㈠ 凯氏定氮法测定蛋白质中氨基酸含量的主要步骤有哪些
凯氏定氮法只能检测蛋白质中氮含量，不能检测氨基酸的含量。其中蛋白质含量也只是称为粗蛋白质的含量，只是用氮的含量乘以6.25（系数）得出，不是真正的蛋白质的含量。
凯氏定氮法测氮的方法如下：
1、称取0.5～1g试样（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g，无水硫酸钾（或硫酸钠）15g，与试样混合均匀，再加硫酸25ml和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加热消化15min。
2、氨的蒸馏
（1）常量直接茂馏法 将上述的试样消煮液冷却，加蒸馏水200ml，摇匀，冷却。沿瓶壁小心加入40％氢氧化钠溶液100ml，立即与蒸馏装置相连．蒸馏装置冷凝管的末端应浸入50ml硼酸吸收液lcm。加混合指示剂2滴，轻摇凯氏烧瓶，使溶液混匀，加热蒸馏，直至馏出液体积约150ml。先将吸收液取下，再停止加热。
（2）半微量水蒸汽蒸馏法 上述试样的消煮液冷却，加蒸馏水20m1转入100ml容量瓶，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。取2％硼酸溶液20ml，加混合指示剂2滴，使半微量蕉馏装置的冷凝管末端浸入此溶液；蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此液为橙红色，否则应补加少许硫酸。准确移取试样分解液10～20ml注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40％氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，并在入口处加水封密好，防止漏气，蒸馏4min，使冷凝管末端离开吸收液面，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
3、滴定 用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L的HCI标准溶液滴定，仍以甲基红或混合甲基红为指示剂。
在测定样本中含氮量的同时，应做一空白对照测定，即各种试剂的用量及操作步骤完全相同，但不加样本，这样可以校正因药品不纯所发生的误差，吸收氨后的吸收液立即用0.05mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。
4、空白测定 称取蔗糖0.0lg，以代替试样，按上述测定步骤进行空白测定，消耗0.05mol/L盐酸标准溶液的体积应不得超过0.3ml。
5、计算
N%*6.25=粗蛋白质（%）=（V2-V1）*0.014*6.25*100/m*（V’/ V）
每m1的lmol/L盐酸标准溶液相当于0.0140g的N。因此，
式中：v2—试样滴定时所需酸标准溶液的体积（m1）；
v1—空白滴定时所需酸标准溶液的体积(m1)；
c—盐酸标准溶液的浓度(mol/L)；
m一试样的质量（g）；
v —试样的分解液总体积（ml）；
v’—试样分解液蒸馏用体积（m1）；
0.0140—每ml HCl标准溶液相当于N的克数；
6.25一氮换算成蛋白质的平均系数。
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋质含量在25％以。上，允许相对偏差为1％；当粗蛋白质含量在l0％～25％时，允许相对偏差为2％；当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。
㈡ 凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳、氢被氧化为CO2和H2O逸出回，而样品中的答有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵用NaOH中和生成NH3`H2O，加热又分解为氨，用硼酸吸收，吸收氨后的硼酸再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量计算蛋白质的含量。
㈢ 试述用凯氏定氮法测定面粉中蛋白质含量的原理，简要步骤和计算公式。
测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的物理化学性质来推算，如密度、折射率、紫外吸收、荧光性等；另一类是利用化学方法来计算，如定氮、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂反应等
主要测定方法有：双缩脲法、染料结合法、酚试剂法、紫外分光光度法、水扬酸比色法、折光法、旋光法、近红外光谱法.
目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法，是通过测总氮量来确定蛋白质含量的方法。
凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量,此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物.凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法[6]。至今仍被作为标准检验方法.此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定
凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法目前通常以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛[4].
在理化实验室,检验食品中蛋白质的含量通常用微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法.接下来以大量的试验来比较微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法的精确度的大小.
1.材料与方法：
1.1试验材料
1.1.1试验样品
面粉
1.1.2试验药品和试剂
所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水。
硫酸铜；
硫酸钾；
浓硫酸；
40％氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中；
4％硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至lOOmL；
0．1mol／L盐酸标准滴定溶液；
甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液(1g／L)与甲基红乙醇溶液(1g／L)按1+2体积比混合。
1.1.3仪器和设备：
实验室常规仪器及下列各项：
凯氏烧瓶：500mL；
可调式电炉；蒸汽蒸馏装置；
铰肉机：
篦孔径不超过4nm；
组织捣碎机；
粉碎机；
研钵：玻璃或瓷质；
化学消化器，
凯氏定氮仪，
空气滤过器
1.2试验方法
1.2.1微量凯氏定氮法
微量凯氏定氮法的原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的1/10加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定[2]。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤
1.2.2全量凯氏定氮法
全量凯氏定氮法的原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的全部加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤
2 分析过程
试样制备：固体样品：取有代表性的样品至少200g，用研钵捣碎、研细；不易捣碎、研细的样品应切(剪)成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎；液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g。粉状样品：取有代表性的样品至少200g(如粉粒较大也应用研钵研细)，混合均匀；糊状样品：取有代表性的样品至少200g，混合均匀；固液体样品：按固、液体比例，取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，混合均匀；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g，用铰肉机至少铰两次，混合均匀。上述试样应放入密闭玻璃容器中，于4°C冰箱内贮存备用，尽快测定。
2.1微量凯氏定氮法的分析过程
2.1.1样品消化 :
步骤：准确称取一定量的样品，加入硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20mL、玻璃珠数粒→小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中(固体或粉末用纸卷成纸筒送入)，轻轻摇匀，以45º斜支于有小孔的石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电炉较远处)，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加大火力(或将烧瓶放在电炉上)，保持瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉，取下烧瓶、冷却→转移至100ml容量瓶中，加水定容
2.1.2 蒸馏与吸收：
按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化液10mL于反应管内，经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏10min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min
㈣ 关于凯氏定氮法
用盐酸滴定至灰色或蓝紫色为终点。
具体可以参考GB/T5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》
下载链接：http://www.foodmate.net/standard/sort/3/2683.html
㈤ 试述凯氏定氮法测定粗蛋白质的原理、方法及注意事项。试说明该方法存在的不足，并对该方法提出改进方法。
1 试剂的配制
粗蛋白测定中所用的化学药品如浓硫酸、盐酸、氢氧化钠、硼酸、硫酸铜、硫酸钾(硫酸钠)、硫酸铵、蔗糖等均为化学纯，标定盐酸标准溶液用的无水碳酸钠为基准试剂。在配制试剂前一定要用PH试纸或酸度计检测一下蒸馏水是否为中性，所用的烧杯、试剂瓶等配液设备清洗干净。
1.1 盐酸标准溶液的配制
配制的盐酸标准溶液尽量为低浓度，一般C(HCl)=0.02～0.05mol·L-1。低浓度虽然用量大，但可减少操作误差和读数误差。
配制盐酸标准溶液一定要严格按照标准操作进行，基准无水碳酸钠已定于270～300℃灼烧至恒重，称准至0.0001g，做4～6个平行样，去掉最高值和最低值后取平均值，同时还要做空白试验。
盐酸标准溶液的配制量尽量不要太多、使用时间太长，防止水分蒸发和盐酸挥发而影响其浓度的准确性。
1.2 其他试剂的配制
400g·L-1氢氧化钠溶液、20g·L-1硼酸溶液、混合指示剂(1g·L-1甲基红乙醇溶液与5g·L-1溴甲酚绿乙醇溶液等体积混合)等主要是在称量时要
㈥ 凯氏定氮法的实验原理
一、实验原理
蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液 滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量
1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4
凯氏定氮法
凯氏定氮法反应式为：
2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为:
(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4
2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量
反应式为：
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
二、操作
1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。但是此法比较危险，不易在实验室演示，现在大多数实验室有消煮仪一次可以进行多个（一次可以消煮16个样品）样品处理，并有通风橱进行通风，温度可以自己设定，更加安全和可操作性，因此逐步成为主要的凯氏定氮法的首选处理方法。
一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解。
2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红 指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
3、向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，不能立即将玻璃盖塞紧，这样易使玻璃塞粘在进样口，应先用蒸馏水冲洗然后再盖，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
三、计算
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
X：样品中蛋白质的百分含量，g；
V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积），g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数 。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。
㈦ 凯氏法测定氮
方法提要
试样在硫酸钾、硫酸铜和硒的共存下，用硫酸煮解氧化，使试样中的氮转化为硫酸铵，再用氢氧化钠碱化后，加热蒸馏逸出氨，经硼酸溶液吸收，用盐酸标准溶液滴定并计算试样中氮的含量。
方法适用于水系沉积物及土壤中氮量的测定。
方法检出限(3s):0.002%。
测定范围:0.006%～0.4%。
仪器及装置
通用的凯氏定氮蒸馏装置。
凯氏烧瓶50mL。
锥形瓶150mL。
试剂
硫酸。
氢氧化钠溶液(400g/L)。
盐酸溶液c(HCl)=1mol/L量取84mLHCl，用水稀释至1000mL。
(1+1)王水75mLHCl和25mLHNO3混合后，加入100mL水混匀。用时配制。
混合加速剂将硫酸钾(K2SO4)和硫酸铜(CuSO4·5H2O)按(10+1)比例，在玻璃研钵中研磨混匀，装入宽口玻璃瓶中。
硒溶液ρ(Se)=10.0g/L称取5.0g优级纯硒粉置于250mL烧杯中，加入10mL(1+1)王水溶解后，用水稀释至500mL，摇匀。装入磨口玻璃瓶中备用。
硼酸溶液称取20g硼酸溶解在1000mL水中。
甲基红-溴甲酚绿混合指示剂称取0.1g甲基红和0.5g溴甲酚绿，溶解在100mL乙醇中，移入玻璃瓶中备用。变色范围:pH4.4(红色)～pH5.4(蓝色)。
含有甲基红、溴甲酚绿指示剂的硼酸混合溶液取100mL硼酸溶液，加入2mL甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，用氢氧化钠溶液及盐酸溶液调节溶液呈紫红色，此时该溶液的pH为4.5。
硼砂标准溶液c(1/2Na2B4O7)=0.0200mol/L称取1.9068g硼砂(Na2B4O7·10H2O)置于250mL烧杯中，加100mL水，溶解后移入500mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
盐酸标准溶液吸取20mL1mol/LHCl溶液置于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
标定分取20.00mL硼砂标准溶液置于150mL锥形烧杯中，加1滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，用盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝色变为紫红色为终点。同时分取20.0mL水作空白试验。按下式计算盐酸标准溶液浓度:
岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术
式中:c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L;0.0200为硼砂标准溶液的浓度数值，单位用了mol/L;V1为硼砂标准溶液的体积，mL;V2为滴定消耗盐酸标准溶液的体积，mL;V0为滴定空白试验溶液消耗盐酸标准溶液的体积，mL。
分析步骤
试样的煮解。称取0.1～1.0g(精确至0.0001g)试样(粒径小于0.075mm，经室温干燥后，装入磨口小玻璃瓶中备用)置于50mL凯氏烧瓶中，加入2g混合加速剂及1mL硒溶液，加少许水润湿，加入5mLH2SO4，瓶口放一小漏斗，于通风柜内，在调温电炉上先低温加热，待溶液中无泡沫发生(约需15min)后，再升高温度，使瓶内硫酸蒸汽回流的高度控制在瓶颈上部的1/3处，要经常摇动凯氏烧瓶，直至试样和煮解液完全变为灰白带绿色(约需15min)后，再继续煮解1h。全部煮解时间需85～90min，切勿煮干。煮解完毕，取下凯氏烧瓶，冷却，以待蒸馏。
蒸馏。在150mL锥形瓶中加入5mL硼酸混合溶液，将其套在凯氏定氮蒸馏装置的下端，端口置于硼酸混合溶液液面以下3～4cm处。把煮解液全部转入蒸馏器的内室，并用水冲洗凯氏烧瓶4次，冲洗液用量不要超过40mL，打开冷却水，经三通管加入20mLNaOH溶液，立即关闭蒸馏室，打开蒸气夹，用蒸气蒸馏。当锥形瓶内的馏出液达到50～55mL(约需8～10min)后，用广泛pH试纸置冷却管口碰触蒸馏液，如无碱性反应，表示氨已蒸馏完毕。若仍为碱性反应，应继续蒸馏直至无碱性反应。同时进行空白试验的蒸馏。
滴定。已蒸馏在150mL锥形瓶吸收的氨溶液，用盐酸标准溶液滴定，滴定至溶液由蓝色突跃变为紫红色即为滴定终点，记录盐酸标准溶液的体积。同时进行空白试验的蒸馏及其吸收液的滴定，记录盐酸标准溶液的体积。
按下式计算氮的含量:
岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术
式中:w(N)为氮的质量分数，%;V为滴定试样溶液消耗盐酸标准溶液的体积，mL;V0为滴定空白溶液消耗盐酸标准溶液的体积，mL;c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L;0.014为氮原子的毫摩尔质量的数值，单位用g/mmol;m为试样的质量，g。
注意事项
本方法测得的氮不包括硝态氮、亚硝态氮。因硝酸根离子在煮解过程中不会完全还原为铵离子，且易挥发损失。但一般土壤试样中硝态氮含量不超过全氮量的1%，故可以忽略不计。
㈧ 求：凯氏定氮法 详细步骤 举例：反应方程式
根据凯氏定氮原理测定需要三个步骤，即消解、蒸馏、滴定。
化学方程式有：
[1].(NH4)2SO4+2NaOH
高温蒸气
Na2SO4+2H2O+2NH3↑
[2].
NH3+H3BO3→NH4H2BO3
㈨ 凯氏定氮法
理论是没问题。看你怎么加，只怕加的过程中有氨挥发。