凯氏蒸馏装国标

㈠ 凯氏定氮法在蒸馏时为什么吸收液一直未变成蓝绿色

溴甲酚绿-甲基红混合指示剂在碱性溶液中呈绿色、蓝绿色。没变色说明吸收液版中氨的量不够，有可能的原因权:蒸馏时加入的NaOH量不够；漏斗下端未保持液封，有氨逸出；微量凯氏定氮蒸馏装置的密封性不好；消化时加入的硫酸钾过多，使消化体系温度过高，引起已生成的铵盐发生热分解而造成氨损失。

㈡ 国家标准检测蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定方法就是检测元素的含量，像三聚氰胺的问题，就是通过增加N的含量使“蛋白质”含量提高的。

国家标准检测蛋白质含量的方法叫做凯氏定氮法，食物中的蛋白质在催化加热条件下分解，导致氨和硫酸结合产生硫酸铵。 碱蒸馏采用无硫，硼酸吸收，用硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸耗计算氮含量，再乘以转化系数，即蛋白质含量。

具体操作步骤如下：

1.样品处理

精确称量0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸收10-20ml液体样品（约30-40mg氮当量）。将其转移至干燥的100毫升或500毫升氮气固定瓶中，加入0.2克硫酸铜，6克硫酸钾和20毫升硫酸，轻轻摇动，在瓶口放置一个小漏斗，将瓶子倾斜石棉网上有45度角，有小孔。

加热小火后，内容物碳化，泡沫完全停止，加强火力，保持瓶内液体稍微沸腾，直至液体呈蓝绿色澄清透明，然后继续加热0.5小时。取出并冷却，小心加入20毫升水，冷却，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗净氮气瓶，洗净液放入容量瓶中，然后用水冲洗至刻度，混匀备用。

取相同量的硫酸铜，硫酸钾和浓硫酸作为试剂进行空白试验。然而，这种方法很危险，很难在实验室中证明。大多数实验室都有一个消化器，可以一次处理16个以上的样品和一个可以自行设定温度的呼吸机。它更安全，更可操作。

(2)凯氏蒸馏装国标扩展阅读

除了凯氏定氮法以外，标准的测量方法还有：

• 分光光度法

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量,结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。

• 燃烧法

样品在900~1200℃下燃烧。在燃烧过程中，产生混合气体。 诸如碳，硫和盐的干扰气体被吸收管吸收，氮氧化物被还原成氮。 形成的氮气流由热导检测器（TCD）检测。

㈢ 凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳、氢被氧化为CO2和H2O逸出回，而样品中的答有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵用NaOH中和生成NH3`H2O，加热又分解为氨，用硼酸吸收，吸收氨后的硼酸再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量计算蛋白质的含量。

㈣ 凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量的原理和基本操作方法是什么

原理：有机含氮化合物与浓硫酸共热消化，氮转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵。硫酸铵与强碱反应，放出氨。将氨蒸馏到过量的标准无机溶液中，再用标准碱溶液进行滴定。根据测得的氨量，计算样品的总氮量。

、试剂与材料：

浓硫酸、硫酸钾-硫酸铜粉末(称取80g硫酸钾和20g硫酸铜(五水)，0.3g二氧化硒研细混合)、30%氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液、0.01M标准盐酸、混合指示剂(田氏指示剂)储存液(取50ml0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1%甲基红溶液混合，储存于棕色瓶中备用。此指示剂在PH5.2为紫色;PH为5.4为暗灰色或灰色;PH5.6为绿色;变色点为PH5.4)、硼酸-田氏指示剂混合液(100ml2%硼酸溶液，滴加约1ml田氏指示剂，摇匀后，溶液呈紫红色)、蛋白质样品、容量瓶、吸管、凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、微量滴定管、电炉

三、操作方法

1、样品处理：固体样品，应在105℃干燥至恒重。液体样品可直接吸取一定量，也可经适当稀释后，吸取一定量进行测定，使每一样品的含氮量在0.2-1.0mg范围内。

2、消化：取一定量样品，于50ml干燥的凯氏烧瓶内。加入300mg硫酸钾-硫酸铜混合粉末，再加入3ml浓硫酸。用电炉加热，在通风厨中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加热，避免泡沫飞溅，不能让泡沫上升到瓶颈，待泡沫停止发生后，加强火保持瓶内液体沸腾。时常转动烧瓶使样品全部消化完全，直至消化液清澈透明。

另取凯氏瓶一个，不加样品，其它操作相同，作为空白试验，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。

3、蒸馏：将微量凯氏蒸馏装置洗涤(先用水蒸气洗涤)干净。将凯氏烧瓶中的消化液冷却后，全部转入100ml的容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。

吸取20ml稀释消化液，置于蒸馏装置的反应室中，加入10ml30%氢氧化钠溶液，将玻璃塞塞紧，于漏斗中加一些蒸馏水，作为水封。

取一三角瓶，加入10ml硼酸-田氏指示剂混合液，置于冷凝管之下口，冷凝管口应浸没在硼酸液面之下，以保证氨的吸收。

加热水蒸汽发生器，沸腾后，夹紧夹子，凯氏蒸馏。三角瓶中的硼酸-指示剂混合液，吸收蒸馏出的氨，由紫红色变为绿色。蒸馏15min，让硼酸液面离开冷凝管口，再蒸1-2min以冲洗冷凝管口。空白试验按同样操作进行。

4、滴定：样品和空白均蒸馏完毕后，用0.01M标准盐酸滴定，至硼酸-指示剂混合液由绿色变回淡紫色，即为滴定终点。

四、计算 样品总氮量(mg)=(A-B)×c×14×100/20

式中：A：样品滴定时消耗的标准盐酸体积 B：空白滴定时消耗的盐酸体积 C：标准盐酸的当量浓度 14：氮的相对分子量 20：用于蒸馏的稀释消化液体积 100：稀释消化液的体积

样品中粗蛋白含量(mg)=样品总氮量(mg)×6.25

㈤ 凯氏定氮法，为什么蒸馏时，液体变成蓝绿色透明后，还要继续加热

一、实验原理
蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液 滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。含氮量*6.25=蛋白含量
1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4

凯氏定氮法
凯氏定氮法反应式为：
2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为:
(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4

2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量

反应式为：

(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

二、操作
1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。但是此法比较危险，不易在实验室演示，现在大多数实验室有消煮仪一次可以进行多个（一次可以消煮16个样品）样品处理，并有通风橱进行通风，温度可以自己设定，更加安全和可操作性，因此逐步成为主要的凯氏定氮法的首选处理方法。
一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解。
2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红 指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
3、向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，不能立即将玻璃盖塞紧，这样易使玻璃塞粘在进样口，应先用蒸馏水冲洗然后再盖，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。

三、计算
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
X：样品中蛋白质的百分含量，g；
V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积），g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数 。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。

㈥ 凯氏法测定氮

方法提要

试样在硫酸钾、硫酸铜和硒的共存下，用硫酸煮解氧化，使试样中的氮转化为硫酸铵，再用氢氧化钠碱化后，加热蒸馏逸出氨，经硼酸溶液吸收，用盐酸标准溶液滴定并计算试样中氮的含量。

方法适用于水系沉积物及土壤中氮量的测定。

方法检出限(3s):0.002%。

测定范围:0.006%～0.4%。

仪器及装置

通用的凯氏定氮蒸馏装置。

凯氏烧瓶50mL。

锥形瓶150mL。

试剂

硫酸。

氢氧化钠溶液(400g/L)。

盐酸溶液c(HCl)=1mol/L量取84mLHCl，用水稀释至1000mL。

(1+1)王水75mLHCl和25mLHNO₃混合后，加入100mL水混匀。用时配制。

混合加速剂将硫酸钾(K₂SO₄)和硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)按(10+1)比例，在玻璃研钵中研磨混匀，装入宽口玻璃瓶中。

硒溶液ρ(Se)=10.0g/L称取5.0g优级纯硒粉置于250mL烧杯中，加入10mL(1+1)王水溶解后，用水稀释至500mL，摇匀。装入磨口玻璃瓶中备用。

硼酸溶液称取20g硼酸溶解在1000mL水中。

甲基红-溴甲酚绿混合指示剂称取0.1g甲基红和0.5g溴甲酚绿，溶解在100mL乙醇中，移入玻璃瓶中备用。变色范围:pH4.4(红色)～pH5.4(蓝色)。

含有甲基红、溴甲酚绿指示剂的硼酸混合溶液取100mL硼酸溶液，加入2mL甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，用氢氧化钠溶液及盐酸溶液调节溶液呈紫红色，此时该溶液的pH为4.5。

硼砂标准溶液c(1/2Na₂B₄O₇)=0.0200mol/L称取1.9068g硼砂(Na₂B₄O₇·10H₂O)置于250mL烧杯中，加100mL水，溶解后移入500mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

盐酸标准溶液吸取20mL1mol/LHCl溶液置于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

标定分取20.00mL硼砂标准溶液置于150mL锥形烧杯中，加1滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，用盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝色变为紫红色为终点。同时分取20.0mL水作空白试验。按下式计算盐酸标准溶液浓度:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L;0.0200为硼砂标准溶液的浓度数值，单位用了mol/L;V₁为硼砂标准溶液的体积，mL;V₂为滴定消耗盐酸标准溶液的体积，mL;V₀为滴定空白试验溶液消耗盐酸标准溶液的体积，mL。

分析步骤

试样的煮解。称取0.1～1.0g(精确至0.0001g)试样(粒径小于0.075mm，经室温干燥后，装入磨口小玻璃瓶中备用)置于50mL凯氏烧瓶中，加入2g混合加速剂及1mL硒溶液，加少许水润湿，加入5mLH₂SO₄，瓶口放一小漏斗，于通风柜内，在调温电炉上先低温加热，待溶液中无泡沫发生(约需15min)后，再升高温度，使瓶内硫酸蒸汽回流的高度控制在瓶颈上部的1/3处，要经常摇动凯氏烧瓶，直至试样和煮解液完全变为灰白带绿色(约需15min)后，再继续煮解1h。全部煮解时间需85～90min，切勿煮干。煮解完毕，取下凯氏烧瓶，冷却，以待蒸馏。

蒸馏。在150mL锥形瓶中加入5mL硼酸混合溶液，将其套在凯氏定氮蒸馏装置的下端，端口置于硼酸混合溶液液面以下3～4cm处。把煮解液全部转入蒸馏器的内室，并用水冲洗凯氏烧瓶4次，冲洗液用量不要超过40mL，打开冷却水，经三通管加入20mLNaOH溶液，立即关闭蒸馏室，打开蒸气夹，用蒸气蒸馏。当锥形瓶内的馏出液达到50～55mL(约需8～10min)后，用广泛pH试纸置冷却管口碰触蒸馏液，如无碱性反应，表示氨已蒸馏完毕。若仍为碱性反应，应继续蒸馏直至无碱性反应。同时进行空白试验的蒸馏。

滴定。已蒸馏在150mL锥形瓶吸收的氨溶液，用盐酸标准溶液滴定，滴定至溶液由蓝色突跃变为紫红色即为滴定终点，记录盐酸标准溶液的体积。同时进行空白试验的蒸馏及其吸收液的滴定，记录盐酸标准溶液的体积。

按下式计算氮的含量:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:w(N)为氮的质量分数，%;V为滴定试样溶液消耗盐酸标准溶液的体积，mL;V₀为滴定空白溶液消耗盐酸标准溶液的体积，mL;c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L;0.014为氮原子的毫摩尔质量的数值，单位用g/mmol;m为试样的质量，g。

注意事项

本方法测得的氮不包括硝态氮、亚硝态氮。因硝酸根离子在煮解过程中不会完全还原为铵离子，且易挥发损失。但一般土壤试样中硝态氮含量不超过全氮量的1%，故可以忽略不计。

㈦ 有谁知道凯氏定氮的具体步骤，注意事项，！！

1、消化:精密称取大豆样品1.0g左右，放入干燥的250 ml消化管中，加入0.4g CuSO4 7g K2SO4 10ml H2SO4先200'C炭化，待泡沫停止后提高温度到450'C，加热至液体沸腾，待瓶内液体呈蓝绿色透明后，再继续加热0.5h。

冷却后加入20ml水，移入100ml容量瓶中，用少量水洗涤消化管2~3次，洗液合并于容量瓶中定容。

2、蒸馏:连接凯氏定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及数ml硫酸，保持水呈酸性。加入数粒玻璃珠以防暴沸，调节火力加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

3、向吸收瓶内加入20g/L硼酸溶液20ml及混合指示剂2滴，并使冷凝管下端插入液面以下，吸取10ml样品消化稀释液由进样口进入反应室，并以10ml水洗涤进样口使其流入反应室内，将400g/L NaOH溶液10ml倒入进样口，立即夹紧螺旋夹，并加入少量蒸馏水，密封进样口。

当蒸汽通入反应室时，准确计时，反应产生的氨气通过冷凝管进入吸收瓶，蒸馏5min，移动吸收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏Imin，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下吸收瓶。

停止加热，使反应室内的液体进入汽水分离器，打开进样口的螺旋夹，将汽水分离器的液体放出。再向反应室内加入蒸馏水，夹紧螺旋夹，再次进行加热至水蒸汽放出，停止加热，使反应室内的水进入汽水分离器，进行洗涤。

4、滴定:用0.025mol/L硫酸标准溶液滴定吸收液至灰色。

5、计算:X= 2cVX 14X5.71/m

X为样品中蛋白质的含量，%；c为硫酸标准溶液的浓度，molL；V为样品消化液消耗硫酸标准溶液的体积，ml；m为样品的质量，g。

注意事项

(1) 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

(2) 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万-沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

(3) 消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢(H2O2)2-3ml，促使氧化。

(4) 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

(5)如硫酸缺少， 过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

(6)加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

(7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

(8) 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。

(7)凯氏蒸馏装国标扩展阅读：

凯氏定氮法原理

凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程 称为有机物的消化。

为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。

硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。

㈧ 凯氏定氮法的原理是什么

不知道你要问什么，你已经把原理写出来了。
如果再说仔细一点，就是有机物与浓硫酸共热，400摄氏度以上，此时的有机物中的N元素完全分解生成NH3，氨气挥发出来，通过一系列的反应测定氨气的量，即可计算有机物中的N元素含量。

㈨ 关于凯氏定氮法

用盐酸滴定至灰色或蓝紫色为终点。

具体可以参考GB/T5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》

下载链接：http://www.foodmate.net/standard/sort/3/2683.html

㈩ 估元素国标的检测方法

用紫外光光度测定蛋白质含量
引用：

6种测定蛋白质含量
、微量凯氏（kjeldahl）定氮
品与浓硫酸共热含氮机物即解产氨（消化）氨与硫酸作用变硫酸氨经强碱碱化使解放氨借蒸汽氨蒸至酸液根据酸液程度计算品氮含量若甘氨酸例其反应式：
nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)
2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)
(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)
反应（1）、(2)凯氏瓶内完反应（3）凯氏蒸馏装置进行
加速消化加入cuso4作催化剂k2so4提高溶液沸点收集氨用硼酸溶液滴定则用强酸实验计算略
计算所结品总氮量欲求 品蛋白含量应总氮量减非蛋白
氮即欲进步求品蛋白质含量即用品蛋白氮乘6．25即
二、双缩脲（biuret）
（）实验原理
双缩脲（nh3conhconh3）两脲经180℃左右加热放氨产物强碱性溶液双缩脲与cuso4形紫色络合物称双缩脲反应凡具两酰胺基或两直接连接肽键或能间碳原相连肽键类化合物都双缩脲反应
紫色络合物颜色深浅与蛋白质浓度比与蛋白质量及氨基酸关故用测定蛋白质含量测定范围1-10mg蛋白质干扰测定物质主要：硫酸铵、tris缓冲液某些氨基酸等
优点较快速 同蛋白质产颜色深浅相近及干扰物质少主要缺点灵敏度差双缩脲用于需要快速并需要十精确蛋白质测定
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白配制10mg/ml标准蛋白溶液用bsa浓度1mg/mla2800.66校其纯度需要标准蛋白质预先用微量凯氏定氮测定蛋白氮含量计算其纯度再根据其纯度称量配制标准蛋白质溶液牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制酪蛋白用0．05n naoh配制
（2）双缩脲试剂：称1.50克硫酸铜（cuso4?5h2o）6.0克酒石酸钾钠（knac4h4o6?4h2o）用500毫升水溶解搅拌加入300毫升10% naoh溶液用水稀释1升贮存于塑料瓶（或内壁涂石蜡瓶）试剂期保存若贮存瓶黑色沉淀现则需要重新配制
2. 器材：
见光光光度计、试管15支、旋涡混合器等
（三）操作
1. 标准曲线测定：取12支试管两组别加入00.20.40.60.81.0毫升标准蛋白质溶液用水补足1毫升加入4毫升双缩脲试剂充摇匀室温（20～25℃）放置30钟于540nm处进行比色测定用未加蛋白质溶液第支试管作空白照液取两组测定平均值蛋白质含量横座标光吸收值纵座标绘制标准曲线
2、品测定：取2～3试管用述同测定未知品蛋白质浓度注意品浓度要超10mg/ml

三、folin—酚试剂（lowry）
（）实验原理
种蛋白质测定灵敏应用广泛种由于其试剂乙配制较困难（现已订购）近逐渐考马斯亮兰所取代显色原理与双缩脲相同加入第二种试剂即folin—酚试剂增加显色量提高检测蛋白质灵敏度两种显色反应产深兰色原：碱性条件蛋白质肽键与铜结合复合物folin—酚试剂磷钼酸盐—磷钨酸盐蛋白质酪氨酸苯丙氨酸残基原产深兰色（钼兰钨兰混合物）定条件兰色深度与蛋白量比
folin—酚试剂早由lowry确定蛋白质浓度测定基本步骤物化领域广泛应用测定优点灵敏度高比双缩脲灵敏缺点费间较要精确控制操作间标准曲线严格直线形式且专性较差干扰物质较双缩脲反应发干扰离同容易干扰lowry反应且者影响要酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均干扰作用浓度较低尿素（0.5%）硫酸纳（1%）硝酸纳（1%）三氯乙酸（0.5%）乙醇（5%）乙醚（5%）丙酮（0.5%）等溶液显色影响些物质浓度高必须作校曲线含硫酸铵溶液须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即显色测定若品酸度较高显色色浅则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液浓度1～2倍
进行测定加folin—酚试剂要特别该试剂仅酸性ph条件稳定述原反应ph=10情况发故folin酚试剂加碱性铜—蛋白质溶液必须立即混匀便磷钼酸—磷钨酸试剂破坏前原反应即能发
适用于酪氨酸色氨酸定量测定
检测低蛋白质量达5mg通测定范围20~250mg
（二）试剂与器材
1.试剂
（1）试剂甲：
（a）10克 na2co32克 naoh0.25克酒石酸钾钠 （knac4h4o6?4h2o）溶解于500毫升蒸馏水
（b）0.5克硫酸铜（cuso4?5h2o）溶解于100毫升蒸馏水每使用前50份（a）与1份（b）混合即试剂甲
（2）试剂乙：2升磨口流瓶加入100克钨酸钠（na2wo4?2h2o）,25克钼酸钠（na2moo4?2h2o）及700毫升蒸馏水再加50毫升85%磷酸100毫升浓盐酸充混合接流管火流10流结束加入150克硫 酸 锂（li2so4）50毫升蒸馏水及数滴液体溴口继续沸腾15钟便驱除量溴冷却溶液呈黄色（仍呈绿色须再重复滴加液体溴步骤）稀释至1升滤滤液置于棕色试剂瓶保存使用用标准naoh滴定酚酞作指示剂适稀释约加水1倍使终酸浓度1n左右
（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白溶于蒸馏水浓度250mg/ml左右牛血清清蛋白溶于水若混浊改用0.9%nacl溶液
2. 器材
（1）见光光光度计
（2）旋涡混合器
（3）秒表
（4）试管16支
（三）操作
1. 标准曲线测定：取16支试管1支作空白3支留作未知品其余试管两组别加入00.10.20.40.60.81.0毫升标准蛋白质溶液（浓度250mg/ml）用水补足1.0毫升每支试管加入5毫升试剂甲旋涡混合器迅速混合于室温（20～25℃）放置10钟再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂）同立即混匀步混合速度要快否则使显色程度减弱室温放置30钟未加蛋白质溶液第支试管作空白照于700nm处测定各管溶液吸光度值蛋白质量横座标吸光度值纵座标绘制标准曲线
注意：lowry反应显色随间断加深各项操作必须精确控制间即第1支试管加入5毫升试剂甲始计1钟第2支试管加入5毫升试剂甲2钟加第3支试管余类推全部试管加完试剂甲若已超10钟则第1支试管立即加入0.5毫升试剂乙1钟第2支试管加入0.5毫升试剂乙2钟加第3支试管余类推待支试管加完试剂再放置30钟始测定光吸收每钟测品
进行试管操作防止错每位都必须实验记录本预先画面表格表每试管要加入量（毫升）并按由左至右由至顺序逐管加入面两排计算每管蛋白质量（微克）测吸光度值
folin—酚试剂实验表

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
（250mg/ml）
未知蛋白质 0.2 0.4 0.6
（约250mg/ml）
蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4
试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管蛋白质量（mg）
吸光度值（a700）
2. 品测定：取1毫升品溶液（其约含蛋白质20~250微克）按述进行操作取1毫升蒸馏水代替品作空白照通品测定与标准曲线测定放起同进行即标准曲线测定各试管面再增加3试管表8、9、10试管
根据所测品吸光度值标准曲线查相应蛋白质量计算品溶液蛋白质浓度
注意:由于各种蛋白质含同量酪氨酸苯丙氨酸显色深浅往往随同蛋白质变化本测定通适用于测定蛋白质相浓度（相于标准蛋白质）

四、改良简易folin—酚试剂
（）试剂
1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液含0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石酸钾0.05%硫酸铜配制注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解加入2. 试剂乙：与前面基本相同临用加蒸馏水稀释8倍
3. 标准蛋白质溶液：同基本
（二）操作步骤
测定标准曲线与品溶液操作与基本相同试剂甲改1毫升室温放置10钟试剂乙改4毫升55℃恒温水浴保温5钟用流水冷却660nm测定其吸光度值
改良快速简易获与 folin—酚试剂（即lowry基本）相接近结
五、考马斯亮兰（bradford）
（）实验原理
双缩脲（biuret）folin—酚试剂（lowry）明显缺点许限制促使科家寻找更蛋白质溶液测定
1976由bradford建立考马斯亮兰（bradford）根据蛋白质与染料相结合原理设计种蛋白质测定具超其几种突优点广泛应用目前灵敏度高蛋白质测定
考马斯亮兰g-250染料酸性溶液与蛋白质结合使染料吸收峰位置（lmax）由465nm变595nm溶液颜色由棕黑色变兰色经研究认染料主要与蛋白质碱性氨基酸（特别精氨酸）芳香族氨基酸残基相结合
595nm测定吸光度值a595与蛋白质浓度比
bradford突优点：
（1）灵敏度高据估计比lowry约高四倍其低蛋白质检测量达1mg蛋白质与染料结合产颜色变化蛋白质－染料复合物更高消光系数光吸收值随蛋白质浓度变化比lowry要
（2）测定快速、简便需加种试剂完品测定需要5钟左右由于染料与蛋白质结合程约要2钟即完其颜色1内保持稳定且5钟至20钟间颜色稳定性完全用像lowry费严格控制间
（3）干扰物质少干扰lowryk+、na+、mg2+离、tris缓冲液、糖蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均干扰测定
缺点：
（1）由于各种蛋白质精氨酸芳香族氨基酸含量同bradford用于同蛋白质测定较偏差制作标准曲线通选用 g—球蛋白标准蛋白质减少面偏差
（2）仍些物质干扰测定主要干扰物质：污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）0.1nnaoh（同0.1n酸干扰lowary）
（3）标准曲线轻微非线性能用beer定律进行计算能用标准曲线测定未知蛋白质浓度
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)配制1.0mg/ml0.1mg/ml标准蛋白质溶液
（2）考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250溶于50ml 95%乙醇再加入120ml 85%磷酸用水稀释至1升
2. 器材：
（1）见光光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管16支
（三）操作
1. 标准
（1）取16支试管1支作空白3支留作未知品其余试管两组按表顺序别加入品、水试剂即用1.0mg/ml标准蛋白质溶液给各试管别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml用离水补充0.1ml各试管别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂每加完管立即旋涡混合器混合（注意要太剧烈免产量气泡难于消除）未知品加量见表第8、9、10管
（2）加完试剂2-5钟即始用比色皿光光度计测定各品595nm处光吸收值a595空白照第1号试管即0.1mlh2o加5.0mlg—250试剂
注意：使用石英比色皿（易洗染色）用塑料或玻璃比色皿使用立即用少量95%乙醇荡洗洗染色塑料比色皿决用乙醇或丙酮间浸泡

考马斯亮兰实验表
管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
(1.0mg/ml)
未知蛋白质 0.02 0.04 0.06
(约1.0mg/ml)
蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04
考马斯亮蓝
g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
每管蛋
白质量（mg）
光吸收值
（a595）
（3）用标准蛋白质量（mg）横座标用吸光度值a595纵座标作图即条标准曲线由标准曲线根据测未知品a595值即查未知品蛋白质含量
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液a595约0.50
2. 微量
品蛋白质浓度较稀（10－100mg/ml）,取量（包括补加水）加0.5ml或1.0ml, 空白照则别0.5ml或1.0ml h2o, 考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml, 同作相应标准曲线测定595nm光吸收值
0.05mg牛血清蛋白/ml溶液a595约0.29
六、紫外吸收
蛋白质酪氨酸、苯丙氨酸色氨酸残基苯环含共轭双键使蛋白质具吸收紫外光性质吸收高峰280nm处其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量比外蛋白质溶液238nm光吸收值与肽键含量比利用定波蛋白质溶液光吸收值与蛋白质浓度比关系进行蛋白质含量测定
紫外吸收简便、灵敏、快速消耗品测定仍能收使用低浓度盐例化制备用（nh4）2so4等数缓冲液干扰测定特别适用于柱层析洗脱液快速连续检测需测定蛋白质浓度变化需知道其绝值
特点测定蛋白质含量准确度较差干扰物质用标准曲线测定蛋白质含量些与标准蛋白质酪氨酸色氨酸含量差异蛋白质定误差故该适于用测定与标准蛋白质氨基酸组相似蛋白质若品含嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光物质现较干扰核酸干扰通查校表再进行计算加适校同蛋白质核酸紫外吸收相同虽经校测定结存定误差
外进行紫外吸收测定由于蛋白质吸收高峰ph改变变化要注意溶液ph值测定品ph要与测定标准曲线ph相致
面介绍四种紫外吸收：
1. 280nm光吸收
蛋白质酪氨酸、苯丙氨酸色氨酸280nm处具吸收且各种蛋白质三种氨基酸含量差别测定蛋白质溶液280nm处吸光度值用紫外吸收
测定待测蛋白质溶液倒入石英比色皿用配制蛋白质溶液溶剂（水或缓冲液）作空白照紫外光度计直接读取280nm吸光度值a280蛋白质浓度控制0.1～1.0mg/ml左右通用1cm光径标准石英比色皿盛浓度1mg/ml蛋白质溶液a280约1.0左右由立即计算蛋白质致浓度
许蛋白质定浓度定波光吸收值（a1％1cm）文献数据查根据光吸收值较准确计算蛋白质浓度式列蛋白质浓度与（a1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度1%光径1cm光吸收值）关系文献值a1％1cm,?称百吸收系数或比吸收系数
蛋白质浓度 = (a280′10 )/ a1％1cm,280nm (mg/ml)
(q 1%浓度?10mg/ml)
例：牛血清清蛋白 ： a1％1cm=6.3 (280nm)
溶菌酶 ： a1％1cm=22.8 (280nm)

若查待测蛋白质a1％1cm值则选用种与待测蛋白质酪氨酸色氨酸含量相近蛋白质作标准蛋白质用标准曲线进行测定标准蛋白质溶液配制浓度1.0mg/ml用标准蛋白质牛血清清蛋白（bsa）
标准曲线测定：取6支试管按表编号并加入试剂：
管号 1 2 3 4 5 6
bsa（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
a280
用第1管空白照各管溶液混匀紫外光光度计测定吸光度a280a280纵座标各管蛋白质浓度或蛋白质量（mg）横座标作图标准曲线应直线利用标准曲线根据测未知品a280值即查未知品蛋白质含量用2至6管a280值与相应试管蛋白质浓度计算该蛋白质a1％1cm,280nm
2. 280nm260nm吸收差
核酸紫外光强吸收280nm处吸收比蛋白质强10倍（每克）核酸260nm处吸收更强其吸收高峰260nm附近核酸260nm处消光系数280nm处2倍蛋白质则相反280nm紫外吸收值于260nm吸收值通：

纯蛋白质光吸收比值：a280/a260 ? 1.8
纯核酸光吸收比值： a280/a260 ? 0.5
含核酸蛋白质溶液别测定其a280a260由吸收差值用面经验公式即算蛋白质浓度
蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×a280－0.74×a260
经验公式通系列已知同浓度比例蛋白质（酵母烯醇化酶）核酸（酵母核酸）混合液所测定数据建立
3. 215nm与225nm吸收差
蛋白质稀溶液由于含量低能使用280nm光吸收测定用215nm与225nm吸收值差通标准曲线测定蛋白质稀溶液浓度
用已知浓度标准蛋白质配制20～100 mg/ml系列5.0ml蛋白质溶液别测定215nm225nm吸光度值并计算吸收差：
吸收差d= a215 －a225
吸收差d纵座标蛋白质浓度横座标绘标准曲线再测未知品吸收差即由标准曲线查未知品蛋白质浓度
本蛋白质浓度20~100mg/ml范围内蛋白质浓度与吸光度比nacl、（nh4）2so4及0.1m磷酸、硼酸tris等缓冲液都显著干扰作用0.1n naoh, 0.1m乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液215nm光吸收值较必须其浓度降0.005m才显著影响
4. 肽键测定
蛋白质溶液238nm处光吸收强弱与肽键少比用标准蛋白质溶液配制系列50～500mg/ml已知浓度5.0ml蛋白质溶液测定238nm光吸收值a238a238纵座标, 蛋白质含量横座标绘制标准曲线未知品浓度即由标准曲线求
进行蛋白质溶液柱层析离洗脱液用238nm检测蛋白质峰位
本比280nm吸收灵敏种机物醇、酮、醛、醚、机酸、酰胺类氧化物等都干扰作用所用机盐机碱水溶液进行测定若含机溶剂先品蒸干或用其除干扰物质用水、稀酸稀碱溶解再作测定
感觉这样的提问没有什么意义
不要多想，想多了累