怎样过滤血清

⑴ 全血分离获得血清的方法及步骤 谢谢

材料与方法

1.1 血清采集 MG患者全血来自～2005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版《中医病证诊断疗效标准》辨证为脾肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。-70 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 主要试剂 固相pH梯度干胶条IPG strip（Amersham公司产品， 非线性pH 3～10， 7 cm）。3-〔3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基〕丙磺酸盐｛3-〔（3-cholamidopropyl） dimethylamino〕-1-propanesul-fonate， CHAPS｝，二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol， DTT），三丁基膦（tributyl phosphine， TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide， IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲双丙烯酰胺（N， N'-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N， N， N， N-tetram-ethyl-ethylenediamine， TEMED），过硫酰胺（am-monium persulfate， APS），三羟甲基氨基甲烷〔tris （hydroxymethyl） aminomethane〕、甘氨酸（glycine， Gly）和十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS）均为Bio-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用MilliQ水配制。

1.3 主要仪器 高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品;EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司产品;P-2000分光光度仪，Hitachi公司产品;SE-600电泳仪，Amersham公司产品;纯水装置，Millipore公司产品;GS-710光密度扫描仪，Bio-Rad公司产品;冷却水循环系统，Cole-Parmer公司产品;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美国Bruker-Daltonics公司产品;LCQ Deca XP Plus，美国Thermo Finnigan公司产品。

1.4 双向电泳

1.4.1 血清总蛋白质的提取及定量 血清-70 ℃反复冻融4次后，用Agilent Multiple Affinity Re-moval Column处理去除高丰度蛋白。使用Agilent 5K超滤管进行浓缩除盐，冻干回收的样品，-70 ℃保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和cocktail酶抑制剂）进行复溶，并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。

1.4.2 等电聚焦 自-20 ℃取出的胶条，室温下平衡10 min，以500 μg上样量在每份样本中加入上样缓冲液（8 mol/L尿素、2% CHAPS、1% Bio-lyte和1% TBP）以及标准蛋白质分子，上样于泡胀槽中，加入矿物油覆盖。程序设置如下:30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h。恒温20 ℃。等电聚焦电泳后IPG胶条在平衡液1（Tris-base 50 mol/L 、尿素 6 mol/L、甘油 30%、SDS 2%、溴酚蓝0.002%和DTT 100 mg）中于振荡器上振荡 15 min; 然后置入平衡液2（成分同平衡液1，用 400 mg 碘乙酰胺代替100 mg DTT）同样于振荡器上振荡15 min。

1.4.3 SDS-PAGE垂直电泳 采用12.5%的均匀SDS2聚丙烯酰胺凝胶（水23.2 ml，30%丙烯酰胺溶液32.46 ml，1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.8 20 ml，10% SDS 0.8 ml，10% APS 0.4 ml，TEMED 3.76 μl，胶总体积80 ml）。将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，胶条一端放入低分子量蛋白质标准，0.5%的琼脂糖封胶。上下槽加入电极缓冲液（Tris 5 mmol/L，Gly 192 mmol/L和SDS 0.1%）。初始电流为每块胶40 mA，电泳20 min，然后以每块胶60 mA电流，直至溴酚蓝前沿。

1.4.4 银染色 电泳结束后，采用硝酸银染色法，通过固定，硝酸银染色，显影，停显及脱色，至背景清晰。

1.5 图像分析 每个样品常规进行3次二维电泳，用GS-710光密度扫描仪对电泳后的胶图分别进行扫描，所得扫描图像输入计算机，采用Image-master软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。选取 Ratio ≥1.5的蛋白质点认为有差异。所有数据的统计分析均采用SPSS 12.0软件，统计学分析采用 t 检验。

1.6 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析 用手术刀片切下胶上目标条带，进行切胶、胶上胰蛋白酶酶解 20 h ，抽提酶解肽段，Zip Tip脱盐后点样，行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）分析（飞行管长2.7 m，加速电压 20 kV ，反射电压23 kV）。将第1级质谱得到的肽片段质量指纹图谱、肽质量指纹图谱与第2级质谱得到的肽序列信息一起用来检索蛋白质数据库，找出匹配的蛋白质。

1.7 数据库检索 将质谱鉴定所得的肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting， PMF）数据于Bio-Works（Thermo Finnigan， San Jose， CA）软件搜索相应的库。搜索使用的数据库为IPI human蛋白库（SEQUEST结果过滤参数为:当Charge+1，Xcorr≥1.9;当Charge+2，Xcorr≥2.2;当Charge+3，Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1）以及NCBI上 Homo sapiens的非冗余蛋白库（rendant data-base）。检索参数为胰蛋白酶解;氨基酸固定修饰方式为脲甲基半胱氨酸;模式为单同位素峰;肽片断最大误差控制在100 ppm;肽片断最大分子量误差为±0.5 Da;每个肽允许有1个不完全裂解位点。

2 结果

2.1 脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱 的建立及分析 经2-DE技术及银染色后，得到了两组血清的双向凝胶电泳图，并于相同的条件下重复实验3次。在正常对照组细胞蛋白质组双向电泳图谱上可观察到1 463±179个蛋白点，而脾肾虚型重症肌无力组可见到1 508±89个蛋白点

⑵ 细胞培养基加了血清后还可以过滤么

1、血清要做灭活处理；
2、灭活后的血清要经过.45和.22虑膜过滤；
3、培养基是不可以紫回外照射的。
还要答注意一点的是血清一般不推荐直接过滤除菌的，如果怀疑血清染菌，过滤时要把血清按比例加入到培养液中，然后才可以过滤除菌！！

⑶ 如何获取血清问题

serum，血清，详细资料见网络http://ke..com/view/42775.htm?fr=aladdin

先纠错，红细胞是血细胞而非生物大分子。

严格的讲，添加了抗凝剂的血液在高速离心机离心后得到的上清液为血浆而非血清，前者与后者相比含有多种凝血因子比如纤维蛋白原或纤维蛋白。离心的方法可以使血液分层，使血细胞（红细胞、白细胞）、血液中的其他成分（血小板、血浆清蛋白、球蛋白等）沉淀于管底，从而获取新鲜血浆。血清可以用离心新鲜胶冻状血凝块获得。

常用的注射器过滤器一般是0.46um和0.22um两种规格，可以过滤掉部分细菌、液体中的杂质等，理论上可以通过过滤方式得到血浆，但实际上没人这么做——因为红细胞直径为6~9um很快就能堵塞过滤器滤孔，使得过滤没法进行；手术中自体血液回输机的过滤不同于普通的注射器过滤器。

综上所述，用注射器过滤得到的血浆和离心机获得的差异不大，但注射器过滤基本上是不可能实现的。

⑷ 细胞培养时，为什么勿直接过滤血清

买来的就已经过滤过除菌了，如果污染了直接扔掉吧，血清过滤起来很费劲的

⑸ 血清是怎样制作的

1、采血：达到放血完全，应选择前腔动脉或静脉放血，注意放血部位的消毒和器具的消毒。
2、析出血清：采用静置自然析出方法，将析出的血清收集到经消毒的生理盐水瓶内，一般装到生理盐水瓶容量的三分之二，为了更完全的分离血清，过夜后还会有血清析出，继续收集。
3、杀灭病毒的处理：将收集好的血清，瓶口向上放入水浴锅56℃水浴2小时，病毒经高温后失活，而在该温度时，抗体效价不下降。
4、杀灭细菌，每毫升加2000单位的链霉素和2000单位的青霉素，充分摇均，封口即可使用。
5、存放，不立即使用时，应冷冻保存。

⑹ 怀疑血清染菌，想用滤膜过滤一下，可否自己用0.22μm滤膜过滤

很难直接过滤，一般要加到培养基中再过滤。我们实验室制备培养基时，都使用滤膜过滤，一般而言如果制备 1-2瓶培养基，一个滤膜及一支30ml注射器可以过滤50ml小牛

⑺ 用离心机分离血清要多长时间

一、要根据分离目标体和分离精度要求结合你的分离设备来确定的，一般分离血清常见的就是小型的试验型离心机分离血清样本。

1、普通生化检查分离血清，这个是用低速离心机转速在3000—3500转。一般在3分钟之内就可以了，分析分离效果，可以酌情调节转速和时间。

2、试验型离心机分离血清生产疫苗，这个有着严格的工艺规范，只能照做，不能随意更改参数。

二、取血后，静置1-2小时，置于离心机内以3000P/m离心15分钟，用移吸管吸出分离的血清（上层乳黄色的上清液），置于4℃冰箱保存。测定时移至室温下30分钟解冻。剩下的应该是血浆了。淋巴细胞不可能从剩下的血浆分离了。

(7)怎样过滤血清扩展阅读：

分离方法：

一般情况下，室温（37度）静置半小时以上,打开离心机，3500-4000rpm离心5-10分钟。分离得到血清。如果测酶等易降解的指标,按需要放4度静置半小时以上，离心。（放置37度一段时间的目的是让血液凝固,析出血清,因为血液凝固后,纤维蛋白收缩,血清就能析出。）

注意事项

离心速度过大,易造成溶血

动物取血,尽量不要粘到毛什么的,易溶血.

为了确保安全和离心效果，仪器必须放置在坚固水平的台面上，工程塑料盖门上不得放置任何物品;样品必须对称放置，并在开机前确保已拧紧螺母。

使用前应检查转子是否有伤痕、腐蚀等现象，同时应对离心杯做裂纹、老化等方面的检查，发现有疑问立即停止使用，并与厂方联系；开机运转前请务必拧紧转头的压紧螺帽，以免高速旋转的转头飞出造成事故。

转速设定不得超过最高转速，以确保机器安全运转。

使用中如果出现0.00或其他数字，机器不运转，应关机断电，10秒后重新开机，待所设转速显示后，再按运转键，机器将照常运转。

⑻ 如何用活性炭处理的血清

我找到的方法如下“
1 活性炭使用前先用预冷的消毒水洗两遍
2 用0.5%右旋糖苷T70配置5%的活性炭悬浮液
3 与血清同体积混合
4 1000g 离心10分钟
5 吸取上清（一部分血清与活性炭颗粒混合）
6 56℃，30分钟，每分钟4次混合这些混合物
7 1000g 20分钟离心这些悬液
8 重复离心两次，取上清液
9 0.22um滤器过滤，-20冻存
但是右旋糖苷T70价格很让人心疼啊，而且我就用一次。

⑼ 请问细胞培养中胎牛血清过滤的详细步骤,

胎牛血清买回来先化开，然后56度半小时灭活，在正常过滤就行。如果你用一次性滤器，内那就先准备容20或50ml的注射器，用注射器抽取，拔掉针头，再把一次性滤器插入注射器出口，把滤出的血清放灭过菌的容器就行，我一般放50ml离心管中，用时也方便，否则血清反复冻融不好，也容易染菌。

⑽ 人和动物血清应该要如何灭菌

酶溶液，可用无菌的过滤器过滤灭菌，根据你的溶液性质和灭菌要求，有0.45um,
0.22um等不同规格的滤器
动物血清可用射线消毒灭菌
主要使用6oco、x射线进行消毒灭菌