離子交換柱最大洗脫值

1. 採用離子交換柱純化蛋白時，洗脫採用的離子強度的大小范圍應該如何確定

離子交換純化是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力內不一樣人達容到分離的目的的一種分離技術。離子交換劑是含有若幹活性基團 的不溶性物質，即在不溶性母體上引入若干可解離基團而成，根據引入解離基團的不同，可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。各種離子對離子交換劑的親和力各 不相同，親和力隨離子的價數與原子序數增加而增加，而隨離子水化膜半徑的增加而降低。對具體離子交換純化，需要主要離子交換劑的選擇和處理。洗脫不同蛋白 的最恰當的離子強度液不一定一樣，通常採用濃度梯度和PH梯度相結合的方式洗脫，純化不同的蛋白最好先摸一摸洗脫液的離子濃度和PH值……
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離子交換介質 http://proct.bio1000.com/100025/

2. 離子交換柱的工作原理

離子交換柱的工作原理：
採用離子交換方法，可以把水中呈離子態的陽、陰離子去除。
以氯化鈉（NaCl）代表水中無機鹽類，水質除鹽的基本反應可以用下列方程式表達：
1、陽離子交換樹脂：R—H+Na+→R-Na+H+
2、陰離子交換樹脂：R—OH+CL-→R-CL+OH+
陽、陰離子交換樹脂總的反應式即可寫成：
RH+ROH+NaCL—RNa+RCL+H2O
由此可看出，水中的Nacl已分別被樹脂上的H+和OH-所取代，而反應生成物只有H2O，故達到了去除水中鹽的作用。
離子交換柱（ion exchange column）是用來進行離子交換反應的柱狀壓力容器。充填有離子交換樹脂的細長管柱。可由玻璃、不銹鋼、有機玻璃等不被所用的流動相腐蝕的材料製成。離子交換柱（混床）的分類：混床按再生方式分可分為體內再生混床、體外再生混床、陰樹脂外移再生混床三種。
離子交換柱的分類：
混床按再生方式分可分為體內再生混床、體外再生混床、陰樹脂外移再生混床三種。
1、體外再生混床適合小流量、對環保有嚴格要求的企業。但由於體外再生式混床配套設備多，操作復雜，現在已很少使用。
2、體內再生混床和陰樹脂外移再生混床適合大流量，有專門的水處理操作人員及廢水處理的場合。體內再生混床在運行及整個再生過程均在混床內進行，再生時樹脂不移出設備以外，且陽、陰樹脂同時再生，因此所需附屬設備少，操作簡便。
3、陰樹脂外移再生混床：陰樹脂外移再生式混合床及其配套的陰樹脂再生柱基本構造與小型逆流再生固定床大致相同，陰樹脂再生柱厚度較混合床小，所需的膨脹高度為樹脂層高度的50%～60%，故再生柱可較低，但一般為統一起見做成與混合床相同。

3. 現有一混合液,含A,B兩種蛋白質,其中A的pI值為4.7,B的pI值為10.7,將這混合液通過陰離子交換柱進行分離，

陰離子交換柱是吸收陰離子的。蛋白質在PH<PI的環境下主要是氨基發生電離，帶正電荷，而在PH>PI的環境下主要是羧基發生電離，帶負電荷。在該洗脫液中，A顯負電，B顯正電，因此A先洗脫。

4. 離子交換層析中，為什麼用氯離子洗脫陰離子

離子交換層析中，為什麼用氯離子洗脫陰離子
陰離子交換柱的填料是正電填專料,在低鹽條件下可以屬通過電荷相互作用吸附樣品中的陰離子和負電荷物質（如DNA）.這些帶負電的物質由於其帶電量不同,分子大小不同,因而與正電填料之間的結合力也就不同.用梯度的氯離子（一般用氯化鈉梯度,例如從100mM氯化鈉線性梯度升高到1M氯化鈉）洗脫掛柱樣品時,氯離子會和結合上的物質競爭結合正電填料,伴隨著氯離子濃度的不斷升高,氯離子的競爭作用越來越強,與填料結合的物質會按照親和力從弱到強依次洗脫下來,形成獨立的洗脫峰,從而將這些物質分開.
陽離子交換柱與之正好相反,柱子填料為負電荷,用鈉離子洗脫結合的正電物質.

5. 離子交換柱從實驗室到生產如何放大

首先應該選用高抄通量的介質 比如Sepharose Fast Flow 線性流速可達300cm/h

當實驗室探索完成後，應考慮優化洗脫方案，將線性梯度洗脫優化為一步式洗脫，減少分離時間和緩沖液消耗。

為了保持實驗室探索時的峰型和出峰位置，可保持柱床的高度不變，加大柱床的橫截面積，這樣可以增加填料加大吸附量，加快速度，而且洗脫後峰型和出峰位置幾乎保持不變。

放大生產的核心在於保證高流速，高容量，高回收率。需要在實驗室探索階段更多的考慮到這些因素，而非追求其他的結果。

6. 過離子交換柱時，pH梯度洗脫緩沖液一般用什麼緩沖液

如果不限定純抄化方法，可以考慮親和層析或離子交換，但根據你問題的意思，是選定離子交換。
此時就要考慮你蛋白的等電點了，如果等電點在你穩定pH之上，就用陽離子交換柱：
設計陽離子交換層析：將你的樣品置換到你所指的穩定pH的running
buffer。同時裝柱，平衡，然後上樣，平衡，洗脫（因為你的pH不穩定，建議鹽洗脫），收峰。得你的蛋白；
如果你的等電點在穩定pH之下，就用陰離子交換柱，其步驟如上，只是改變柱子類型。

7. 離子交換柱再生進完酸鹼之後怎麼辦直接正洗行不行

下面是離子交換樹脂的再生的一些方法可以參考：<br>
離子交換樹脂的再生 <br>
（1）常規的再生處理 <br>
離子交換樹脂使用一段時間後，吸附的雜質接近飽和狀態，就要進行再生處理，用化學葯劑將樹脂所吸附的離子和其他雜質洗脫除去，使之恢復原來的組成和性能。在實際運用中，為降低再生費用，要適當控制再生劑用量，使樹脂的性能恢復到最經濟合理的再生水平，通常控制性能恢復程度為70～80%。如果要達到更高的再生水平，則再生劑量要大量增加，再生劑的利用率則下降。 <br>
樹脂的再生應當根據樹脂的種類、特性，以及運行的經濟性，選擇適當的再生葯劑和工作條件。 <br>
樹脂的再生特性與它的類型和結構有密切關系。強酸性和強鹼性樹脂的再生比較困難，需用再生劑量比理論值高相當多；而弱酸性或弱鹼性樹脂則較易再生，所用再生劑量只需稍多於理論值。此外，大孔型和交聯度低的樹脂較易再生，而凝膠型和交聯度高的樹脂則要較長的再生反應時間。 <br>
再生劑的種類應根據樹脂的離子類型來選用，並適當地選擇價格較低的酸、鹼或鹽。例如：鈉型強酸性陽樹脂可用10%NaCl溶液再生，用葯量為其交換容量的2倍(用NaCl 量為117g/L樹脂)；氫型強酸性樹脂用強酸再生，用硫酸時要防止被樹脂吸附的鈣與硫酸反應生成硫酸鈣沉澱物。為此，宜先通入1～2%的稀硫酸再生。 <br>
氯型強鹼性樹脂，主要以NaCl溶液來再生，但加入少量鹼有助於將樹脂吸附的色素和有機物溶解洗出，故通常使用含10%NaCl + 0.2%NaOH的鹼鹽液再生，常規用量為每升樹脂用150～200gNaCl，及3～4gNaOH。OH型強鹼陰樹脂則用4%NaOH溶液再生。 <br>
樹脂再生時的化學反應是樹脂原先的交換吸附的逆反應。按化學反應平衡原理，提高化學反應某一方物質的濃度，可促進反應向另一方進行，故提高再生液濃度可加速再生反應，並達到較高的再生水平。 <br>
為加速再生化學反應，通常先將再生液加熱至70～80℃。它通過樹脂的流速一般為1～2BV/h。也可採用先快後慢的方法，以充分發揮再生劑的效能。再生時間約為一小時。隨後用軟水順流沖洗樹脂約一小時(水量約4BV)，待洗水排清之後，再用水反洗，至洗出液無色、無混濁為止。 <br>
一些樹脂在再生和反洗之後，要調校pH值。因為再生液常含有鹼，樹脂再生後即使經水洗，也常帶鹼性。而一些脫色樹脂(特別是弱鹼性樹脂)宜在微酸性下工作。此時可通入稀鹽酸，使樹脂pH值下降至6左右，再用水正洗，反洗各一次。 <br>
樹脂在使用較長時間後，由於它所吸附的一部分雜質(特別是大分子有機膠體物質)不易被常規的再生處理所洗脫，逐漸積累而將樹脂污染，使樹脂效能降低。此時要用特殊的方法處理。例如：陽離子樹脂受含氮的兩性化合物污染，可用4%NaOH溶液處理，將它溶解而排掉；陰離子樹脂受有機物污染，可提高鹼鹽溶液中的NaOH濃度至0.5～1.0%，以溶解有機物。 <br>
近年國內研究用糖化鈣溶液對使用過的樹脂進行再生，再生液返回生產流程再用，不需要排放。免除了再生廢液處理的問題。 <br>
（2）特殊的再生處理 <br>
污染較嚴重的樹脂，可用酸或鹼性食鹽溶液反復處理，如先用10%NaCl +1%NaOH鹼鹽溶液溶解有機物，再用4%HCl 或分別用10%NaOH 及1%HCl溶解無機物，隨後再用10%NaCl+1%NaOH處理，在約70℃下進行。 <br>
如果上述處理的效果未達要求，可用氧化法處理。即用水洗滌樹脂後，通入濃度為0.5%的次氯酸鈉溶液，控制流速2～4BV/h，通過量10～20BV，隨即用水洗滌，再用鹽水處理。應當注意，氧化處理可能將樹脂結構中的大分子的連接鍵氧化，造成樹脂的降解，膨脹度增大，容易碎裂，故不宜常用。通常使用50周期後才進行一次氧化處理。由於氯型樹脂有較強的耐氧化性，故樹脂在氧化處理前應用鹽水處理，變為氯型，這還可避免處理過程中的pH值變化，並使氧化作用比較穩定。 <br>

8. 蛋白質水解產物陽離子交換柱層析時的洗脫順序

pI 10.76的那個應該帶正電荷。陽離子交換柱本身帶負電荷。

9. 急求~離子交換柱清洗方法

離子交換層析
Tina 發表於 2006-2-21 12:21:00
材料與儀器

DEAE-32纖維素，pH8.0 0.01 mol/L Tris-HCl，工程菌破碎離心後的上清液；

層析柱

二、 方法與步驟

1） 裝柱：

用水清洗層析柱，柱內留存水距底部約1cm，加入18ml介質（凝膠溶液）。

2） 平衡：

加0.01M,PH8.0,tris-HCl緩沖液，直至流出液PH與緩沖液一致。

3） 上樣：

用量筒量出上清液體積，再加入等體積緩沖液混合，取EP管留1.5ml。待柱中水流出，至剛好覆蓋凝膠表面，靠璧緩慢加樣。

4) 用50ml緩沖液洗滌，用EP管隨機收集樣品穿出液和洗滌穿出液。

5) 洗脫：

將梯度洗滌儀和層析柱連接，洗脫瓶A（混合器）加200µl緩沖液，開口打開至兩瓶液面相平，相通管道出無氣泡，關閉連接，A中加入6gNaCl溶解，把裝置放在梯度混合儀上，開動攪拌器開關，打開A和B的連接通道，層析柱下端連收集器，收集洗脫流出液。

6） 控制流速，約4min/管，2-3ml/管。

分子篩的是凝膠層析
Sephadex G-100凝膠層析
Tina 發表於 2006-2-21 12:27:00
材料與儀器

Sephadex G-100，0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl，濃縮液

層析柱

二、 方法與步驟

1） Sephadex G-100 凝膠預處理

a) 100ml燒杯，稱取5克sephadex G-100,加入50ml去離子水，浸泡溶脹24小時。

b) 傾去sephadex G-100溶脹後凝膠上層的水，加入凝膠等體積的1.0 mol/L NaOH液處理，用攪棒輕輕攪動，並浸泡1小時處理後傾去。用去離子水洗滌。洗滌過程中，用傾去法除去細顆粒。其方法是用攪棒將凝膠攪勻（注意不要過分用力攪拌，以防止顆粒破碎），放置數分鍾，將未沉澱的細顆粒隨上層水倒掉。浮選3-5次，直至上層沒有細顆粒為止，再浸泡水洗至PH中性。

c) 將Sephadex G-100凝膠水溶液盛放於抽濾瓶中，用洗耳球塞住杯口，減壓抽氣30分鍾，除去凝膠溶液內的氣泡，將脫氣後的凝膠溶液輕輕倒入燒杯中，其中盛有1/2去離子水。

2) 裝柱

a) 層析柱(1.0Î50cm)用水清洗干凈，柱的上、下端聯接塑料管接上小乳膠管，裝上螺旋夾。將層析柱垂直裝好。校直過程用下端綁有鑰匙的繩子掛於鐵架的不同位置，從多角度校正使柱垂直。打開柱上埠，從柱底下出口管朝柱內注入水，使柱底全部充滿水而不留氣泡，關閉柱出口。最終柱內留存有2 cm的水。從出口處接上一根直徑2 mm細塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。

b) 攪動凝膠溶液（切勿攪動太快，以免空氣再逸入），使形成均一的薄膠漿，並立即沿玻棒倒入層析管內，讓加入的凝膠在柱內自然沉降，待柱底面上積起約1-2 cm的凝膠床後，打開柱出口水流。隨著柱內水的流出，上面不斷加入凝膠液，使形成的凝膠床面上有凝膠連續下降（如果凝膠床面上不再有凝膠顆粒下降，應該用攪棒均勻地將凝膠床攪起數厘米高，然後再加凝膠，不然就會形成界面，影響層析效果）。

c) 凝膠沉積到柱內凝膠是否均勻，有否「紋路」或氣泡。若層析柱不均一，必須重新裝柱。

3） 平衡

柱裝好後，使層析床穩定15-20分鍾，然後連接洗脫瓶出口和層析柱頂端，用3-5倍體積地緩沖液平衡層析柱。平衡過程中控制上柱緩沖液地進柱操作壓保持恆定。保持流速每滴/10秒。直至流出液的PH與上柱緩沖液完全相同。

4） 樣品洗脫

a) 上樣准備：

i) 上樣前打開層析柱上端，先檢查凝膠床界面是否平整，如果傾斜不平整，可用玻棒將凝膠床界面輕輕攪起後，再使凝膠自然沉降，形成平整狀態的凝膠床界面。用毛細吸管小心吸去大部分清液，然後讓液面自然下降，直至幾乎露出凝膠床界面。

ii) 樣品放入高速離心機，12000r/min、離心5 min。

iii) 上樣前吸取50µl樣品於EP管中，以備走電泳。

b) 樣品上樣：

i) 將樣品由玻棒引流沿管壁加入到凝膠床面上，注意不要將床面凝膠沖起。同時打開層析柱下面流出液開關（控制流速1滴/20秒），保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致，控制凝膠床界面不能脫水，並控制樣品區帶盡量狹窄。

ii) 當1.5ml樣品全部加入後，用 1-2 ml的0.5mol/L PH8.0 Tris-HCl洗脫液同上樣時一樣地保持層析柱下面流出滴速與上樣的滴速一致以控制凝膠床界面不能脫水，小心清洗凝膠床界面表面，使黏附著的樣品全部洗入凝膠床。

iii) 然後開始控制上樣的滴速大於層析柱下面流出滴速，使幾乎與凝膠床界面相平的洗脫液液面慢慢提高至凝膠床界面高出2cm左右，封閉層析柱上端。

iv) 保持層析柱上柱洗脫液入口處與層析柱下面流出處有一定勢壓。控制上柱緩沖液的進柱操作壓保持恆定。

c) 洗脫：

用0.1 mol/L PH8.0 Tris-HCl 緩沖液洗脫，用部分收集器收集，4分鍾/管（約2-3ml/管），收集約1-30管。

5） 酶活、酶濃度測定，參見2.6.2，2.6.3

6） 最高酶活收集管洗脫液留50µl，以備走電泳。

7） 將酶活較高的收集液10~14管合並，測定總體積為7.1 ml，精確測定酶活性。並用考馬思亮藍測定蛋白濃度。測酶活時體系稀釋了200倍，定蛋白時無稀釋。

10. 離子交換層析中流出物質順序是什麼

若用離子交換層析分離物質，以蛋白質為例，離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。

由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。

反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

(10)離子交換柱最大洗脫值擴展閱讀：

對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。

溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。

梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。