定氮蒸餾儀測定蛋白質

⑴ 蛋白質凱氏定氮法測定蒸餾中,如果蒸餾時,接收瓶的顏色一直不變化,可能存在哪

可能存在氣接受的時候沒弄好，氨氣都跑走了。

凱氏定氮法是由丹麥化學家凱道爾於1833年建立的，現已發展為常量、微量、平微量凱氏定氮法以及自動定氮儀法等，是分析有機化合物含氮量的常用方法。

凱氏定氮法的理論基礎是蛋白質中的含氮量通常占其總質量的16%左右(12%~一19%),因此，通過測定物質中的含氮量便可估算出物質中的總蛋白質含量(假設測定物質中的氮全來自蛋白質)，即: 蛋白質含量=含氮量/16%。

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來並為過量的硼酸液吸收，再以標准鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。

由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。

⑵ 怎樣 用凱氏定氮儀 測豆奶粉中蛋白質含量

蛋白質測定的國標規定方法——凱氏定氮法介紹

【GB/T 5009.5—1985】
食品中蛋白質的測定方法

本標准適用於各類食品中蛋白質的測定。
1 原理
蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然後鹼化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收後再以硫酸或鹽酸標准溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質含量。
2 試劑
所有試劑均用不含氨的蒸餾水配製。
2.1 硫酸銅。
2.2 硫酸鉀。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶液與1份0.1%次甲基藍乙醇溶液臨用時混合。
2.6 40%氫氧化鈉溶液。
2.7 0.05N硫酸標准溶液或0.05N鹽酸標准溶液。
3 儀器
定氮蒸餾裝置：如圖所示。
（圖略）
4 操作方法
4.1 樣品處理：精密稱取0.2～2.0g固體樣品或2～5g半固體樣品或吸取10～20ml液體樣品(約相當氮30～40mg)，移入乾燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20ml硫酸，稍搖勻後於瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支於有小孔的石棉網上。小心加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止後，加強火力，並保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明後，再繼續加熱0.5h。取下放冷，小心加20ml 水。放冷後，移入100ml容量瓶中，並用少量水洗定氮瓶，洗液並入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白試驗。
4.2 按圖裝好定氮裝置，於水蒸氣發生瓶內裝水至約2/3處，加甲基紅指示液數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。
4.3 向接收瓶內加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，並使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化稀釋液由小玻杯流入反應室，並以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻杯的棒狀玻塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應室，立即將玻塞蓋緊，並加水於小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接受瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾1min。然後用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N鹽酸標准溶液滴定至灰色或藍紫色為終點。
同時吸取10.0ml試劑空白消化液按4.3操作。
4.4 計算

式中：X——樣品中蛋白質的含量，%；
V1——樣品消耗硫酸或鹽酸標准液的體積，ml；
V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標准液的體積，ml；
N——硫酸或鹽酸標准溶液的當量濃度；
0.014——1N硫酸或鹽酸標准溶液1ml相當於氮克數；
m——樣品的質量(體積)，g(ml)；
F——氮換算為蛋白質的系數。蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質，乳製品為6.38，麵粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其製品為5.71，肉與肉製品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為 5.30。
附加說明：
本標准由全國衛生標准技術委員會食品衛生標准分委員會提出，由衛生部食品衛生監督檢驗所歸口。
本標准由衛生部食品衛生監督檢驗所負責起草。

⑶ 試述用凱氏定氮法測定麵粉中蛋白質含量的原理，簡要步驟和計算公式。

測定蛋白質的方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質的物理化學性質來推算，如密度、折射率、紫外吸收、熒光性等；另一類是利用化學方法來計算，如定氮、雙縮脲反應、染料結合反應、酚試劑反應等

主要測定方法有：雙縮脲法、染料結合法、酚試劑法、紫外分光光度法、水揚酸比色法、折光法、旋光法、近紅外光譜法.
目前蛋白質測定最常用的方法是凱氏定氮法，是通過測總氮量來確定蛋白質含量的方法。
凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數而求出蛋白質的含量,此法的結果稱為粗蛋白質含量：由於樣品中含有少量非蛋白質含氮化合物，如核酸、生物鹼、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質的含氮化合物.凱氏定氮法是測定總有機氮量較為准確、操作較為簡單的方法之一，可用於所有動、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時測定多個樣品，故國內外應用較為普遍，是個經典分析方法[6]。至今仍被作為標准檢驗方法.此法可應用於各類食品中蛋白質含量測定
凱氏定氮法可分為全量法、微量法及經改進後的改良凱氏定氮法目前通常以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法樣品質量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。在凱氏法改良中主要的問題是，氮化合物中氮的完全氨化問題及縮短時間、簡化操作的問題，即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦[4].
在理化實驗室,檢驗食品中蛋白質的含量通常用微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法.接下來以大量的試驗來比較微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法的精確度的大小.
1.材料與方法：
1.1試驗材料
1.1.1試驗樣品
麵粉
1.1.2試驗葯品和試劑
所有試劑均為分析純；水為蒸餾水或同等純度的水。
硫酸銅；
硫酸鉀；
濃硫酸；
40％氫氧化鈉溶液：稱取40g氫氧化鈉溶於60mL蒸餾水中；
4％硼酸溶液：稱取4g硼酸溶於蒸餾水中稀釋至lOOmL；
0．1mol／L鹽酸標准滴定溶液；
甲基紅次甲基藍混合指示液：將次甲基藍乙醇溶液(1g／L)與甲基紅乙醇溶液(1g／L)按1+2體積比混合。
1.1.3儀器和設備：
實驗室常規儀器及下列各項：
凱氏燒瓶：500mL；
可調式電爐；蒸汽蒸餾裝置；
鉸肉機：
篦孔徑不超過4nm；
組織搗碎機；
粉碎機；
研缽：玻璃或瓷質；
化學消化器，
凱氏定氮儀，
空氣濾過器
1.2試驗方法
1.2.1微量凱氏定氮法
微量凱氏定氮法的原理
樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然後取消化液的1/10加鹼蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收後再以標准鹽酸或硫酸溶液滴定[2]。根據標准酸消耗量可計算出蛋白質的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個步驟
1.2.2全量凱氏定氮法
全量凱氏定氮法的原理
樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然後取消化液的全部加鹼蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收後再以標准鹽酸或硫酸溶液滴定。根據標准酸消耗量可計算出蛋白質的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個步驟
2 分析過程
試樣制備：固體樣品：取有代表性的樣品至少200g，用研缽搗碎、研細；不易搗碎、研細的樣品應切(剪)成細粒；干固體樣品用粉碎機粉碎；液體樣品：取充分混勻的液體樣品至少200g。粉狀樣品：取有代表性的樣品至少200g(如粉粒較大也應用研缽研細)，混合均勻；糊狀樣品：取有代表性的樣品至少200g，混合均勻；固液體樣品：按固、液體比例，取有代表性的樣品至少200g，用組織搗碎機搗碎，混合均勻；肉製品：取去除不可食部分、具有代表性的樣品至少200g，用鉸肉機至少鉸兩次，混合均勻。上述試樣應放入密閉玻璃容器中，於4°C冰箱內貯存備用，盡快測定。
2.1微量凱氏定氮法的分析過程
2.1.1樣品消化 :
步驟：准確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL、玻璃珠數粒→小心移入乾燥潔凈的500ml凱氏燒瓶中(固體或粉末用紙捲成紙筒送入)，輕輕搖勻，以45º斜支於有小孔的石棉網上→用電爐以小火加熱(或先燒瓶放在距電爐較遠處)，待內容物全部炭化、泡沫停止產生後→加大火力(或將燒瓶放在電爐上)，保持瓶內液體微沸→至液體變藍綠色透明後→繼續加熱微沸30min→關閉電爐，取下燒瓶、冷卻→轉移至100ml容量瓶中，加水定容
2.1.2 蒸餾與吸收：
按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。於水蒸氣發生瓶內裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數滴及硫酸數毫升，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。准確吸取消化液10mL於反應管內，經漏斗再加入10mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾並水封，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水進行蒸餾。指示劑變綠色後繼續蒸餾10min，將冷凝管尖端提離液面繼續蒸1min

⑷ 用凱氏定氮法能檢測出真蛋白質嗎如果能其測定方法具體步驟

凱氏定氮法測的是樣品中的有機氮含量，而除了蛋白質中的氮是有機氮外，還有很多有機物中的氮也是以氨基（-NH3）、亞氨基（-NH-）等有機氮形式存在的，因此只有在已知被測物由蛋白質組成的情況下，才能使用凱氏定氮法來定量蛋白質含氮量。具體測定方法網上很多，在這里不贅述。

⑸ 凱氏定氮法測定蛋白質

提高溶液溫度、催化劑和指示劑、40g/L硼酸、鹽酸

⑹ 測定蛋白質含量只有凱氏定氮法嗎

當然不是
一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法
樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經強鹼鹼化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下：
nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)
2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)
(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)
反應（1）、(2)在凱氏瓶內完成，反應（3）在凱氏蒸餾裝置中進行。
為了加速消化，可以加入cuso4作催化劑，k2so4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。
計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得 樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白
氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、雙縮脲法（biuret法）
（一）實驗原理
雙縮脲（nh3conhconh3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中，雙縮脲與cuso4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個醯胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。
紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。
此法的優點是較快速 ，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用於需要快速，但並不需要十分精確的蛋白質測定。
（二）試劑與器材
1. 試劑：
（1）標准蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（bsa）或標准酪蛋白，配製成10mg/ml的標准蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要，標准蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱量配製成標准蛋白質溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配製，酪蛋白用0．05n naoh配製。
（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（cuso4•5h2o）和6.0克酒石酸鉀鈉（knac4h4o6•4h2o），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀釋到1升，貯存於塑料瓶中（或內壁塗以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉澱出現，則需要重新配製。
2. 器材：
可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。
（三）操作方法
1. 標准曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標准蛋白質溶液，用水補足到1毫升，然後加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻後，在室溫（20～25℃）下放置30分鍾，於540nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標准曲線。
2、樣品的測定：取2～3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。

三、folin—酚試劑法（lowry法）
（一）實驗原理
這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由於其試劑乙的配製較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是：在鹼性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。
folin—酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標准曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應。而且對後者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色後會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。
進行測定時，加folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph條件下穩定，但上述還原反應只在ph=10的情況下發生，故當folin一酚試劑加到鹼性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發生。
此法也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。
此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。
（二）試劑與器材
1.試劑
（1）試劑甲：
（a）10克 na2co3，2克 naoh和0.25克酒石酸鉀鈉 （knac4h4o6•4h2o）。溶解於500毫升蒸餾水中。
（b）0.5克硫酸銅（cuso4•5h2o）溶解於100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（a）與1份（b）混合，即為試劑甲。
（2）試劑乙：在2升磨口迴流瓶中，加入100克鎢酸鈉（na2wo4•2h2o）,25克鉬酸鈉（na2moo4•2h2o）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上迴流管，以小火迴流10小時，迴流結束時，加入150克硫 酸 鋰（li2so4），50毫升蒸餾水及數滴液體溴，開口繼續沸騰15分鍾，以便驅除過量的溴。冷卻後溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置於棕色試劑瓶中保存。使用時用標准naoh滴定，酚酞作指示劑，然後適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1n左右。
（3）標准蛋白質溶液: 精確稱取結晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶於蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶於水若混濁，可改用0.9%nacl溶液。
2. 器材
（1）可見光分光光度計
（2）旋渦混合器
（3）秒錶
（4）試管16支
（三）操作方法
1. 標准曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其餘試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標准蛋白質溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，然後每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，於室溫（20～25℃）放置10分鍾。再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然後在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標准曲線。
注意：因lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲後，開始計時，1分鍾後，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鍾後加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲後若已超過10分鍾，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鍾後第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鍾後加第3支試管，余此類推。待最後一支試管加完試劑後，再放置30分鍾，然後開始測定光吸收。每分鍾測一個樣品。
進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），並按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量（微克）和測得的吸光度值。
folin—酚試劑法實驗表

管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
標准蛋白質 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
（250mg/ml）
未知蛋白質 0.2 0.4 0.6
（約250mg/ml）
蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4
試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管中蛋白質的量（mg）
吸光度值（a700）
2. 樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質20~250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標准曲線的測定放在一起，同時進行。即在標准曲線測定的各試管後面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。
根據所測樣品的吸光度值，在標准曲線上查出相應的蛋白質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。
注意:由於各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用於測定蛋白質的相對濃度（相對於標准蛋白質）。

四、改良的簡易folin—酚試劑法
（一）試劑
1. 試劑甲：鹼性銅試劑溶液中，含0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配製時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解後，最後加入。2. 試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋8倍。
3. 標准蛋白質溶液：同基本法。
（二）操作步驟
測定標准曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鍾後，試劑乙改為4毫升。在55℃恆溫水浴中保溫5分鍾。用流動水冷卻後，在660nm下測定其吸光度值。
改良的快速簡易法，可獲得與 folin—酚試劑法（即lowry基本法）相接近的結果。
五、考馬斯亮蘭法（bradford法）
（一）實驗原理
雙縮脲法（biuret法）和folin—酚試劑法（lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。
1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。
考馬斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的鹼性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。
在595nm下測定的吸光度值a595，與蛋白質濃度成正比。
bradford法的突出優點是：
（1）靈敏度高，據估計比lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合後產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比lowry法要大的多。
（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鍾左右。由於染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鍾即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鍾至20分鍾之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
（3）干擾物質少。如干擾lowry法的k+、na+、mg2+離子、tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等均不幹擾此測定法。
此法的缺點是：
（1）由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用於不同蛋白質測定時有較大的偏差，在製作標准曲線時通常選用 g—球蛋白為標准蛋白質，以減少這方面的偏差。
（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 triton x-100、十二烷基硫酸鈉（sds）和0.1n的naoh。（如同0.1n的酸干擾lowary法一樣）。
（3）標准曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進行計算，而只能用標准曲線來測定未知蛋白質的濃度。
（二）試劑與器材
1. 試劑：
（1）標准蛋白質溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配製成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標准蛋白質溶液。
（2）考馬斯亮蘭g—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g—250，溶於50ml 95%的乙醇後，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。
2. 器材：
（1）可見光分光光度計
（2）旋渦混合器
（3）試管16支
（三）操作方法
1. 標准方法
（1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其餘試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標准蛋白質溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然後用無離子水補充到0.1ml。最後各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難於消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。
（2）加完試劑2-5分鍾後，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值a595，空白對照為第1號試管，即0.1mlh2o加5.0mlg—250試劑。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用後立即用少量95%的乙醇盪洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。

考馬斯亮蘭法實驗表
管 號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
標准蛋白質 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
(1.0mg/ml)
未知蛋白質 0.02 0.04 0.06
(約1.0mg/ml)
蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04
考馬斯亮藍
g－250試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
每管中的蛋
白質量（mg）
光吸收值
（a595）
（3）用標准蛋白質量（mg）為橫座標，用吸光度值a595為縱座標，作圖，即得到一條標准曲線。由此標准曲線，根據測出的未知樣品的a595值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50。
2. 微量法
當樣品中蛋白質濃度較稀時（10－100mg/ml）,可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對照則分別為0.5ml或1.0ml h2o, 考馬斯亮藍g－250試劑仍加5.0ml, 同時作相應的標准曲線，測定595nm的光吸收值。
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。
六、紫外吸收法
蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行蛋白質含量的測定。
紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定後仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（nh4）2so4等和大多數緩沖液不幹擾測定。特別適用於柱層析洗脫液的快速連續檢測，因為此時只需測定蛋白質濃度的變化，而不需知道其絕對值。
此法的特點是測定蛋白質含量的准確度較差，干擾物質多，在用標准曲線法測定蛋白質含量時，對那些與標准蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適於用測定與標准蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當的校正。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在一定的誤差。
此外，進行紫外吸收法測定時，由於蛋白質吸收高峰常因ph的改變而有變化，因此要注意溶液的ph值，測定樣品時的ph要與測定標准曲線的ph相一致。
下面介紹四種紫外吸收法：
1. 280nm的光吸收法
因蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
測定時，將待測蛋白質溶液倒入石英比色皿中，用配製蛋白質溶液的溶劑（水或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質濃度可控制在0.1～1.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標准石英比色皿，盛有濃度為1mg/ml的蛋白質溶液時，a280約為1.0左右。由此可立即計算出蛋白質的大致濃度。
許多蛋白質在一定濃度和一定波長下的光吸收值（a1％1cm）有文獻數據可查，根據此光吸收值可以較准確地計算蛋白質濃度。下式列出了蛋白質濃度與（a1％1cm）值（即蛋白質溶液濃度為1%，光徑為1cm時的光吸收值）的關系。文獻值a1％1cm,?稱為百分吸收系數或比吸收系數。
蛋白質濃度 = (a280′10 )/ a1％1cm,280nm (mg/ml)
(q 1%濃度?10mg/ml)
例：牛血清清蛋白 ： a1％1cm=6.3 (280nm)
溶菌酶： a1％1cm=22.8 (280nm)

若查不到待測蛋白質的a1％1cm值，則可選用一種與待測蛋白質的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質作為標准蛋白質，用標准曲線法進行測定。標准蛋白質溶液配製的濃度為1.0mg/ml。常用的標准蛋白質為牛血清清蛋白（bsa）。
標准曲線的測定：取6支試管，按下表編號並加入試劑：
管號 1 2 3 4 5 6
bsa（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
a280
用第1管為空白對照，各管溶液混勻後在紫外分光光度計上測定吸光度a280，以a280為縱座標，各管的蛋白質濃度或蛋白質量（mg）為橫座標作圖，標准曲線應為直線，利用此標准曲線，根據測出的未知樣品的a280值，即可查出未知樣品的蛋白質含量，也可以用2至6管a280值與相應的試管中的蛋白質濃度計算出該蛋白質的a1％1cm,280nm
2. 280nm和260nm的吸收差法
核酸對紫外光有很強的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質強10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數是280nm處的2倍，而蛋白質則相反，280nm紫外吸收值大於260nm的吸收值。通常：

純蛋白質的光吸收比值：a280/a260 ? 1.8
純核酸的光吸收比值： a280/a260 ? 0.5
含有核酸的蛋白質溶液，可分別測定其a280和a260，由此吸收差值，用下面的經驗公式，即可算出蛋白質的濃度。
蛋白質濃度(mg/ml)=1.45×a280－0.74×a260
此經驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數據來建立的。
3. 215nm與225nm的吸收差法
蛋白質的稀溶液由於含量低而不能使用280nm的光吸收測定時，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標准曲線法來測定蛋白質稀溶液的濃度。
用已知濃度的標准蛋白質，配製成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度值，並計算出吸收差：
吸收差d= a215 －a225
以吸收差d為縱座標，蛋白質濃度為橫座標，繪出標准曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標准曲線上查出未知樣品的蛋白質濃度。
本方法在蛋白質濃度20~100mg/ml范圍內，蛋白質濃度與吸光度成正比，nacl、（nh4）2so4以及0.1m磷酸、硼酸和tris等緩沖液，都無顯著干擾作用，但是0.1n naoh, 0.1m乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥等緩沖液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005m以下才無顯著影響。
4. 肽鍵測定法
蛋白質溶液在238nm處的光吸收的強弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標准蛋白質溶液配製一系列50～500mg/ml已知濃度的5.0ml蛋白質溶液，測定238nm的光吸收值a238，以a238為縱座標, 蛋白質含量為橫座標，繪制出標准曲線。未知樣品的濃度即可由標准曲線求得。
進行蛋白質溶液的柱層析分離時，洗脫液也可以用238nm檢測蛋白質的峰位。
本方法比280nm吸收法靈敏。但多種有機物，如醇、酮、醛、醚、有機酸、醯胺類和過氧化物等都有干擾作用。所以最好用無機鹽，無機鹼和水溶液進行測定。若含有有機溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質，然後用水、稀酸和稀鹼溶解後再作測定。
不過凱式定氮法最常用

⑺ 凱氏定氮儀可以測蛋白質含量嗎

可以。凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣餾出並為過量的酸液吸收，再以標准鹼滴定，就可計算出樣品中的氮量。由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。
凱氏定氮法首先將含氮有機物與濃硫酸共熱，經一系列的分解、碳化和氧化還原反應等復雜過程，最後有機氮轉變為無機氮硫酸銨，這一過程稱為有機物的消化。為了加速和完全有機物質的分解，縮短消化時間，在消化時通常加入硫酸鉀、硫酸銅、氧化汞、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點而加快有機物分解，除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類類提高沸點，但效果不如硫酸鉀。硫酸銅起催化劑的作用。凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多，除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、鉬酸鈉等，但考慮到效果、價格及環境污染等多種因素，應用最廣泛的是硫酸銅。使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機物氧化。消化完成後，將消化液轉入凱氏定氮儀反應室，加入過量的濃氫氧化鈉，將NH4+轉變成NH3，通過蒸餾把NH3驅入過量的硼酸溶液接受瓶內，硼酸接受氨後，形成四硼酸銨，然後用標准鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復原來的氫離子濃度。滴定消耗的標准鹽酸摩爾數即為NH3的摩爾數，通過計算即可得出總氮量。在滴定過程中，滴定終點採用甲基紅-次甲基藍混合指示劑顏色變化來判定。測定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機氮和無機氮。

⑻ 凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量的原理和基本操作方法是什麼

原理：有機含氮化合物與濃硫酸共熱消化，氮轉化為氨，再與硫酸結合成硫酸銨。硫酸銨與強鹼反應，放出氨。將氨蒸餾到過量的標准無機溶液中，再用標准鹼溶液進行滴定。根據測得的氨量，計算樣品的總氮量。

、試劑與材料：

濃硫酸、硫酸鉀-硫酸銅粉末(稱取80g硫酸鉀和20g硫酸銅(五水)，0.3g二氧化硒研細混合)、30%氫氧化鈉溶液、2%硼酸溶液、0.01M標准鹽酸、混合指示劑(田氏指示劑)儲存液(取50ml0.1%甲烯藍乙醇溶液與200ml0.1%甲基紅溶液混合，儲存於棕色瓶中備用。此指示劑在PH5.2為紫色;PH為5.4為暗灰色或灰色;PH5.6為綠色;變色點為PH5.4)、硼酸-田氏指示劑混合液(100ml2%硼酸溶液，滴加約1ml田氏指示劑，搖勻後，溶液呈紫紅色)、蛋白質樣品、容量瓶、吸管、凱氏燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、微量滴定管、電爐

三、操作方法

1、樣品處理：固體樣品，應在105℃乾燥至恆重。液體樣品可直接吸取一定量，也可經適當稀釋後，吸取一定量進行測定，使每一樣品的含氮量在0.2-1.0mg范圍內。

2、消化：取一定量樣品，於50ml乾燥的凱氏燒瓶內。加入300mg硫酸鉀-硫酸銅混合粉末，再加入3ml濃硫酸。用電爐加熱，在通風廚中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加熱，避免泡沫飛濺，不能讓泡沫上升到瓶頸，待泡沫停止發生後，加強火保持瓶內液體沸騰。時常轉動燒瓶使樣品全部消化完全，直至消化液清澈透明。

另取凱氏瓶一個，不加樣品，其它操作相同，作為空白試驗，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質，以對樣品進行校正。

3、蒸餾：將微量凱氏蒸餾裝置洗滌(先用水蒸氣洗滌)干凈。將凱氏燒瓶中的消化液冷卻後，全部轉入100ml的容量瓶，用蒸餾水定容至刻度。

吸取20ml稀釋消化液，置於蒸餾裝置的反應室中，加入10ml30%氫氧化鈉溶液，將玻璃塞塞緊，於漏斗中加一些蒸餾水，作為水封。

取一三角瓶，加入10ml硼酸-田氏指示劑混合液，置於冷凝管之下口，冷凝管口應浸沒在硼酸液面之下，以保證氨的吸收。

加熱水蒸汽發生器，沸騰後，夾緊夾子，凱氏蒸餾。三角瓶中的硼酸-指示劑混合液，吸收蒸餾出的氨，由紫紅色變為綠色。蒸餾15min，讓硼酸液面離開冷凝管口，再蒸1-2min以沖洗冷凝管口。空白試驗按同樣操作進行。

4、滴定：樣品和空白均蒸餾完畢後，用0.01M標准鹽酸滴定，至硼酸-指示劑混合液由綠色變回淡紫色，即為滴定終點。

四、計算 樣品總氮量(mg)=(A-B)×c×14×100/20

式中：A：樣品滴定時消耗的標准鹽酸體積 B：空白滴定時消耗的鹽酸體積 C：標准鹽酸的當量濃度 14：氮的相對分子量 20：用於蒸餾的稀釋消化液體積 100：稀釋消化液的體積

樣品中粗蛋白含量(mg)=樣品總氮量(mg)×6.25

⑼ 凱氏定氮法測定蛋白質含量的基本原理

樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳、氫被氧化為CO2和H2O逸出回，而樣品中的答有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨，硫酸銨用NaOH中和生成NH3`H2O，加熱又分解為氨，用硼酸吸收，吸收氨後的硼酸再以標准鹽酸或硫酸溶液滴定，根據標准酸消耗量計算蛋白質的含量。

⑽ 凱氏定氮儀測定蛋白質的方法確認怎麼做

最關鍵的是計算：

X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%

X：樣品中蛋白內質的百分含量，容g；

V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標准液的體積，ml；

V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標准溶液的體積，ml；

N：硫酸或鹽酸標准溶液的當量濃度；

0.014：1N硫酸或鹽酸標准溶液1ml相當於氮克數；

m：樣品的質量（體積），g（ml）；

F：氮換算為蛋白質的系數。蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質，乳製品為6.38，麵粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其製品為5.71，肉與肉製品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為 5.30。