蒸餾水與考馬斯亮藍反應

① 考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量的原理是什麼

在酸性條件下，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質疏水區結合，導致最大吸收峰由465 nm 變為595 nm，同時顏色也由棕色變為藍色,該藍色化合物顏色的深淺與蛋白質濃度的高低成正比關系。將蛋白質樣品或稀釋的BSA 與Bradford試劑混合，測量在595 nm處的吸收值，在建立由一系列稀釋的BSA建立的標准曲線的情況下，蛋白質的濃度可以根據標准曲線而確定。

考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合後變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用於蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩定。

該法是1976年Bradford建立，試劑配製簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測2.5μg/mL蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。

考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由於與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。

考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程：

該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的，但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然後，用蒸餾水補充至1000ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

2．標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標准。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

3．將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。

4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現沉澱，過濾除去。

5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．

6．根據標准曲線計算待測樣本的濃度。

② 考馬斯亮藍法測蛋白濃度，具體步驟有哪些，需要什麼試劑

該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的，但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2％影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50m1 95％乙醇，加入100ml濃磷酸，然後，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。
2．標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標准。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug／100ul之間繪制標准曲線。
3．將待測樣本溶於100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現沉澱，過濾除去。
5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30rain。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．
6．根據標准曲線計算待測樣本的濃度。
注意：
考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質通過范德華力結合，反應快速，並且穩定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙

三、 考馬斯亮藍法測定蛋白質含量—標准曲線製作
（一）、試劑：
1、 考馬斯亮藍試劑：
考馬斯亮藍G—250 100mg溶於50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸餾水稀釋至1000ml,濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、 標准蛋白質溶液：
純的牛血清血蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度同0.15mol/LNaCl配製成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度計使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、標准曲線製作：
試管編號 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml標准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考馬斯亮藍試劑 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
搖勻，1h內以1號管為空白對照,在595nm處比色
A595nm
1、

2、以A595nm為縱坐標，標准蛋白含量為橫坐標（六個點為10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐標軸上繪制標准曲線。
1）、利用標准曲線查出回歸方程。
2）、用公式計算回歸方程。
3）、或用origin作圖 ，測出回歸線性方程。即A595nm=a×X( )+6
一般相關系數應過0.999以上，至少2個9以上。
4）、繪圖時近兩使點在一條直線上，在直線上的點應該在直線兩側。
（四）、蛋白質含量的測定：
樣品即所測蛋白質含量樣品（含量應處理在所測范圍內），依照操作步驟1操作，測出樣品的A595nm，然後利用標准曲線或回歸方程求出樣品蛋白質含量。
一般被測樣品的A595nm值在0.1—0.05之間，所以上述樣品如果A595nm值太大，可以稀釋後再測A595nm值，然後再計算。
（五）、注意事項：
1、 玻璃儀器要洗滌干凈。
2、 取量要准確。
3、 玻璃儀器要乾燥，避免溫度變化。
4、 對照：用被測物質以外的物質作空白對照。

③ 考馬斯亮藍G-250測定蛋白質含量應該注意什麼/

考馬斯亮藍與蛋白質結合是一個很快的過程，約2 min即可反應完全，呈現最大光吸收，並可穩定1 h。之後，蛋白質-染料復合物發生聚合並沉澱出來。一般在反應5min後開始測定。

選用的標准品預先用凱氏定氮法准確測得蛋白純度，然後根據需要，用NaCl溶液或蒸餾水配製成標准溶液（含標准蛋白100μg/mL）。

最好用去離子水配製試劑。

先將考馬斯亮藍配製成母液（低溫下可長期放置），工作液要現用現配。都避光、低溫保存。

做標准曲線時，其回歸方程的相關系數應達到3個9(即r值至少為0.999)，標准曲線方可用。試劑或儀器更換，一定重新做標准曲線。

測定樣品的條件一定要與做標准曲線的條件相一致。

蛋白糖化物對考馬斯亮藍法存在干擾，因此，應用考馬斯亮藍法測定含糖基蛋白的製品時需進一步改進。

去污劑（如 Triton X-100、SDS），Tris，NaOH，植物樣品中的酚類、有機酸等，是常見的干擾物。

試驗中所需器皿一定要干凈、乾燥，各試液取量一定要准確。

④ 考馬斯亮藍染液和蒸餾水混合顏色

染色，考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後

⑤ 考馬斯亮藍法測定蛋白質含量實驗中,使用的水一定是蒸餾水嗎為什麼

考馬斯亮藍法測定蛋白質含量實驗中，使用的水最低要求是蒸餾水，更高精度要求可能會使用雙蒸水。

因為Bradford檢測中要用的試劑配製，標准曲線的製作都要用到水。如果不是使用蒸餾水，可能水裡面會有一些游離的離子或者電解質，會影響試劑配製的准確性，干擾實驗結果。而水中殘留的有機物等可能會和考馬斯亮藍發生變色反應，這樣製作的標准曲線會比實際值偏高，導致最終濃度檢測的結果比實際結果偏低。

⑥ 蒸餾水與考馬斯亮藍染液有何現象

染色，考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250
定量結合。當考馬斯亮藍
G-250
與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從
465nm
變為
595nm。

⑦ 怎樣配製 考馬斯亮藍G250蛋白染色劑

考馬斯亮藍G-250的配製：

1.稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶於50 mL 90%乙醇中，

2.加入85%的磷酸100 mL，

3.最後用蒸餾水定容到1 000 mL。

此溶液在常溫下可放置一個月。

(7)蒸餾水與考馬斯亮藍反應擴展閱讀

考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由於與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。

考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程：

該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的，但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然後，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

2．標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標准。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

3．將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。

4．按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現沉澱，過濾除去。

5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．

6．根據標准曲線計算待測樣本的濃度。

⑧ 考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量的原理是什麼

在酸性條件下，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質疏水區結合，導致最大吸收峰由465 nm 變為595 nm，同時顏色也由棕色變為藍色,該藍色化合物顏色的深淺與蛋白質濃度的高低成正比關系。將蛋白質樣品或稀釋的BSA 與Bradford試劑混合，測量在595 nm處的吸收值，在建立由一系列稀釋的BSA建立的標准曲線的情況下，蛋白質的濃度可以根據標准曲線而確定。

考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合後變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用於蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩定。

該法是1976年Bradford建立，試劑配製簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測2.5μg/mL蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。

考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由於與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。

考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程：

該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的，但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然後，用蒸餾水補充至1000ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

2．標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標准。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

3．將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。

4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現沉澱，過濾除去。

5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．

6．根據標准曲線計算待測樣本的濃度。