蛋白蒸馏系统验证

⑴ 蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中为什么要用硫酸调成酸性

避免挥发性的碱性物质进入蒸馏产物，影响氨的测定。

⑵ 蛋白质提取分离纯化鉴定的实验方案

一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血细胞与血清分离：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm离心20min .弃沉淀,留上清备用(沉淀为血细胞，上部为血清).
2. 乳糜粒分离：4000rpm 10°C离心10分钟,采用密度梯度离心
梯度液配置：离心管下部3/4容积加血浆，上部1/4容积加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮，将乳糜粒吸出,留其余液体备用。
3. 血清蛋白分离：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白质。
5000rpm 10°C离心1h,密度梯度离心
梯度.液配置：管容量1/3为血清，2/3为1。31g/ml,NaCl+NaBr,搅拌后终密度为1。21g/ml .管上部1/6容积为血清脂蛋白，下部5/6为其它蛋白。
4.取2ml下部5/6血清于小试管中,加0.9％氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，加入PBS洗脱液2ml,混匀后于室温中放置10min，此步骤可重复1～2次
3000rpm 离心5min.沉淀物即是ǐ-球蛋白.
二.凝胶层析提纯血清ǐ-球蛋白(1)装柱：海绵垫装入玻璃柱底端,作为柱底支持物,装入定量的蒸馏水(约为柱体积的1/5),以避免胶粒直接冲击柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.将密实洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。边搅拌凝胶,边向柱内缓慢,连续,均匀地加入凝胶,(打开柱底端的螺旋夹)不要中断,使胶粒均匀沉降,以免胶面一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部倾斜和发生断层;检查装好的凝胶柱用眼观察有无凝胶分层.沟流和气泡现象.最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。用缓冲液平衡凝胶柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上样与洗脱：小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析法制备的球蛋白混合样品，将装有上样液的滴管头插入床面以上1-2cm处,小心缓慢地贴壁加到凝胶床表面。柱上样量控制在柱体积的2%-5%.打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。(3)洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加双缩脲2滴，出现蓝色混浊即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂l滴，以观察NH4+出现的情况。 合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。三．纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。四．浓缩经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ－球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干胶，摇动2～3min， 3000r／min 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。五. 乙酸纤维素薄膜电泳鉴定ǐ-球蛋白(一)仪器与薄膜的准备1.醋酸纤维素薄膜的润洗与选择用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。将选好的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后，方可用于电泳。
2.电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，因而称为滤纸桥。
3.电极槽的平衡用平衡装置(或自制平衡管)连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15——20min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。
(二)点样
1.制备点样模板取一张干净滤纸(10×10cm)，在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志区。
2.点样用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液。无光泽面向上平放在点样模板上，使其底边与模板底边对齐。点样区距阴极端1.5cm处。点样时，先用玻璃棒或血色素吸管取2—3�0�8L血清，均匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。
(三).电泳用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)，另一端平贴在阳极端支架上，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA(8片薄膜则为4.8mA)。通电10—15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA(8片共8 mA)，电泳时间约50—80min。电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。
(四).染色与漂洗
1.血清蛋白染色与漂洗脱色用解剖镊子取出电泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min，取出后再用漂洗液浸洗脱色，每隔10min 换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干。
(五)透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡，约2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min，再用滤纸吸干液体石蜡，压平。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。
(六)结果判断与定量血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示出区带，未经透明处理的电泳图谱可直接用于定量测定。可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组分相对百分含

⑶ 蛋白质验证实验

1.实验课题：（ 细胞膜中是否含有蛋白质成分 ）
2.实验目的：（ 验证细胞膜中是否含有蛋白质成分 ）
3.实验原理：（ 双缩脲试剂与蛋白质结合变成紫色 ）
4.实验材料：细胞膜样液、蒸馏水、洁净试管、双缩脲试剂等.
5.实验步骤：
第一步：取洁净的试管2支,编号甲、乙.
第二步：向甲试管中滴加2mL的细胞膜样液,（ 向乙试管中也滴加2mL的细胞膜样液） ）.
第三步：（ 向甲试管中加入适量的双缩脲试剂,向乙试管中加入等剂量的蒸馏水）
6.实验现象：（ 甲试管中样液变紫 ）.
7.实验结论：（ 细胞膜中含有蛋白质成分 ）.只求实验步骤.括号里为本人添加设计的实验步骤内容,因与参考答案不一致,故来求教.本人设计乙管是为空白对照,就如蛋白质鉴定实验中也最好设置空白对照,以使实验更具说服力.我认为设计的妥,还望网友来点评指教,

⑷ 蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为何要用硫酸调成酸性

防止氮元素生成氨气挥发。

⑸ 蛋白质的蒸馏操作,正确方法是

加入过量的氢氧化钠
先加接受瓶再蒸馏
在小玻杯中加入水防漏气

⑹ 说明常用蛋白质测定方法的原理,并对各种方法加以比较

1、凯氏定氮法

准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化。

消化完毕后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。

利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并只加入硫酸钠不含血清的试管作对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，标准曲线上直接查出蛋白质含量。

3、酚试剂法

取6支试管标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量加入蒸馏水补足而保持一致，混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

5、考马斯亮蓝法

Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，出现沉淀，过滤除去。

每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。根据标准曲线计算待测样本的浓度。

⑺ “蛋白质的鉴定”实验怎么做

实验一 生物组织中脂肪,蛋白质的鉴定
一,实验原理
(1)鉴定实验设计的理念:
某些化学试剂 + 生物组织中有关有机化合物 产生特定的颜色反应.
(2)具体原理:
1、脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒.
2、蛋白质 + 双缩脲试剂→紫色反应.
二,目标要求
初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法.
三,重点,难点
1.重点
①初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法.
②通过实验的操作和设计培养学生的动手能力,掌握探索实验设计技巧,从而培养创新思维能力.
2.难点
根据此实验方法,原理,设计实验来鉴定常见食物的成分.
四,实验材料
1.脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h).
2.蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆,或用鸡蛋蛋白).
五,仪器,试剂
1.仪器:剪刀,解剖刀,双面刀片,试管,试管架,试管夹,大小烧杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精灯,三脚架,石棉网,火柴,研钵,石英砂,纱布,载玻片,盖玻片,毛笔,吸水纸,显微镜.
2.试剂：1苏丹Ⅲ染液;2双缩脲试剂;3 体积分数为50%的酒精溶液;4蒸馏水.
六,方法步骤
（1）脂肪的鉴定
脂肪的鉴定步骤:
取材:花生种子(浸泡3-4h),将子叶削成薄片
取理想薄片
在薄片上滴2-3滴苏丹Ⅲ染液
去浮色
制成临时装片
观察:先在低倍镜下,找到材料的脂肪滴,然后,转为高倍镜观察.
结论:细胞中的圆形脂肪小颗粒已经被染成橘黄色.
实验成功的要点:
①.脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h).
②该试验成功的关键是获得只含有单层细胞理想薄片.
③滴苏丹Ⅲ染液染液染色2-3min,时间不宜过长,以防细胞的其他部分被染色.
（2）蛋白质的鉴定
蛋白质的鉴定步骤:
选材:卵清稀释液或黄豆(浸泡1-2d) 豆浆 滤液

结论:蛋白质与双缩脲试剂发生紫色反应.
2,实验成功的要点:
①蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆,或用鸡蛋蛋白稀释液).
②双缩脲试剂的使用,一定要先加入A液(即0.1 g/ml的 NaOH 溶液),再加入双缩脲试剂B液(即0.01 g/ml的 CuSO4 溶液).
③还可设计一只加底物的试管,不加双缩脲试剂,进行空白对照,说明颜色反应的引起是蛋白质的存在与双缩脲试剂发生反应,而不是空气的氧化引起.

⑻ 验证细胞膜中有蛋白质，用细胞膜样液、蒸馏水、试管、滴管、双缩脲试济，怎样验证请详细一点。谢谢！

将细胞膜样液用蒸馏水稀释后，取2ml加入试管，加入2ml双缩脲试剂A液，使细胞样液呈碱性，再用滴管滴入双缩脲试剂B液2~3滴，振荡试管，若试剂呈紫色，则证明细胞膜样液稀释液中有蛋白质。

⑼ 蛋白质鉴定实验

实验一 生物组织中脂肪,蛋白质的鉴定
一,实验原理
(1)鉴定实验设计的理念:
某些化学试剂 + 生物组织中有关有机化合物 产生特定的颜色反应.
(2)具体原理:
1、脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒.
2、蛋白质 + 双缩脲试剂→紫色反应.
二,目标要求
初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法.
三,重点,难点
1.重点
①初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法.
②通过实验的操作和设计培养学生的动手能力,掌握探索实验设计技巧,从而培养创新思维能力.
2.难点
根据此实验方法,原理,设计实验来鉴定常见食物的成分.
四,实验材料
1.脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h).
2.蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆,或用鸡蛋蛋白).
五,仪器,试剂
1.仪器:剪刀,解剖刀,双面刀片,试管,试管架,试管夹,大小烧杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精灯,三脚架,石棉网,火柴,研钵,石英砂,纱布,载玻片,盖玻片,毛笔,吸水纸,显微镜.
2.试剂：1苏丹Ⅲ染液;2双缩脲试剂;3 体积分数为50%的酒精溶液;4蒸馏水.
六,方法步骤
（1）脂肪的鉴定
脂肪的鉴定步骤:
取材:花生种子(浸泡3-4h),将子叶削成薄...实验一 生物组织中脂肪,蛋白质的鉴定
一,实验原理
(1)鉴定实验设计的理念:
某些化学试剂 + 生物组织中有关有机化合物 产生特定的颜色反应.
(2)具体原理:
1、脂肪小颗粒 + 苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒.
2、蛋白质 + 双缩脲试剂→紫色反应.
二,目标要求
初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法.
三,重点,难点
1.重点
①初步掌握鉴定生物组织中脂肪,蛋白质的基本方法.
②通过实验的操作和设计培养学生的动手能力,掌握探索实验设计技巧,从而培养创新思维能力.
2.难点
根据此实验方法,原理,设计实验来鉴定常见食物的成分.
四,实验材料
1.脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h).
2.蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆,或用鸡蛋蛋白).
五,仪器,试剂
1.仪器:剪刀,解剖刀,双面刀片,试管,试管架,试管夹,大小烧杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精灯,三脚架,石棉网,火柴,研钵,石英砂,纱布,载玻片,盖玻片,毛笔,吸水纸,显微镜.
2.试剂：1苏丹Ⅲ染液;2双缩脲试剂;3 体积分数为50%的酒精溶液;4蒸馏水.
六,方法步骤
（1）脂肪的鉴定
脂肪的鉴定步骤:
取材:花生种子(浸泡3-4h),将子叶削成薄片
取理想薄片
在薄片上滴2-3滴苏丹Ⅲ染液
去浮色
制成临时装片
观察:先在低倍镜下,找到材料的脂肪滴,然后,转为高倍镜观察.
结论:细胞中的圆形脂肪小颗粒已经被染成橘黄色.
实验成功的要点:
①.脂肪的鉴定实验:选择富含脂肪的种子,以花生种子为最好(实验前浸泡3h～4h).
②该试验成功的关键是获得只含有单层细胞理想薄片.
③滴苏丹Ⅲ染液染液染色2-3min,时间不宜过长,以防细胞的其他部分被染色.
（2）蛋白质的鉴定
蛋白质的鉴定步骤:
选材:卵清稀释液或黄豆(浸泡1-2d) 豆浆 滤液

结论:蛋白质与双缩脲试剂发生紫色反应.
2,实验成功的要点:
①蛋白质的鉴定实验:可用浸泡1d～2d的黄豆种子(或用豆浆,或用鸡蛋蛋白稀释液).
②双缩脲试剂的使用,一定要先加入A液(即0.1 g/ml的 NaOH 溶液),再加入双缩脲试剂B液(即0.01 g/ml的 CuSO4 溶液).
③还可设计一只加底物的试管,不加双缩脲试剂,进行空白对照,说明颜色反应的引起是蛋白质的存在与双缩脲试剂发生反应,而不是空气的氧化引起.

⑽ 蛋白质的鉴定

双缩脲反应产物双缩脲结构双缩脲试剂是由双缩脲试剂A和双缩脲试剂B两种试剂组成. 双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的水溶液； 双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的水溶液。 双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在。 具体方法是： 先将双缩脲试剂A加入组织样液，摇荡均匀（必须营造碱性环境），再加入双缩脲试剂B，摇荡均匀。如果组织里含有蛋白质，那么会看到溶液变成紫色。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应。蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的化合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。 双缩脲试剂本是用来检测双缩脲，因蛋白质中也有-CONH-基也可用于检验蛋白质，与蛋白质接触后的颜色呈紫色。

转自网络