凝胶过滤技术

❶ 影响凝胶过滤分离效果的有哪些因素，为什么

(1)层析柱的选择
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。

(2)凝胶柱的鉴定
凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。

(3)洗脱液的选择
由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH 范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。

(4)加样量
关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25％。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过(Ve1－Ve2)。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。
从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。

(5)洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2－10 cm/hr，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。

❷ 凝胶过滤方法有什么局限性

葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响(虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子质量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时,需预层析)。

❸ 凝胶过滤层析常用介质有哪些凝胶过滤层析技术有何优点与用途

1.凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。
2.分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100%。
3.分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。
4.应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如SephadexG类为102～105d；Sepharose类为105～108d。
5.分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。

❹ 凝胶过滤技术有哪些具体应用

凝胶过滤色谱法：分辨率较高，但是上样量仅为柱体积的1%，而且对流速也有严格的限制。内离子交换色谱法：根容据目的蛋白质表面所含有的氨基酸残基带有的净电荷分离蛋白质，但是分辨率没有凝胶过滤高。亲和层析法：根据生物分子的特异性分离目的蛋白，特异性很高，但是配件容易丢失适合含有特异性的标签的或者抗体。疏水色谱：根据疏水性来分离蛋白质,缺点是有的蛋白质在高盐中溶解度降低，所以应用范围受到限制，适合蛋白质表面含有较多疏水性氨基酸残基的疏水性蛋白质。

❺ 凝胶过滤层析的原理是什么

基本原理：凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

凝胶层析的特点：

1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质——凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。

2）分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100%。

3）分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。

4）应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102-105 D；Sepharose类为105-108 D。

以上内容参考：网络-凝胶过滤层析

❻ 凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么

答案A 用凝胶过滤柱层析分离蛋白质是根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法,与蛋白质专分子的带属电状况无关.在进行凝胶过滤柱层析过程中,比凝胶网眼大的分子不能进入网眼内,被排阻在凝胶颗粒之外.比凝胶网眼小的颗粒可以进入网眼内,分子越小进入网眼的机会越多,因此不同大小的分子通过凝胶层析柱时所经的路程距离不同,大分子物质经过的距离短而先被洗出,小分子物质经过的距离长,后被洗脱,从而使蛋白质得到分离.

❼ 凝胶过滤层析和离子交换层析分离蛋白质的原理有何不同

所有的层析在原理上都是相通的,区别在于流动相和层析剂之间的作用力的回不同.
离子交换是利用答蛋白质表面的电荷与层析剂上的离子基团的静电作用.
凝胶过滤层析利用了凝胶的多孔性,根据溶剂分子的大小进行分离.

❽ 蛋白质分离纯化的四种方法

1、盐析法：

盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。

2、有机溶剂沉淀法：

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。

3、蛋白质沉淀剂：

蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。

4、聚乙二醇沉淀作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。

(8)凝胶过滤技术扩展阅读：

蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。

机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20% ，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。

人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。

❾ 蛋白质溶液中的盐分为何能通过凝胶过滤方法被脱除

使用凝胶过滤介质Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting（5ml）可用针筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在数分钟为多至10ml样品脱盐。选择孔径很小的凝胶，在过滤时，由于蛋白质分子半径较大，所以不能进入凝胶的孔隙，很容易被洗脱，而粒子则被孔隙所吸附，较难洗脱，所以先出来的是蛋白质

❿ 在操作方面，凝胶过滤与离子交换层析有何异同处

在原理上都是相通的，区别在于流动相和层析剂之间的作用力的不同。
凝胶过滤又名分子筛层析，利用微孔凝胶，将不同分子量的成分分离。
离子交换是利用被分离物质的电荷与层析剂上的离子基团的静电作用。