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蛋白质加三氯乙酸后加蒸馏水的现象

发布时间:2025-06-04 05:17:18

1. 说明常用蛋白质测定方法的原理,并对各种方法加以比较

1、凯氏定氮法

准备4个50mL凯氏烧瓶并标号,想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品,另外两个烧瓶作为对照,在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物,再加入浓硫酸,将4个烧瓶放到消化架上进行消化。

消化完毕后进行蒸馏,全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量,直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色,即为滴定终点,结算出蛋白质含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法,硫铵不干扰显色, Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nm波长处有最大吸收。

利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线,将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合,并只加入硫酸钠不含血清的试管作对照,将两支试管加入等量的双缩脲试剂,混合后于37℃环境中放置10分钟,在540nm波长进行比色,以对照管调零,读取吸光度值,标准曲线上直接查出蛋白质含量。

3、酚试剂法

取6支试管标号,前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,不加标准蛋白溶液,每支试管液体总量加入蒸馏水补足而保持一致,混合均匀,在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用于测定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号,前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,1号试管不加标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,而不加标准蛋白溶液,每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致,将液体混合均匀,在280nm波长处进行比色,记录吸光度值。

5、考马斯亮蓝法

Bradford浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml85%的磷酸,用蒸馏水补充至200ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定。

标准曲线蛋白质样本的准备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,测定抗体,可用纯化的抗体作为标准。待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

将待测样本溶于缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。按1:4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,出现沉淀,过滤除去。

每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5~30min。染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度。注意,显色反应不得超过30min。根据标准曲线计算待测样本的浓度。

2. 国家标准检测蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定方法就是检测元素的含量,像三聚氰胺的问题,就是通过增加N的含量使“蛋白质”含量提高的。

国家标准检测蛋白质含量的方法叫做凯氏定氮法,食物中的蛋白质在催化加热条件下分解,导致氨和硫酸结合产生硫酸铵。 碱蒸馏采用无硫,硼酸吸收,用硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸耗计算氮含量,再乘以转化系数,即蛋白质含量。

具体操作步骤如下:

1.样品处理

精确称量0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸收10-20ml液体样品(约30-40mg氮当量)。将其转移至干燥的100毫升或500毫升氮气固定瓶中,加入0.2克硫酸铜,6克硫酸钾和20毫升硫酸,轻轻摇动,在瓶口放置一个小漏斗,将瓶子倾斜石棉网上有45度角,有小孔。

加热小火后,内容物碳化,泡沫完全停止,加强火力,保持瓶内液体稍微沸腾,直至液体呈蓝绿色澄清透明,然后继续加热0.5小时。取出并冷却,小心加入20毫升水,冷却,移入100毫升容量瓶中,用少量水洗净氮气瓶,洗净液放入容量瓶中,然后用水冲洗至刻度,混匀备用。

取相同量的硫酸铜,硫酸钾和浓硫酸作为试剂进行空白试验。然而,这种方法很危险,很难在实验室中证明。大多数实验室都有一个消化器,可以一次处理16个以上的样品和一个可以自行设定温度的呼吸机。它更安全,更可操作。

(2)蛋白质加三氯乙酸后加蒸馏水的现象扩展阅读

除了凯氏定氮法以外,标准的测量方法还有:

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm 下测定吸光度值,与标准系列比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量。

样品在900~1200℃下燃烧。在燃烧过程中,产生混合气体。 诸如碳,硫和盐的干扰气体被吸收管吸收,氮氧化物被还原成氮。 形成的氮气流由热导检测器(TCD)检测。

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