Ⅰ 離子交換柱層析純化蔗糖酶實驗中梯度洗脫時使用梯度混合儀時在不含氯化鈉的一側為什麼放密封小磁棒
據我所了解的
低鹽濃度的就是右側那個，裡面應該是有個磁力攪拌用的磁力攪拌子專。
因為梯屬度洗脫需要高濃度的鹽溶液進入低濃度的溶液中，在這個過程中需要不停攪拌以混勻溶液，讓鹽濃度能夠均勻的提高，以避免出現鹽濃度升高過快，達不到梯度的效果。
不知道是不是你說的密封小磁棒
Ⅱ 離子交換柱層析能分離純化蔗糖酶的主要依據是什麼
DEAE-纖維素為二乙氨乙基纖維素，是陰離子交換劑。
其原理基於離子交換層析：離版子交換層析中，基質是由帶權有電荷的樹脂或纖維素組成。
由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。
Ⅲ 我要分離純化一種未知酶，一切未知，想用凝膠層析和離子交換層析分離，不知選用什麼填料合適有好的建議
建議用離子交換層析。凝膠過濾層析流速慢，上樣量低，而且分離效果一般，凝膠回過濾答一般用於層析的後期包括除鹽，去除降解片段之類的。
離子交換一般就用到DEAE，因為大部分蛋白都偏酸。要是你的酶是鹼性蛋白，那就更好辦，上個CM柱，其他雜蛋白就留不下多少了。
所以先拿DEAE試試吧。
Ⅳ 用鹽析法純化酶蛋白時,怎樣能夠進一步提高其純化倍數
鹽析法提取的蛋白純度差，進一步純化需要進行離子交換分離或者凝膠過濾吧，就是過柱子，可以使用蛋白純化系統。不知道你的「提高其純化倍數」是不是這個意思。
Ⅳ 做酶的分離純化是做離子交換和凝膠層析時使用普通的玻璃層析柱，只選擇填料行不行
沒問題的。
普通的玻璃層析柱只是做離子交換、凝膠層析壓力沒問題，一般也用不到什麼有機溶劑，所以放心用吧。
Ⅵ 酶分離純化離子交換柱預裝柱怎麼使用
如果不限定純化方法，可以考慮親和層析或離子交換，但根據你問題的意思，是內選定離子交換。
此時容就要考慮你蛋白的等電點了，如果等電點在你穩定pH之上，就用陽離子交換柱：
設計陽離子交換層析：將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running buffer。同時裝柱，平衡，然後上樣，平衡，洗脫（因為你的pH不穩定，建議鹽洗脫），收峰。得你的蛋白；
如果你的等電點在穩定pH之下，就用陰離子交換柱，其步驟如上，只是改變柱子類型。
Ⅶ 給出一種酶，如何設計其純化方案
發個實驗給你參考參考！！！
酵母蔗糖酶的分離純化和活力測定
實驗簡介：酶的分離制備在酶學以及生物大分子的結構功能研究種具有重要意義。啤酒酵母中蔗糖酶含量豐富。本實驗用新鮮啤酒酵母作為原料，通過破碎細胞，熱處理，乙醇沉澱，柱層析等步驟提取蔗糖酶。並對其活力進行測定。
實驗原理
蔗糖酶主要存在於酵母中，但工業上通常從酵母中製取。酵母蔗糖酶系胞內酶，提取時細胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉澱、離子交換和凝膠柱層析。以此可得到較高純度的酶。
蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖。用測定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測定蔗糖水解的速度，本實驗中，蔗糖酶的活力單位指在一定條件下反應5min,每產生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，比活力為每毫克蛋白質的活力單位數。
實驗操作
1. 提取
(1) 准備一個冰浴，將研缽穩妥放入冰浴中。
(2) 將10g濕啤酒酵母，和適量（5g）二氧化硅一起放入研缽中。二氧化硅要預先研細。
(3) 緩慢加入預冷的30mL去離子水，每次加2mL左右，邊加邊研磨，至少用30分鍾。以便將蔗糖酶充分轉入水相，至酵母細胞大部分研碎，以便將蔗糖酶充分轉入水相中。
(4) （可選項） 研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果。
(5) 將混合物轉入兩個離心管中，平衡後，用高速冷離心機，4℃，10000rpm，離心5min。
(6) 用滴管小心地取出水相，轉入另一個清潔的離心管中，4℃，10000rpm，離心15min。
(7) 將清液轉入量筒，量出體積，用廣泛pH試紙檢查上清液pH，用1mol / L 醋酸將pH調至5.0，稱為「粗級分Ⅰ」。留出1.5mL測定酶活力及蛋白含量，剩餘部分轉入清潔的離心管中。
2. 熱處理和乙醇沉澱
(1) 預先將恆溫水浴調到50℃，將盛有粗級分I的離心管穩妥地放入水浴中，45℃下保溫30分鍾，在保溫過程中不斷輕搖離心管。
(2) 取出離心管，於冰浴中迅速冷卻，用4℃，10000rpm，離心10min。
(3) 將上清液轉入小燒杯中，放入冰鹽浴（沒有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入等體積預冷至－20℃的95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需30分鍾，再在冰鹽浴中放置10分鍾，以沉澱完全。於4℃，10000rpm，離心10min，傾去上清，並滴干，沉澱保存於離心管中，蓋上蓋子或薄膜封口，然後將其放入冰箱中冷凍保存（稱為「級分Ⅱ」）。廢棄上清液之前，要用尿糖試紙檢查其酶活性（於下一個實驗一起做）。
3. DEAE纖維素柱層析純化酶蛋白
(1) 離子交換劑的處理
稱取1.5克DEAE纖維素(DE-32)乾粉，加入0.5mol／L NaOH溶液(約50m1)，輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時(不超過1小時)，用玻璃砂漏斗抽濾，並用去離子水洗至近中性，抽干後，放入小燒杯中，加50mL 0.5mol／L HCl，攪勻，浸泡0.5小時，用去離子水洗至。近中性，再用0.5 mol／L NaOH重復處理一次，用去離子水洗至近中性後，抽干備用(因DEAE纖維素昂貴，用後務必回收)。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過並回收的，按「鹼一酸」的順序洗即可，因為酸洗後較容易用水洗至中性。鹼洗時因過濾困難，可以先浮選除去細顆粒，抽干後用0.5 mol／L NaOH-0.5 mol／L NaCl溶液處理，然後水洗至中性。
(2) 裝柱與平衡
先將層析柱垂直裝好，在燒杯內用0.02 mol／L，pH7.3 Tris-HCl緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然後用此緩沖液洗柱至流出液的pH與緩沖液相同或接近時即可上樣。
(3) 上樣與洗脫
上樣前先准備好梯度混合器，詳見附錄TH-500梯度混合器使用說明。
用5mL 0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級分Ⅱ(注意玻璃攪棒頭必須燒圓，攪拌溶解時不可將離心管劃傷)，若溶液混濁，則4 000r／min離心除去不溶物。取1.5mL上清液(即醇級分Ⅱ樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量)，將剩餘的3.5mL上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，上樣後用約30mL緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質，至A280降到0.1以下，注意從上樣開始使用部分收集器收集，每管2.5～3.0mL／l0min。然後打開梯度混合器，採用30mL，0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液和30mL含0.2mol／L濃度NaCl的0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl.緩沖液，進行線性梯度洗脫，連續收集洗脫液，控制流速2.5～3.0mL／10min。測定每管洗脫液的A280光吸收值。
(4) 各管洗脫液酶活力的定性測定
在點滴板上每一孔內，加一滴0.2mol／L，pH4.6的乙酸緩沖液，一滴0.5mol／L蔗糖和一滴洗脫液，反應5min，在每一孔內同時插入一小條尿糖試紙，10～20min後觀察試紙顏色的變化。用「+」號的數目，表示顏色的深淺，即各管酶活力的大小。合並活性最高的2～3管，量出總體積，並將其分成10份，分別倒人10個小試管，用保鮮膜封口，冰凍保存，使用時取出一管，此即「柱級分Ⅲ」。
4. 各級分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力
用0.02mol／L，pH4.6乙酸緩沖液(也可以用pH5～6的去離子水代替)稀釋各級分酶液，測出酶活合適的稀釋倍數：
Ⅰ： 1 000～10 000倍；
Ⅱ： 1 000～10 000倍；
Ⅲ： 100～1 000倍；
以上稀釋倍數僅供參考。
按「表1」的順序在試管中加入各試劑，進行測定，為簡化操作可取消保鮮膜封口，沸水浴加熱改為用90～95℃水浴加熱 8-10min，以5min生成的還原糖的毫克數為縱坐標，以試管中lmL反應混合物中的酶濃度(mg蛋白／m1)為橫坐標，畫出反應速度與酶濃度的關系曲線。
表1 各級分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性測定
各管名稱 對照 級分Ⅰ 級分Ⅱ 級分Ⅲ 葡萄糖
管數 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
酶液/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
乙酸緩沖液0.2mol/L,pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
蔗糖0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
加入蔗糖，立即搖勻開始記時，室溫准確反應5min後，立即加1mL 0.1M NaOH中止反應
二硝基水楊酸溶液 mL 1.0
用保鮮膜封口，扎眼，沸水浴加熱5min，立即用水冷卻3分鍾。
H2O/mL 4.0
A520
稀釋後酶活力 /
原始酶活力 /
5. 考馬斯亮蘭法測定各級分蛋白質含量
(1) 蛋白質標准曲線製作
取14支試管，分兩組按下表平行操作。
表2 蛋白質標准曲線製作
試管編號/mL 0 1 2 3 4 5 6
標准蛋白溶液/mL
0.02mol/L Tris-HCl緩沖液/mL
考馬斯亮蘭試劑/mL
搖勻，1h內以0號試管為空白對照，在595nm處比色
A595nm
(2) 各級分蛋白質含量測定
考馬斯亮蘭G-250在酸性溶液時呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。當與蛋白質結合後變成深藍色，最大吸收峰轉至595nm，在10~100μg/mL蛋白質濃度范圍內成正比。因此在測定各級分蛋白質含量時應稀釋適當倍數，使其測定值在標准曲線的直線范圍內。根據所測定的A595nm值，在標准曲線上查出相當於標准蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
6. 計算各級分的比活力、純化倍數及回收率
為了測定和計算下面表3中的各項數據，對各個級分都必須取樣，每取一次樣，對於下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進行校正，以使回收率的計算不致受到不利的影響。
1活力單位(U)＝酶在室溫，pH＝4.6條件下，每分鍾水解產生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力＝活力單位/mg蛋白。
表3 各級分的比活力、純化倍數及回收率
級
分 記錄
體積
(m1) 校正
體積
(m1) 蛋白質
(mg／m1) 總蛋白
(mg) Unit
(s／m1) 總活力
(U) 比活力
(Units
／mg) 純化
倍數 回收率
(％)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ
下面表4是對假定的各級分記錄體積進行校正計算的方法和結果：
表4 實驗記錄表
級分 記錄體積 (m1) 校正體積計算 取樣體積
(m1) 校正後體積
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
五、 結果
在同一張圖上畫出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲線和洗脫梯度線。得出各級分的活力，比活力，提純倍數以及回收率。
六、 注意事項
從上樣開始收集，可能有兩個活性峰，梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始後洗下來的活性峰。
七、 作業
1．為什麼酶的提取需要低溫操作？
2．熱處理的根據是什麼？
去除熱敏感蛋白。
參考文獻
1．邵雪玲，毛歆，郭一清．生物化學與分子生物學實驗指導．武漢：武漢大學出版社，2003
2．張龍翔．高級生物化學實驗選編．北京：高等教育出版社，1989
3．許培雅，邱樂泉．離子交換柱層析純化蔗糖酶實驗方法改進研究．實驗室研究與探索，2002，21(3):82~84
編著者——陳彥，李紹飛
Ⅷ 試述酶的分離純化和純度鑒定的實驗方法及其原理。
分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離. 常見的分離提純蛋白質的方法有：1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽,以破壞蛋白質的膠體性質,使蛋白質從溶液中沉澱析出,稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時,溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機溶劑,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白質沉澱.2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷,因此在電場中可以移動.電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質,可將大分子物質與小分子物質分離開.4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異,在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離.主要有離子交換層析,凝膠層析,吸附層析及親和層析等,其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過濾法,蛋白質溶液加於柱之頂部,任其往下滲漏,小分子蛋白質進入孔內,因而在柱中滯留時間較長,大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出,因此不同大小的蛋白質得以分離.6、超速離心：利用物質密度的不同,經超速離心後,分布於不同的液層而分離.超速離心也可用來測定蛋白質的分子量,蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比.
Ⅸ 給出一種酶，如何設計其純化方案
如果是蛋白質酶,可以考慮
1、沉澱，
2、電泳：蛋白質在高於或低於其等電點的溶液中是專帶電屬的，在電場中能向電場的正極或負極移動。根據支撐物不同，有薄膜電泳、SDS-PAGE、凝膠分離電泳,HPLC等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。
4、層析：
a.離子交換層析，利用蛋白質的兩性游離性質，在某一特定PH時，各蛋白質的電荷量及性質不同，故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來。
b.分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質進入孔內，滯留時間長，大分子蛋白質不能時入孔內而徑直流出。
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開。