酸蒸馏纯化赶酸系统电源220v50hz温度1040℃

Ⅰ 赶酸温度和注意事项

一般赶酸温度不要超过150度，因为长时间加热会对消解管的寿命产生不利影响。

如果测汞，赶酸温度一般在110左右，其他元素在130-150之间都可以。如果觉得赶酸时间太长或者酸气腐蚀太严重，可以考虑真空赶酸系统。在140度下40分钟可以把酸从8ml赶到1ml。并且所有酸蒸汽都被碱液吸收。汞由于沸点偏低，是极易挥发元素，因此前处理过程中控制温度尤为重要。

赶酸仪的使用注意事项：样品处理需要用到各种不同的酸，如盐酸、硝酸等。大部分酸具有挥发性而且对人体有害，因此建议在通风的环境下使用仪器，并做好各种防护措施。使用含HClO4的消解剂时，控制好HClO4量和消解温度等条件，安全才有保障，否则有燃烧、爆炸的危险。

在说明书介绍的工作环境下使用，不用时要拔掉电源，清洁石墨块表面污垢时，要用布轻擦，尽量不使用有机溶剂，不能损坏表面的涂层。仪器长期不用时，按说明书介绍的存储环境存放。

Ⅱ 冰醋酸蒸馏温度

冰醋酸蒸馏温度：16摄氏度。

一般情况下混合物的沸点低于混合物中任意一个组分的沸点，其熔点16 .6℃，沸点117 .9℃，什么温度合适跟其中混有的其他组分的量和其熔沸点有关，如果是水的话在100℃应该没问题，不过对于这些沸点稍高的物质建议回收时采用减压蒸馏。

乙酸二聚物

乙酸的晶体结构显示 ，分子间通过氢键结合为二聚体（亦称二缔结物），二聚体也存在于120℃的蒸汽状态。二聚体有较高的稳定性，已经通过冰点降低测定分子量法以及X光衍射证明了分子量较小的羧酸如甲酸、乙酸在固态及液态，甚至气态以二聚体形式存在。当乙酸与水溶和的时候，二聚体间的氢键会很快的断裂。其它的羧酸也有类似的二聚现象。

以上内容参考：网络-乙酸

Ⅲ 有机实验乙酸乙酯的制备中首次蒸馏为什么要求蒸馏产物为反应物的1/2

常用有机溶剂的纯化-丙酮 沸点56.2℃，折光率1.358 8，相对密度0.789 9。 普通丙酮常含有少量的水及甲醇、乙醛等还原性杂质。其纯化方法有： ⑴于250mL丙酮中加入2.5g高锰酸钾回流，若高锰酸钾紫色很快消失，再加入少量高锰酸钾继续回流，至紫色不褪为止。然后将丙酮蒸出，用无水碳酸钾或无水硫酸钙干燥，过滤后蒸馏，收集55~56.5℃的馏分。用此法纯化丙酮时，须注意丙酮中含还原性物质不能太多，否则会过多消耗高锰酸钾和丙酮，使处理时间增长。 ⑵将100mL丙酮装入分液漏斗中，先加入4mL10%硝酸银溶液，再加入3.6mL1mol/L氢氧化钠溶液，振摇10min，分出丙酮层，再加入无水硫酸钾或无水硫酸钙进行干燥。最后蒸馏收集55~56.5℃馏分。此法比方法⑴要快，但硝酸银较贵，只宜做小量纯化用。常用有机溶剂的纯化－四氢呋喃 沸点67℃(64.5℃)，折光率1.405 0，相对密度0.889 2。四氢呋喃与水能混溶，并常含有少量水分及过氧化物。如要制得无水四氢呋喃，可用氢化铝锂在隔绝潮气下回流（通常1000mL约需2~4g氢化铝锂）除去其中的水和过氧化物，然后蒸馏，收集66℃的馏分蒸馏时不要蒸干，将剩余少量残液即倒出）。精制后的液体加入钠丝并应在氮气氛中保存。处理四氢呋喃时，应先用小量进行试验，在确定其中只有少量水和过氧化物，作用不致过于激烈时，方可进行纯化。四氢呋喃中的过氧化物可用酸化的碘化钾溶液来检验。如过氧化物较多，应另行处理为宜。常用有机溶剂的纯化－二氧六环 沸点101.5℃，熔点12℃，折光率1.442 4，相对密度1.033 6。二氧六环能与水任意混合，常含有少量二乙醇缩醛与水，久贮的二氧六环可能含有过氧化物（鉴定和除去参阅乙醚）。二氧六环的纯化方法，在500mL二氧六环中加入8mL浓盐酸和50mL水的溶液，回流6~10h，在回流过程中，慢慢通入氮气以除去生成的乙醛。冷却后，加入固体氢氧化钾，直到不能再溶解为止，分去水层，再用固体氢氧化钾干燥24h。然后过滤，在金属钠存在下加热回流8~12h，最后在金属钠存在下蒸馏，压入饥丝密封保存。精制过的1,4-二氧环己烷应当避免与空气接触。常用有机溶剂的纯化－吡啶沸点115.5℃，折光率1.509 5，相对密度0.981 9。分析纯的吡啶含有少量水分，可供一般实验用。如要制得无水吡啶，可将吡啶与粒氢氧化钾（钠）一同回流，然后隔绝潮气蒸出备用。干燥的吡啶吸水性很强，保存时应将容器口用石蜡封好。常用有机溶剂的纯化－石油醚石油醚为轻质石油产品，是低相对分子质量烷烃类的混合物。其沸程为30~150℃，收集的温度区间一般为30℃左右。有30~60℃，60~90℃，90~120℃等沸程规格的石油醚。其中含有少量不饱和烃，沸点与烷烃相近，用蒸馏法无法分离。石油醚的精制通常将石油醚用其体积的浓硫酸洗涤2~3次，再用10%硫酸加入高锰酸钾配成的饱和溶液洗涤，直至水层中的紫色不再消失为止。然后再用水洗，经无水氯化钙干燥后蒸馏。若需绝对干燥的石油醚，可加入钠丝（与纯化无水乙醚相同）。常用有机溶剂的纯化－甲醇 沸点64.96℃，折光率1.328 8，相对密度0.791 4。普通未精制的甲醇含有0.02%丙酮和0.1%水。而工业甲醇中这些杂质的含量达0.5%~1%。为了制得纯度达99.9%以上的甲醇，可将甲醇用分馏柱分馏。收集64℃的馏分，再用镁去水（与制备无水乙醇相同）。甲醇有毒，处理时应防止吸入其蒸气。 常用有机溶剂的纯化－乙酸乙酯沸点77.06℃，折光率1.372 3，相对密度0.900 3。乙酸乙酯一般含量为95%~98%, 含有少量水、乙醇和乙酸。可用下法纯化：于1000mL乙酸乙酯中加入100mL乙酸酐，10滴浓硫酸，加热回流4h，除去乙醇和水等杂质，然后进行蒸馏。馏液用20~30g无水碳酸钾振荡，再蒸馏。产物沸点为77℃，纯度可达以上99%。常用有机溶剂的纯化－乙醚沸点34.51℃，折光率1.352 6，相对密度0.713 78。普通乙醚常含有2%乙醇和0.5%水。久藏的乙醚常含有少量过氧化物过氧化物的检验和除去：在干净和试管中放入2~3滴浓硫酸，1mL2%碘化钾溶液（若碘化钾溶液已被空气氧化，可用稀亚硫酸钠溶液滴到黄色消失）和1~2滴淀粉溶液，混合均匀后加入乙醚，出现蓝色即表示有过氧化物存在。除去过氧化物可用新配制的硫酸亚铁稀溶液（配制方法是FeSO4?H2O60g，100mL水和6mL浓硫酸）。将100mL乙醚和10mL新配制的硫酸亚铁溶液放在分液漏斗中洗数次，至无过氧化物为止。醇和水的检验和除去：乙醚中放入少许高锰酸钾粉末和一粒氢氧化钠。放置后，氢氧化钠表面附有棕色树脂，即证明有醇存在。水的存在用无水硫酸铜检验。先用无水氯化钙除去大部分水，再经金属钠干燥。其方法是：将100mL乙醚放在干燥锥形瓶中，加入20~25g无水氯化钙，瓶口用软木塞塞紧，放置一天以上，并间断摇动，然后蒸馏，收集33~37℃的馏分。用压钠机将1g金属钠直接压成钠丝放于盛乙醚的瓶中，用带有氯化钙干燥管的软木塞塞住。或在木塞中插一末端拉成毛细管的玻璃管，这样，既可防止潮气浸入，又可使产生的气体逸出。放置至无气泡发生即可使用；放置后，若钠丝表面已变黄变粗时，须再蒸一次，然后再压入钠丝。常用有机溶剂的纯化－乙醇 沸点78.5℃，折光率1.361 6，相对密度0.789 3。制备无水乙醇的方法很多，根据对无水乙醇质量的要求不同而选择不同的方法。若要求98%~99%的乙醇，可采用下列方法： ⑴利用苯、水和乙醇形成低共沸混合物的性质，将苯加入乙醇中，进行分馏，在64.9℃时蒸出苯、水、乙醇的三元恒沸混合物，多余的苯在68.3与乙醇形成二元恒沸混合物被蒸出，最后蒸出乙醇。工业多采用此法。 ⑵用生石灰脱水。于100mL95%乙醇中加入新鲜的块状生石灰20g，回流3~5h，然后进行蒸馏。若要99%以上的乙醇，可采用下列方法： ⑴在100mL99%乙醇中，加入7g金属钠，待反应完毕，再加入27.5g邻苯二甲酸二乙酯或25g草酸二乙酯，回流2~3h，然后进行蒸馏。金属钠虽能与乙醇中的水作用，产生氢手和氢氧化钠，但所生成的氢氧化钠又与乙醇发生平衡反应，因此单独使用金属钠不能完全除去乙醇中的水，须加入过量的高沸点酯，如邻苯二甲酸二乙酯与生成的氢氧化钠作用，抑制上述反应，从而达到进一步脱水的目的。 ⑵在60mL99%乙醇中，加入5g镁和0.5g碘，待镁溶解生成醇镁后，再加入900mL99%乙醇，回流5h后，蒸馏，可得到99.9%乙醇。由于乙醇具有非常强的吸湿性，所以在操作时，动作要迅速，尽量减少转移次数以防止空气中的水分进入，同时所用仪器必须事前干燥好。 常用有机溶剂的纯化－DMSO 沸点189℃，熔点18.5℃,折光率1.4783，相对密度1.100。二甲基亚砜能与水混合，可用分子筛长期放置加以干燥。然后减压蒸馏，收集76℃/1600Pa(12mmHg)馏分。蒸馏时，温度不可高于90℃，否则会发生歧化反应生成二甲砜和二甲硫醚。也可用氧化钙、氢化钙、氧化钡或无水硫酸钡来干燥，然后减压蒸馏。也可用部分结晶的方法纯化。二甲基亚砜与某些物质混合时可能发生爆炸，例如氢化钠、高碘酸或高氯酸镁等应予注意。常用有机溶剂的纯化－DMF N，N-二甲基甲酰胺 沸点149~156℃，折光率1.430 5，相对密度0.948 7。无色液体，与多数有机溶剂和水可任意混合，对有机和无机化合物的溶解性能较好。 N，N-二甲基甲酰胺含有少量水分。常压蒸馏时有些分解，产生二甲胺和一氧化碳。在有酸或碱存在时，分解加快。所以加入固体氢氧化钾（钠）在室温放置数小时后，即有部分分解。因此，最常用硫酸钙、硫酸镁、氧化钡、硅胶或分子筛干燥，然后减压蒸馏，收集76℃/4800Pa(36mmHg)的馏分。其中如含水较多时，可加入其1/10体积的苯，在常压及80℃以下蒸去水和苯，然后再用无水硫酸镁或氧化钡干燥，最后进行减压蒸馏。纯化后的N，N-二甲基甲酰胺要避光贮存。 N，N-二甲基甲酰胺中如有游离胺存在，可用2，4二硝基氟苯产生颜色来检查。常用有机溶剂的纯化－二氯甲烷沸点40℃，折光率1.424 2，相对密度1.326 6。使用二氯甲烷比氯仿安全，因此常常用它来代替氯仿作为比水重的萃取剂。普通的二氯甲烷一般都能直接做萃取剂用。如需纯化，可用5%碳酸钠溶液洗涤，再用水洗涤，然后用无水氯化钙干燥，蒸馏收集40~41℃的馏分，保存在棕色瓶中。沸点101.5℃，熔点12℃，折光率1.442 4，相对密度1.033 6。二氧六环能与水任意混合，常含有少量二乙醇缩醛与水，久贮的二氧六环可能含有过氧化物（鉴定和除去参阅乙醚）。二氧六环的纯化方法，在500mL二氧六环中加入8mL浓盐酸和50mL水的溶液，回流6~10h，在回流过程中，慢慢通入氮气以除去生成的乙醛。冷却后，加入固体氢氧化钾，直到不能再溶解为止，分去水层，再用固体氢氧化钾干燥24h。然后过滤，在金属钠存在下加热回流8~12h，最后在金属钠存在下蒸馏，压入饥丝密封保存。精制过的1,4-二氧环己烷应当避免与空气接触。常用有机溶剂的纯化－二硫化碳沸点46.25℃，折光率1.631 9，相对密度1.2632。二硫化碳为有毒化合物，能使血液神经组织中毒。具有高度的挥发性和易燃性，因此，使用时应避免与其蒸气接触。对二硫化碳纯度要求不高的实验，在二硫化碳中加入少量无水氯化钙干燥几小时，在水浴55℃~65℃下加热蒸馏、收集。如需要制备较纯的二硫化碳，在试剂级的二硫化碳中加入0.5%高锰酸钾水溶液洗涤三次。除去硫化氢再用汞不断振荡以除去硫。最后用2.5%硫酸汞溶液洗涤，除去所有的硫化氢（洗至没有恶臭为止），再经氯化钙干燥，蒸馏收集。常用有机溶剂的纯化－氯仿沸点61.7℃，折光率1.445 9，相对密度1.483 2。氯仿在日光下易氧化成氯气、氯化氢和光气（剧毒），故氯仿应贮于棕色瓶中。市场上供应的氯仿多用1%酒精做稳定剂，以消除产生的光气。氯仿中乙醇的检验可用碘仿反应；游离氯化氢的检验可用硝酸银的醇溶液。除去乙醇可将氯仿用其二分之一体积的水振摇数次分离下层的氯仿，用氯化钙干燥24h，然后蒸馏。另一种纯化方法：将氯仿与少量浓硫酸一起振动两三次。每200mL氯仿用10mL浓硫酸，分去酸层以后的氯仿用水洗涤，干燥，然后蒸馏。除去乙醇后的无水氯仿应保存在棕色瓶中并避光存放，以免光化作用产生光气。常用有机溶剂的纯化-苯 沸点80.1℃，折光率1.501 1，相对密度0.87865。普通苯常含有少量水和噻吩，噻吩和沸点84℃，与苯接近，不能用蒸馏的方法除去。噻吩的检验：取1mL苯加入2mL溶有2mg吲哚醌的浓硫酸，振荡片刻，若酸层号蓝绿色，即表示有噻吩存在。噻吩和水的除去：将苯装入分液漏斗中，加入相当于苯体积七分之一的浓硫酸，振摇使噻吩磺化，弃去酸液，再加入新的浓硫酸，重复操作几次，直到酸层呈现无色或淡黄色并检验无噻吩为止。将上述无噻吩的苯依次用10%碳酸钠溶液和水洗至中性，再用%C 蒸馏液体沸点在140℃以下时，用水冷凝管；沸点在140℃ 以上者，如用水冷凝管，在冷凝管接头处容易爆裂，故应改用空气冷凝管。蒸馏低沸点易燃或有毒液体时，可在尾接管的支接管接一根长橡皮管，通入水槽的下水管内或引入室外，并将接受瓶在冰水浴中冷却。如果蒸馏出的产品易潮分解，可在尾接管的支管处接一个氯化钙干燥管，以防潮气进入。使用水冷凝管时，冷凝水应从冷凝管的下口流入，上口流出，以保证冷凝管的套管内充满水。水冷凝管的种类很多，常用的为直形冷凝管。 安装仪器的顺序一般都是自下而上，从左到右。要稳妥端正，无论从正面或侧面观察，全套仪器装置的轴线都要在同一平面内。 2．蒸馏操作 加料：将待蒸馏液通过玻璃漏斗小心倒入蒸馏瓶中，要注意不使液体从支管流出。加入几粒助沸物，安好温度计。再一次检查仪器的各部分连接是否紧密和妥善。 加热：用水冷凝管时，先由冷凝管下口缓缓通入冷水，自上口流出引至水槽中，然后开始加热。加热时可以看见蒸馏瓶中的液体逐渐沸腾，蒸气逐渐上升。温度计的读数也略有上升。当蒸气的顶端到达温度计水银球部位时，温度计读数就急剧上升。这时应适当调小煤气灯的火焰或降低加热电炉或电热套的电压，使加热速度略为减慢，蒸气顶端停留在原处，使瓶颈上部和温度计受热，让水银球上液滴和蒸气温度达到平衡。然后再稍稍加大火焰，进行蒸馏。控制加热温度，调节蒸馏速度，通常以每秒1～2滴为宜。在整个蒸馏过程中，应使温度计水银球上常有被冷凝的液滴。此时的温度即为液体与蒸气平衡时的温度，温度计的读数就是液体（馏出物）的沸点。蒸馏时加热的火焰不能太大，否则会在蒸馏瓶的颈部造成过热现象，使一部分液体的蒸气直接受到火焰的热量，这样由温度计读得的沸点就会偏高；另一方面，蒸馏也不能进行得太慢，否则由于温度计的水银球不能被馏出液蒸气充分浸润使温度计上所读得的沸点偏低或不规范。 观察沸点及收集馏液：进行蒸馏前，至少要准备两个接受瓶。因为在达到预期物质的沸点之前，带有沸点较低的液体先蒸出。这部分馏液称为“前馏分”或“馏头”。前馏分蒸完，温度趋于稳定后，蒸出的就是较纯的物质，这时应更换一个洁净干燥的接受瓶接受，记下这部分液体开始馏出时和最后一滴时温度计的读数，即是该馏分的沸程（沸点范围）。一般液体中或多或少地含有一些高沸点杂质，在所需要的馏分蒸出后，若再继续升高加热温度，温度计的读数会显著升高，若维持原来的加热温度，就不会再有馏液蒸出，温度会突然下降。这时就应停止蒸馏。即使杂质含量极少，也不要蒸干，以免蒸馏瓶破裂及发生其他意外事故。 蒸馏完毕，应先停止加热，然后停止通水，拆下仪器。拆除仪器的顺序和装配的顺序相反，先取下接受器，然后拆下尾接管、冷凝管、蒸馏头和蒸馏瓶等

Ⅳ 纯化水设备怎么做安装确认呢

本文来自：深圳市科瑞环保设备有限公司
（一）纯化水设备安装确认所需文件

①由质量部门或技术部门认可的流程图、系统描述及设计参数；

②纯化水设备及管路安装调试记录；

③仪器仪表的鉴定记录；

④设备操作手册及标准操作、维修规程。

（二）纯化水设备安装确认的主要内容

纯化水设备的安装确认主要是根据生产要求，检查水处理设备和管道系统的安装是否合格，检查仪表的校准以及操作、维修规程的编写。

1.纯化水设备的安装确认

纯化水的安装确认是指机器设备安装后，对照设计图纸及供应商的技术资料，检查安装是否符合设计及规范。纯化水处设备主要有机械过滤器、活性炭过滤器、水泵、(蒸馏水机)等，检查的项目有电气、连接管道、蒸汽、仪表、供水、过滤器等的安装、连接情况。

2.纯化水设备管道分配系统的安装确认

（1）管道及阀门的材料

管道选用不锈钢（304、316L等型号）。不锈钢材料的特点是：①钝化后呈化学惰性；②易于消毒；③工作温度范围广。

（2）管道的连接和试压

如前所述，纯化水输送管道应采用热熔式氩弧焊焊接，要求内壁光滑，应检查焊接质量。一般采用自动氩弧热熔式焊机，根据设备手册先确定焊接控制参数，如电流大小、频率等，然后再按照此焊接参数几个接头，如符合要求，以后在安装时可控制在这些焊接参数内，可保证焊缝平整光滑。焊接结束后再用去离子水进行试压，实验压力为工作压力的1.5倍，无渗漏为合格。

（3）管道的清洗、钝化、消毒

不锈钢管道的处理（清洗、钝化、消毒）可大致分为纯化水循环预冲洗→碱液循环清洗→纯化水冲洗→钝化→纯化水再次冲洗→排放→纯蒸汽消毒等几个步骤。

①纯化水循环预冲洗：用一个贮液罐和一台水泵，与需钝化的管道连成一个循环通路，在贮液罐中注入足够的常温去离子水，用水泵加以循环，15min后打开排水阀，边循环边排放，最好能装一只流量计。

②碱液循环清洗：准备NaOH化学纯试剂，加入热水（温度不低于70℃）配置成1%（体积浓度）的碱液，用泵进行循环，时间不少于30min，然后排放。

③冲洗：将纯化水加入，启动水泵，打开排水阀排放，直到各出口点水的电阻率与罐中水的电阻率一致，排放时间至少30min。

④钝化：a.用纯化水及化学纯的硝酸配制8%的酸液，在49～52℃温度下循环60min后排放。b.或用3%氢氟酸（体积分数）、20%硝酸（体积分数）、77%纯化水配制溶液，溶液温度在25～35℃，循环处理10～20min。然后排放。

⑤初始冲洗：用常温纯化水冲洗，时间不少于5min。

⑥最后冲洗：再次冲洗，直到进、出口纯化水的电阻率一致。

⑦纯蒸汽消毒：将清洁蒸汽通入整个不锈钢管道系统，每个使用点至少冲洗15min。

上述清洗、钝化、消毒过程及其参数应加以记录。

（4）完整性试验

贮水罐上安装的各种通气过滤器必须做完整性试验。

（三）仪器仪表的校准

纯化水设备上所有的仪器仪表必须定期校验或认可，使误差控制在允许的范围内。纯化水设备常用的仪表有：电阻（导）仪、时间控制器、流量计、温度控制仪/记录仪、压力表以及分析水质用的各种仪器。需要强调的是紫外灯（UV）等应引起格外的重视，紫外灯校准的参数是：波长、光强度以及显示使用时间的时钟。

（四）操作手册

列出纯化水设备中所有设备操作手册和日常操作、维修单。

注：一般的水处理公司都会上门帮你安装服务的。

Ⅳ 测铅前处理用的硝酸浓度是多大的

测铅前处理用的硝酸浓度是多大的
HNO3-HCLO4消化测量重金属,首先了解湿法消化
湿法消化：又称湿灰化法或湿氧化法，在适量的食品中加入氧化性强酸，并同时加热消煮，使有机物质分解氧化成CO2，水和各种气体，为加速氧化进行，可同时加入各种催化剂，这种破坏食品中有机物质的方法就叫做湿法消化。含有大量有机物的生物样品通常采用混酸进行湿法消解，用于湿法消解的混酸包括HN03-HCLO4、HN03-HCl03-HClO4、HNo3-HClO4-H2SO4、HN03-H2S04、H2SO4-H2O2和HNO3-H202。其中沸点在120℃以上的硝酸是广泛使用的预氧化剂，它可破坏样品中的有机质；硫稿郑拍酸具有强脱水能力，可使有机物炭化，使难溶物质部分降解并提高混合酸的沸点；热的高氯酸是最强的氧化剂和脱水剂，由于其沸点较高，可在除去硝酸以后继续氧化样品。在含有硫酸的混合酸中过氧化氢的氧化作用是基于过一硫酸的形成，由于硫酸的脱水作用，该混合溶液可迅速分解有机物质。当样品基体含有较多的无机物时，多采用含盐酸的混合酸进行消解；而氢氟酸主要用于分解含硅酸盐的样品。酸消化通常在玻璃或聚四氟乙烯容器中进行。由于湿法消解过程中的温度一般较低(<200℃)，待测物不容易发生挥发损失，也不易与所用容器发生反应，但有时会发生待测物与消解混合液中产生的沉淀发生共沉淀的现象，其中最常见的例子就是当用含硫酸的混合酸分解高钙样品时，样品中待测的铅会与分解过程中形成的硫酸钙产生共沉淀，从而影响铅的测定。
做湿法消解时一般用硝酸+高氯酸或浓硫酸+高氯酸,比例一般为4:1,但如果你的样品是高脂肪,高蛋白,高糖的话比例应用5:1,这是防止在加热消解过程中爆沸.消解终点应是开始冒白色烟雾即可,最后再加蒸馏水赶酸,也是有白色烟雾即可.
1、溶液颜色还是处于深棕色时瓶口却开始冒白烟了，这是不是高氯酸挥发没了，这时是应添加适量的硝酸还是硝酸和高氯酸的混合酸（4：1）？并不是高氯酸挥发没了,这时候你应该加适量硝酸,因为高氯酸在制作工艺容易中含有铅污染,如果你样品多加了,而空白没加的话,造成结果偏差.。湿法消解容易造成空白较高，大多数试剂厂家的硝酸含铅量都不低。
2、怎么样控制溶液防止消化过程中炭化，如果出现炭化对结果有多大影响？最好用烧杯并在上面加盖表面皿回流或者用三角瓶上加一漏斗。另外注意消解的温度，刚开始消解时温度不能太高，先在100度消解，等红棕色烟散后慢慢提高温度。硝酸的沸点在130度，高氯酸在200度以上。如果消解时出现碳化的趋势应取下放置到室温后继续加混合酸消解，直到样品清亮透明。.消化过程中颜色一变深就马上加几滴硝酸,让颜色变回来.尽量避免炭化，测定铅的话炭化的影响不大,但要绝对避免烧干,这样铅就跑没了.
3、赶酸时如果白色烟雾没有排净，还需要加水继续赶酸吗？如果赶酸赶不干净的话，是不是对照样的吸光度会偏高？
赶酸与否要看测定的元素还有是否采用火焰等，大部份金属元素湿法消解上AAS是不用赶酸的,但是一定要把溶液里面的氮氧化物(加了硝酸后的那些黄烟)赶掉大部分,一般的话都要求基体要有酸介质,所以不用蒸干,但有的要蒸干再补加盐酸及水..
湿法消解操作简便，可一次处理较大量样品，适用于生物样品中痕量金属元素分析。该法的缺点是：①若要将样品完全消解需要消耗大量的酸，且需高温加热(必要时温度>300℃)，从而导致器壁及试剂给样品带来沾污，消解前将所用容器用1：1HN03加热清洗并将所用酸溶液进行亚沸蒸馏可除去其中的微量金属元素干扰；②某些混酸对消解后元素的光谱测定存在干扰，例如当溶液中含有较多的HClO4或H2SO4时会对丛岩元素的石墨炉原子吸收测定带来干扰，测定前将溶液蒸发至近键羡干可除去此类干扰。3湿法消解时间长，比如猪肉含油脂比较多，相对蔬菜来说比较难消化，茶叶消解过程中会产气泡，途中需取下冷却一下，白酒、黄酒在消解前需先蒸至小体积。目前一种新型的消解技术已越来越受到人们的关注，那就是微波消解。
微波消解原理：通常,介质材料由极性分子和非极性分子组成。在电磁场作用下,极性分子从原来的随机分布状态转向按照电场的极性排列取向。在高频电磁作用下,这些取向按交变电磁场的变化而变化,极性分子在微波电磁场中快速旋转和离子在微波场中的快速迁移、相互摩擦,迅速提高反应物温度,激发分子高速度旋转和振动,使之处于反应的准备状态或亚稳态,促使物质与酸等试剂发生反应被消解。
微波消解技术具有高效快速、试剂用量少、环境污染小等优点。1．加热快、升温高，消解能力强，大大缩短了溶样时间。
消解各类样品可在几分钟—二十几分钟内完成，比电热板消解速度快10-100倍。如凯氏定氮法消解试样需3-6小时，用微波消解只需9-18分钟，快20倍左右。还能消解许多传统方法难以消解的样品，如锆英石。快速消解的原因来自于微波对样品溶液的直接加热和罐内迅速形成的高温高压。这点我们后面还要讲。
2.消耗政溶剂少，空白位低。
消解一个样品一般只需15ml的酸溶液，只有传统方法用酸量的几分之一。因为密闭消解酸不会挥发损失，不必为保持酸的体积而继续加酸，节省了试剂，也大大降低了分析空白值,减少了试剂带入的杂质元素的干扰，空白值明显减小了。
3.避免了挥发损失和样品的沾污，提高了分析的准确度和精密度，回收率实验获得令人满意的结果。
采用密闭的消解罐，避免了样品中或在消解过程中形成的挥发性组份的损失，保证了测量结果的准确性。也避免了样品之间的相互污染和外部环境的污染，适于痕量及超纯分析和易挥发元素（如As、Hg）的检测。电热板上加热挥发性成分跑掉了，空气中的灰尘等落入烧杯，或几个杯子靠近，溅出物相互污染。挥发损失少了，试剂带入的干扰元素少了，受污染的情况也减少了，自然回收率实验更满意。微波消解系统能实时显示反应过程中密闭罐内的压力、温度和时间三个参数。并能准确控制，反应的重复性好，准确度和精密度都提高了。
4.降低了劳动强度，改善了工作环境.
过去，在电热板上煮酸，消解样品，尽管有通风柜，仍然是周围酸雾缭绕。不仅分析人员深受其害，也腐蚀了实验室内其他设备。现在在密闭的罐中消解，挥发的酸大大减少，有效的改善了分析人员的工作环境。由于消解样品的速度加快，分析时间缩短，同时分析的准确度与精密度又得以提高，显著的降低了劳动强度提高了工作效率。
5.节省电的消耗，降低分析成本。
微波密闭消解不仅节省试剂，还节省电能。如：消解1克奶粉，用800W微波加热，只需8分钟消解完毕。而用1.5KW的电热板加热需3个小时，不仅时间缩短到1/22，耗电量也下降到1/26，降低了分析成本。
微波制样具有这许多优点,使它具有极强的生命力。

Ⅵ 为什么可以用水蒸馏法纯化肉桂酸的粗产品

肉桂酸在水里的溶解度小，与水不发生反应，而且有一定的蒸汽压。

Ⅶ 请问有谁知道核酸引物和探针PAGE纯化的步骤

第20章 细胞基因分离鉴定和原位杂交

第一节 细胞DNA、RNA的分离鉴定技术

一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定
人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA，可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的DNA还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法：
(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。
(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。
(3)50℃水浴2小时，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3分钟。
12000r/min离心15分钟（室温）
(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质
12000 r/min离心15分钟（室温）
(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀
12000 r/min离心15分钟（室温）
(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时
12000 r/min离心15分钟（室温）
(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。
(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入Nace至终浓度10mmol/L。
(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。
(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1小时。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。
(二)DNA纯度检测及含量计算
DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.75.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。
取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8
OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。
DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)
DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。
二、培养细胞总RNA的提取及鉴定
细胞中含有三类RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的mRNA的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的mRNA的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取细胞总RNA的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总RNA，也可从总RNA中提取mRNA，从而分析mRNA表达量，建立cDNA文库，以及对mRNA的调控和进行反义RNA研究。
变性液：7mol/L盐酸胍，25m mol/L棕檬酸钠pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巯基乙醇。
水平衡酚：在饱和酚中加入等体积DEPC处理的三蒸水(或新鲜无菌的三蒸水)混匀后去除水相，再重复处理二次即可。
所用玻璃、塑料制品、金属器材可用0.1% DEPC水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用180℃干烤6小时，以去除被污染的RNA酶。
(一)总RNA的提取方法：
1、消化收集细胞方法同前。
2、向离心管中的细胞沉淀物中加1.5mL变性液，立即充分混匀。
3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸钠PH4.0、以及0.05mL氯仿，剧烈振荡混匀30秒后，立即置冰上放置15分钟，4℃ 12000r/min离心15分钟。
4、取水相，加入等体积酚/氯仿(1:1)混匀，剧烈振荡10分钟，4℃12000rpm离心15分钟。
5、取水相，加入等体积氯仿，剧烈振荡10分钟，再同上离心，再如此反复抽提一次后取水相，加入等体积的预冷的异丙醇(或异戊醇)混匀，低温放置20分钟，再同上离心。
6、取沉淀用70%预冷乙醇洗两次，干燥10分钟，溶于DEPC处理的三蒸水中以溶解RNA，分装,-20℃冻存。
(二)总RNA的鉴定及含量计算
1、RNA纯度及含量测定
取少量提取的RNA，经紫外线扫描，吸收峰位于波长260nm处，RNA纯度为OD260/OD280=1.8～2。
OD260值为1的RNA溶液约含有40μg/mL，故RNA浓度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀释倍数。
2、RNA分子量大小鉴定
2.1 配液：
(1)10×MOPS电泳缓冲液配制
将41.2g[2-(N-玛琳代)丙磺碱，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶于800mL经DEPC处理的50mmol/L乙酸钠液中，用2mol/L NaoH调整pH至7.0，加入20mL经DEPC处理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加经DEPC处理的水至总体积为1000mL过滤除菌，避光室温保存。
(2)甲醛加样缓冲液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青FF、
50%甘油
2.2 操作步骤：
(1)制平板胶：1.2%琼脂糖煮沸，冷却至60℃，加入10×MOPS缓冲液及甲醛溶液，使三者的比例为3.5:1.1:1，或三者的终浓度分别为1.2%、1及10%，于室温放置30分钟或更长时间，使胶凝固。
(2)在无菌离心管中混合下列液体。
RNA(最多30μg) 4.5uL
10×MOPS电泳缓冲液 1.0uL
甲醛 3.5uL
65℃温育15分钟，水浴冷却、离心
(3)加入2ul DEPC处理的加样缓冲液上样，进行电泳，5V/cm电压，3小时直到溴酚兰至胶的中部，可用已知RNA标本作分子量标准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)电泳完毕，取出凝胶，浸泡在溴化乙锭溶液中(终浓度0.5g/L)染色30～45分钟，紫外透射仪观察分子量大小。

第二节 核酸蛋白转移电泳及杂交

一、DNA Southern Blot及杂交
本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。
(一)样品DNA内切酶水解
限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37℃ 1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化缓冲液
10×buffer O—无盐：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)
10×bnffer L—低盐：缓冲液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高盐：缓冲液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步骤：
(1)将DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入适量H2O总体积为18μL，混匀。
(2)加入2mL 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。
(3)加1～2U限制性内切酶充分混合。
(4)37℃温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使达到终浓度为10mmol/L终止反应。
(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及杂交。
将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。
1、配液：
(1)变性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaoH调pH至7.0加水至1000ml，高压消毒灭菌。
(4)预杂交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt'S溶液
5mL 5mg/mL鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
82.5mL H2O(总体积为500mL)
(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(组分V)
加H2O至500ml
2、操作步骤(如图20-1)：

图20-1 Southern Blot装置图
(1)内切酶消化的DNA，总体积为50uL，加入10uL加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。
(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。
(3)将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动：
500mL 0.2mol/L HCL 10分钟，水洗若干次
500mL变性液中浸泡15分钟×2
500mL中和溶液浸泡30分钟。
(4)剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶3mm。
(5)剪3～5层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长30～40cm，在一盘中加入数百毫升20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。
(6)逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移24～36小时
(7)取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入2×SSC中5分钟，用滤纸吸干,80℃烘烤2小时。
(8)将该转移膜放在塑料袋中，加入6～10mL预杂交液，排出气泡，封口，42℃ 3小时或过夜。
(9)将标记的DNA探针煮沸5分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为5×105 CPM/ML。
(10)倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42℃ 6h或过夜。
(11)取出转移膜，按以下条件洗膜
1×SSC，0.1%SDS室温2×15分钟
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分钟，气中干燥。
(12)将杂交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自显影2～7天，-70℃。
(13)X片显影、定影，然后读片
结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。
二、RNA Northern Blot及杂交
此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行DNA-RNA杂交，此法是研究RNA(特别是mRNA)的主要方法之一，可测量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 预杂交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Danhardt's液
5mL 5mg/mL 鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
加H2O 至500mL-20℃贮存
Northern 杂交液：500mL预杂交液加入标记探针及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步骤：
(1)RNA变性电泳方法同前
(2)待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于500mL 10×SSC中浸泡45分钟，轻轻摇动。
(3)测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为①横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至20×SSC溶液；②胶；③硝酸纤维素滤膜；④亲和层吸纸；⑤吸水纸；⑥重物、转移4～6小时。
(4)取出滤膜80℃烘烤2小时。
(5)用6～10mL Northern预杂交液，42℃预杂交过夜。
(6)将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入6～10mL Northern杂交液。
(7)去除预杂交液，加入含探针的杂交液，42℃，杂交过夜。
(8)按下列条件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
0.25×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟
(9)曝光于X光片暗盒中放射自显影1天。显影，定影，根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序，也可测含量。
三、蛋白Western Blot及分析
此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。
1、配液：
(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)丽春红S溶液：0.5%丽春红S
1%乙酸
2、操作步骤（如图20-2）：

图20-2 Western Blot装置图

(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。
(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。
(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。
(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。
(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4小时或过夜。
(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。
(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。
(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。
(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。
(10)将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。
结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小，而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量。

第三节 细胞的原位杂交技术

原位杂交(ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，此方法原理是由DNA或RNA的序列与互补的标记单链DNA/RNA探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。
一、探针的制备原则和选择
探针为RNA或双链、单链DNA，双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性，降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组DNA杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。
探针的获得常采用随机引物延伸法的PCR合成和扩增，可获大量的DNA探针，或利用带有噬菌体强启动子多克隆位点的质粒载体来合成RMA探针，也可利用质粒菌扩增质粒，经酶切后纯化的基因片断，均可以获得制备探针原料。这些探针可以用同位素标记，也可以用非同位素标记，即光敏生物标记或地高辛配基标记于脱氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通过随机引物或缺口平移法与探针的核酸分子相连，构成地高辛一配基标记的核酸探针。比探针可用抗地高辛抗体偶联酶或荧光素通过松体结合和底物显色或产生荧光来检测。
这些探针基本均有市售，无需自行制备，只要根据说明书使用即可。
二、载玻片和盖玻片预处理
为了防止探针的非特异贴附而保证细胞粘附而需处理：
1、用于检测RNA的载玻片的处理
(1)用0.1mol/L HCL洗载玻片20分钟，再用无水乙醇洗数次使其干燥。
(2)在下列溶液中，65℃处理2小时
3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分钟，180℃烘烤2小时。
2、用于检测DNA的载玻片的处理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂载玻片。
3、对于盖玻片：于0.1mol/L HCL中浸泡20分钟，用无水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小时。
三、组织细胞固定
理想的细胞固定过程应该保护细胞形态，同时确保目的基因DNA或RNA序列暴露。对于RNA-RNA原位杂交有效的固定剂是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸缓冲液PBS、赖氨酸、过碘酸盐及重酪酸盐）。
1、涂片细胞原位杂交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗涤细胞，于0.1%胰蛋白酶消化，收获细胞计数，涂载玻片上。
(2)若检测RNA，固定于4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分钟，PBS洗5分钟，系列乙醇脱水干燥，-20℃保存。
(3)若检测DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小时，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟，浸泡在下述溶液中2×5分钟：
0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分钟。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃处理10分钟，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃处理15分钟，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分钟。
注意：对于DNA-DNA原位杂交多聚甲醛或福尔马林均可，但对于地高辛检测法必须用4%多聚甲醛，固定至少16小时，而且用蛋白酶K处理，这样可明显减少背景染色。
四、原位杂交
原位杂交与盐浓度、温度、甲酰胺浓度、pH等有关，DNA复性的温度是16～32℃，DNA-RNA原位杂交，25℃最佳，RNA-DNA杂交，可用较高温度，在pH5～9范围内复性率基本上与pH无关。最好选用温和的碱性条件。甲酰胺有机溶剂可降低双链核酸的稳定性，可避免杂交过程中处于过高的温度，防止高温破坏组织。
(一)同位素标记DNA探针的原位杂交
同位素标记的DNA探针，敏感性高，但要注意非特异结合，如35S标记探针在杂交前，用未经标记的dUTP预杂交，可减少非特异，可获较好的细胞内定位，此外还常用3H或125I标记探针，但3H放射线弱，自显影需100天曝光，不太理想，方法如下：
(1)取已形成单层的细胞的盖玻片，悬浮细胞可采用离心法，将细胞粘附到涂有明胶的载玻片上。组织印片，冰冻切片等标本。
(2)将标本浸入甲醇固定5分钟，再过3次4℃预冷的10%三氯醋酸。
(3)将细胞片标本浸入70%乙醇脱水，空气干燥，这时培养细胞盖玻片应该用中性树胶固定于载玻片上，注意细胞面向上。
(4)将细胞片放置在金属盘内，并将托盘放入43℃水浴箱中预热。
(5)直接向固定的细胞面滴加5mL含探针杂交液，然后用16mm盖玻片覆盖，其边缘用橡胶液封闭。
(6)43℃恒温水浴箱内培养18小时，此间保持箱内高湿度，防止因盖玻片封闭不严导致杂交缓冲液干涸。
(7)反应结束后，将玻片置于冰块上，用镊子小心剥下盖玻片周边的橡胶，将载玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使盖玻片脱落。
(8)将载玻片放入湿盒中，加2×SSC溶液浸没玻片，加盖玻片并用胶带封闭湿盒。然后，将湿盒移入水浴箱中53℃处理30分钟。
(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分钟。
(10)玻片浸入70%乙醇脱水，空气干燥。
(11)将干燥后的干燥标本浸入新配制的核4乳胶液（核4乳胶液蒸馏水=1:1），垂直取出玻片，用滤纸擦去背面多余胶，室温干燥5小时（在暗室中进行）。
(12)用黑纸包裹标本放在4℃冰箱曝光（3H标记的探针通常需2～4周，有时需长达100天，可造成高背景，而不理想）。
(13)按常规显影、定影、水洗。
(14)对标本进行Giemsa或HE染色、脱水、封片。
结果分析：镜下观察，如需定量，可在镜下计数银颗粒或拍摄显微照片，用图象分析仪进行灰度分析。
(二)同位素标记RNA探针的原位杂交
RNA探针容易制备，合成率较高，成本低，易纯化，可提高检测敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA杂交比DNA-DNA杂交稳定，能适应更多的条件。
(1)标本处理同前
(2)将RNA标记探针溶于杂交缓冲液中（5×107CPM/ml放射强度）。
50～70%去离子甲酰胺 2×SSC
0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0
200μg/mL变性鱼精DNA 85℃ 5分钟
(3)每张载玻片上滴加杂交液，使每张载玻片探针总量为2×105CPM，用一硅化的盖玻片盖住，封以不透性矿物油，在利于探针的温度下（常为42℃）杂交7～18小时。
(4)用氯仿洗数次，去除矿物油，室温下使盖玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC液，杂交温度下60分钟，室温2×SSC洗5分钟，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除单链RNA，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，0.1×SSC,室温15分钟，室温下用0.1×SSC洗5分钟。
(5)将切片脱水，浸入由1%甘油稀释的放射自显影乳剂（1:1）中，放入暗盒中，在有硅胶干燥剂存在下-70℃，存放5天（或者曝光于X光胶片24～48小时），随后浸于液体乳剂。
(6)用HE染色。
(三)地高辛标记的DNA探针原位杂交
放射性同位素标记探针缺点是有放射损伤，易污染环境，需特殊防护和实验条件，有半衰期受限、标记不稳定及曝光时间长。若改用生物素、乙酰氨基、荧光或地高辛标记可避免，其中以地高辛标记探针最敏感，随机引物标记地高辛，其标记率很高，此探针用于原位杂交可获高敏感性，好的细胞定位以及低背景。非同位标记探针还可以通过双标记原位杂交法，同时测多条DNA序列。
(1)配液：①杂交缓冲液：2×SSC
5%（W/V）磷酸葡聚糖
50%去离子甲酰胺
②缓冲液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5
0.5mol/L Nacl
③缓冲液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5
0.1mol/L Nacl
5mmol/L MgCl2
(2)操作步骤：
①组织标本处理同前。
②将140ng/mL地高辛标记的探针加到杂交缓冲液中，每张滴加50μL杂交缓冲液，用盖玻片盖住，四周封以树胶。
③将目的DNA和DNA探针放入90℃，进行变性10分钟，双链打开，42℃，在潮湿环境中杂交16小时。
④去除盖玻片，按下列条件洗涤：
2×SSC室温10分钟→2×SSC室温10分钟→0.2×SSC室温10分钟→0.2×SSC 42℃ 20分钟。
⑤再按以下方法处理：
1) 在缓冲液I中洗30分钟。
2) 在含有20%羊血清的缓冲液I中洗30分钟。
3) 滴加1:5000标有碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的地高辛抗体，在装有缓冲液I的湿盒中温育20分钟。
4) 在缓冲液I中洗2×20分钟。
5) 在缓冲液II中洗60分钟。
6) 加入下述溶液：缓冲液II
0.33mg/mL 四唑氮兰
0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate
7) 将切片浸于20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA终止反应。
⑥ 用底物显色、复染、脱水、封片，按免疫组化常规法进行。
说明：
(1)用不同浓度和不同温度的盐溶液洗涤是为了去除探针与不完全同源序列杂交，减少非特异性显色，其原则盐浓度由高到低，温度由低到高洗涤，洗涤过程中切勿使切片干燥。
(2)应该有阳性和阴性对照，阳性对照：用该探针与已知含互补序列的组织细胞标本进行杂交。阴性对照：①应用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未标记探针；③不加核酸探针进行杂交（空白对照）；④用不含探针DNA的无关质粒DNA替代探针进行杂交；⑤同义RNA（Sense probe）进行杂交。

Ⅷ 制备乙酰乙酸乙酯纯化过程为什么要用减压蒸馏

乙酰乙酸乙酯的沸点较高，好像180摄氏度，而且乙酰乙酸乙酯在受热的温度超过95摄氏度时就会分解，所以才采取减压蒸馏来提纯（靠蒸馏出来提纯）
原理略：利用乙酸乙酯a-h的活性。。。。。。