP,细胞发生变性,最后引起视神经萎缩。近年研究表明,甲醛很快代谢成甲酸,急性中毒引起的代谢性酸中毒和眼部损害，主要与甲酸含量相关。
4、冰醋酸：5%水溶液可作固定用。不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白。渗透性强，固定快，能使红细胞膨胀而破碎，常与其它液体配合使用。
4、无水酒精：
对糖原保存较好，容易使细胞收缩，其性能与95%酒精相似，很少单独使用，一般只用于糖原的固定。
5、丙酮：
为易挥发的无色液体，有刺激性气体。可使蛋白质沉淀，渗透性强，细胞收缩严重，对核的固定差。很少用于常规细胞学的固定。广泛用于酶组织化学中的各种酶的固定，也有人用于抗原的保存，作为细胞涂片免疫组化的固定液。丙酮具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对肝、肾及中枢神经有一定的伤害。
6、Carnoy 固定液
配方：无水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。
Carnoy液能固定胞浆和胞核，尤其适宜于染色体等。常用于糖原及尼氏体的固定，由于冰醋酸能溶解红细胞并可防止细胞由酒精引起的过渡收缩，对固定有血的标本和显示DNA、RNA效果很好。缺点是每次固定后固定液内有大量的红细胞碎片和细胞脱落，必须及时过滤，否则容易造成污染。其次，氯仿具有挥发性和毒性，大量接触与吸入对肝、肾及中枢神经有一定的伤害。
7、10%中性缓冲甲醛液：
固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。
固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）4g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）13g。
10%中性缓冲甲醛液对大多数抗原保存较好，是免疫组织化学最常用的固定液，组织穿透性好，组织收缩较小。但此液体不适合固定湿固定的涂片，可作为干固定涂片和细胞蜡块的固定液。甲醛也具有挥发性和毒性。大量吸入会出现呼吸道的严重刺激和水肿、眼刺痛、头痛，也可发生支气管哮喘。经常吸入少量甲醛，能引起慢性中毒，出现粘膜充血、皮肤刺激症、过敏性皮炎、指甲角化和脆弱、甲床指端疼痛等。全身症状有头痛、乏力、胃纳差、心悸、失眠、体重减轻以及植物神经紊乱等。

3. 免疫荧光甩片能将细胞固定在载玻片上么

免疫荧光基本实验步骤

基本实验步骤：
（1） 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2） 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。
（3） 通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。
（4） 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
（5） 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
（6） 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7） 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

（一）细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（二）固定和通透
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三：
①防止细胞从玻片上脱落；
②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；
③使标本易于保存。

标本的固定原则是：
①不能损伤细胞内的抗原；
②不能凝集蛋白质；
③应保持细胞和亚细胞结构；
④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。
最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。通常，细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。常用的通透剂是去垢剂，如Triton ，NP-40，以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。Triton X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

（三）封闭
封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5，其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。

（四）抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。

（五）封片及荧光观察
标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片处理。常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。

（六）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染。

4. 实验课上切片、涂片、滴片各有什么特点

切片：从生物体上切取的薄片制成。如，叶片横切。

涂片：液体的生物材料涂抹制成。如，血细胞涂片。

装片：从生物体上撕下或者挑取少量的材料制成。如，洋葱表皮临时装片。

切片应称做组织切片，或病理切片。将手术取下来的病理组织或可疑的组织经过固定，封腊，经过切片机切成组织薄片，然后固定在玻片面性上，进行染色，这就是切片。最后将切片放在显微镜下检查，根据其病理细胞的特征，进行病理学的组织定性。

(4)细胞涂片长久保存中性树脂扩展阅读：

切片：供光学显微镜或电子显微镜观察的动植物组织薄片。因要求不同，可用刀片进行徒手切片，也可将组织块包埋于石蜡或火棉胶中或以低温冰冻，用切片机切片。切成5～10微米薄片，供光学显微镜观察。用环氧树脂或甲基丙烯酸包埋组织块切制的超薄切片，其厚度在20～50纳米，专供在电子显微镜下观察。一般教学用的如根尖、茎的切片通称石蜡切片。