nc膜在蒸馏水中浸泡时间过长会如何

Ⅰ 硝酸纤维素膜NC膜的应用举例

1.分子杂交
杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜。
固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。
用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义。下面以放射性标记探针与固定在NC膜上的核酸进行杂交为例，杂交反应操作如下：
① 配制所需试剂
SSC溶液(20×)：3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠。
Denhardt’s溶液(50×)：聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。
预杂交液：6×SSC，5×Denhardt’s溶液，0.5%SDS，100?g/ml经变性或断裂成片段的鲑精DNA。
② 将含靶核酸的NC膜漂浮于6×SSC液面，使其由下至上完全湿润，并继续浸泡2分钟。
③ 将湿润NC膜装入塑料袋中，按0.2ml/cm2的量加入预杂交液，尽可能挤出气泡，将袋封口，置68℃水浴1-2小时或过夜。
④ 将双链探针做变性处理使成单链，即于100℃加热5分钟，然后立即置冰浴使骤冷。
⑤ 从水浴中取出杂交袋，剪去一角，将单链探针加入，尽可能将袋内空气挤出去，重新封口，并将杂交袋装入另一个干净的袋内，封闭，以防放射性污染。
⑥ 将杂交袋浸入68℃水浴，温育8-16小时。
⑦ 取出杂交袋，剪开，取出滤膜迅速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS中，室温振荡5分钟，勿使滤膜干燥。
⑧ 将NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室温漂洗15分钟。
⑨ 将NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，37℃漂洗30分钟至1小时。
⑩ 将NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，68℃漂洗30分钟至1小时。
⑾ 取出滤膜，用0.1×SSC室温稍稍漂洗，然后置滤纸上吸去大部分液体，待做杂交信号的检测。

Ⅱ 悬赏300分:我想做northern blot,谁帮我设计一下

我只会做
要不传影象给你

溶液:
(1) 转移缓冲液：称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱，0.37 SDS，200ml甲醇，加去离子水至1000ml，如果蛋白分子量小可不加SDS。
(2) PBS－T： NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4•12H2O 2.9g, 溶于800ml去离子水中，用盐酸调PH值为7.4，定溶至1000ml，加0.05％Tween20。
(3) 封闭液：5%脱脂奶溶于PBS中
(4) 氨基黑染液：0.2%氨基黑溶于7%乙酸中。
(5) 氨基黑脱色液：30%甲醇, 10%冰醋酸溶液

SDS-PAGE相关溶液
(1).电极缓冲液：
Tris: 6g
甘氨酸： 28.8g
(10% )SDS: 10ml
加1000 ml H2O PH:8.3
(2).分离胶buffer: 100ml:
Tris:36.6g
1N HCL:(约48ml): PH:8.9
加水至：100ml
(3). 浓缩胶buffer: 100ml:
Tris: 5.98g
1N HCL:(约48ml): PH:
加水至：100ml
(4).凝胶贮存液： 100ml:
Acr:30g
Bis:0.8g
加水至：100ml
(5). 4Xloading buffer:
2-Me: 20% 2ml
SDS: 8% 0.8g
Glycerin: 40% 4ml
Bromophenol Blue: 0.4% 0.04g
Tris-CL (ph6.8) 240mM 2.5ml(浓缩胶buffer)
加1.5ml H2O
total: 10ml

(6) 染色液(快速染色配方，染色1小时
0.1% Coomassie blue, 10% acetic acid, 45% methanol
考马斯蓝R-250 1g
甲醇 450ml
水 450ml
冰醋酸 100ml

(7). 脱色液：1000ml
冰醋酸： 75ml
甲醇： 50ml
水： 875ml

细胞裂解液
（1）Buffer A: 25 mM Tris pH 7,5
50 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM EDTA
5 mM dithiothreitol (DTT)
（2）细胞核裂解液
Buffer NE:
25 mM Tris pH 7,5
0.42 M NaCl
1.5 mM MgCl2
0.5 mM EDTA
1 mM dithiothreitol (DTT)
25% Sucrose
0.2% SDS (免疫沉淀不加)
裂解细胞前加入蛋白酶抑制剂至终浓度为 100 mg•L-1 PMSF, 1 mg•L-1 Aprotinin, 2 mg•L-1 Leupeptin

步骤:SDS-PAGE电泳
按照胶配置方法配制不同浓度PAGE胶，电泳置染料抵达分离胶底部，断开电源。 取下凝胶，
Western Blot
1. 电泳结束后，切下带有要转移蛋白泳道的凝胶用，右下角作一标记以确定方向及正反面。
2. 剪1块与凝胶大小相同的NC膜（不能大于凝胶），右下角作一标记，浸泡于转移缓冲液中，大约5分钟。
3. 剪8块新华1号滤纸，右下角作一标记，其大小略与凝胶相同（不能大于凝胶）。
4. 将剪好的滤纸在转移缓冲液中浸泡，按阳极到阴极（从下至上）顺序安装转移装置: 平放底部电极，在底部电极上放置4张浸泡好的滤纸,精确对齐，将NC膜放在滤纸上，排除气泡。把SDS-PAGE 电泳凝胶转移到去转移缓冲液中漂洗，平放于NC膜上，用玻棒挤出所有气泡。在其上再放置4张浸泡好的滤纸，排出气泡。
5. 将上层电极放于夹层物上，连接电源，根据凝胶面积按1mA/cm2接通电源，电转移2~4h。100mA,2h。
6. 转移结束后，去除滤纸。把凝胶转移到考马斯亮蓝染液的托盘中染色，以检查蛋白转移是否完全。剪下含分子量标准的NC膜放在氨基黑染液中染色30秒，氨基黑脱色液脱色。
7. 将转移上蛋白的NC膜以蒸馏水略洗稍干后，浸在封闭液中4℃封闭过夜，然后用PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。
8. 将膜与第一抗体室温孵育2h，第一抗体用PBS-T缓冲液按不同稀释度稀释以摸索最合适的一抗浓度，然后PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。
9. 将膜与HRP标记的羊抗鼠IgG(1:5000)共同孵育1h，PBS-T缓冲液洗膜3次，每次10min。
10. 配制发光底物（按1：1混合底物液）。
11. PBS-T缓冲液洗涤后在化学发光底物显色2分钟，凝胶成像系统观察照相。（或DAB显色液中避光显色~15分钟，出现条带后立即以水冲洗以中断显色反应）。

我只是举个例子给你看,因为只有你自己想出来的实验才是得心应手的.别人手把手教你做实验,那么你的思路就会跟着别人走,有可能被别人误导,那你做这个实验又有什么意思.

Ⅲ nc膜包被后长时间没有放进去干燥会怎么样

硝酸纤维素膜NC膜
硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。

中文名：硝酸纤维素膜NC膜
外文名：nitrocellulose filter membrane
原理：匀浆配比
供应商：PALL(美国)
生产原理

匀浆配比
购买回来的原料硝酸纤维素粒子是一种非常普遍的有机化学物，溶解形成混浆，在该浆体内，通过加入一定比例的试剂来调整最后形成的膜的性质，一般主要包含表面活性剂/高分子聚合物/盐离子/成型剂等溶解的一个缓冲体系内。不同的厂家加入的溶液配方不一样，导致了产品的差异。

滚筒铺膜
配好的匀浆通过滚筒，形成了一张薄膜，平摊在十分光滑的平面载体上。过程与造纸非常相似。

成型
当匀浆内的成型剂开始挥发，膜逐步干燥成型。同时在这个过程中由于温度比较高，有些厂家在这个过程采取了在密闭腔体内成型，同时补充配方溶液的形式，来避免一些有效成分的蒸发。

Ⅳ 做western blot 的时候我把膜在甲醇里泡了一下，结果膜毁了。之前看资料说要在甲醇里泡一下的，怎么会这样

我也是这样的情况，膜直接化了，不过，转膜缓冲液也有甲醇啊，这个怎么办？

Ⅳ 转膜时间太长，小蛋白会不会从膜中穿过

影响因素应该有很多；一、首先需确定目的蛋白是否在胶上：跑完电泳可以先考马斯亮蓝染胶，如果在marker的指示下看到了目的蛋白的清晰条带，基本可以确定蛋白已经在胶上跑开。二、膜的准备：1.根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的pvdf膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的pvdf膜。大于20kd的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kd的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“blowthrough”的现象。pvdf膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。2.pvdf膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟，以使表面基团活化，有利蛋白结合。三、三明治做好后放入已经加入转膜液的转膜槽，连接电极，方向是胶负膜正。转膜过程在4度冰箱中或置入冰水浴中进行。四、时间和电压或电流依照分子量大小：分子量越大，时间越长，电压或越大。转移时间一般为1.5
小时，(
1ma-2ma/cm2，10%
gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。本人觉得17kd的蛋白可以试试恒压90v40min。仅供参考。

Ⅵ 硝酸纤维素膜的NC膜的选择

以上谈了该行业的一些发展现状,那么我们大致了解后,回到最关心的问题,如何选择膜? 经常会遇到的问题是,我是做**项目的,我该选择那类膜?
这里涉及到一个膜的分类标准问题,一个供应商可能提供这个膜是8um,但另一个供应商告诉你膜是135s的.这之间的区别与联系是什么?
um指的是膜孔径,而从上面膜的生产过程,我们可以看出,膜的孔径实际上是没有办法界定的.由于干燥成型等过程的非绝对均一,膜的孔径也是非均一的.膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼.而以秒为单位的定义为,每4cm膜,水的层析时间是***s.该单位已经越来越被各大厂商所接受,成为了一个通用的比较标准.以下我们将采用s单位来进行交流.
换算情况大致为: 8um=135s; 6um=180s.
不同秒数的膜对反应有什么影响呢?
首先,我们分析一下液体在膜上的运动过程. 一张长度为4cm的膜, 每隔1cm做一个标记, 当液体运动过标记处时记录时间点. 那么你将会发现液体在膜上的运动是呈减速前行的. 而两张不同秒数的膜(例如135s, 180s)在同一时间标记点处的运动速度不同.这个试验用清水做不好观察,可以考虑用色素水溶液,非常明显.
那么从这个试验可以看出,在通过同一T线喷点位置时, 金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜. 那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短, 读数快, 那么灵敏度也就越低. 反之, 反应时间长, 读数慢, 也就灵敏度高. 同时还有一个问题是, 反应时间越长, 发生非特异性结合的可能性就越大, 所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度. 所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡.
其实我们并没有那么多选择. 经过使用实践, 各供应商一般都只提供两个型号, 就是135s和180s. 虽然看到有些厂家的产品目录上型号种类繁多,但这两个型号的定货量就占了95%以上, 其他型号供货上也就远不如这两个型号来得顺利. 135s一般用在双抗体夹心法, 180s一般用在竞争法. 你所要做的是,先选择其中的一个型号, 然后比较不同供应商同一个型号的差异, 由于前面说的添加配方与你的试验条件配合的不同,这个差异可能大也可能小. 具体要根据试验结果来确定最后的选择.
我个人不建议地毯式的测试不同规格/不同厂家的膜, 这样成本高, 成功的几率也小.

Ⅶ 硝酸纤维素膜NC膜的应用技巧

从本节开始，我们开始对膜进行深入讨论和谈一些应用技巧。
1. 蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理， 已知的结合力包括疏水作用力H键静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑。主要有两种假说：
1）首先两者靠静电作用力结合，然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合。
2）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合。
两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的工作非常依赖实践经验。
2. 膜对结合的影响
1）膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品，如果是不同厂家的产品，这种比较是无意义的。膜孔径与层析速度的关系，已在上文描述。随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积递增，膜结合蛋白的量也递增. 估量表面积的参数为表面积比率（实际可用表面积与所用膜平面积的比率）。
另外，膜孔径越小，层析速度也越小，那么金标复合物通过T线的时间也就越长，反应也就越充分。
综合以上两点，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高.所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点。
2）不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点：
1> 生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源，类型，数量不同。同理，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响。 2> 处理过程不同。
3. 生物原料，缓冲溶液的试剂和配方
1）生物原料， 作为CT线的生物原料使用情况各异，所以这里只做略述。
首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体，主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点，而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别，毫无疑问就增加了优化难度。其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。
2）缓冲液
大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方，包括缓冲液，封闭液等等处理溶液配方。
其实我也无法提供给你一个万用配方清单。因为不同的反应体系需要不同的配方来支持， 而不同机构的反应体系又有差异。想获”鱼”先学”渔”.。为了不误导大家，我在下面涉及到配方的问题上，仅提供思路，具体配方请自己摸索。
缓冲液的构成一般是：PBS（或其他缓冲体系）+作用物质（针对某一特定问题）+PH调整. 我在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要。
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2， 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。
作用物质的情况大致罗列如下：
少量NACL，减少信号强度，消假阳。
有机醇（甲醇，异丙醇等），润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。个人不推荐，因制膜工艺改进。
表面活性剂（TW20，TX100），增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。
糖，保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上。
调PH到某个位置，可以消假阳。
4. 点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45-65%。湿度过低，膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试会出现疏水斑。湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起CT线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。
5. 点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式.非接触点膜式优于划膜式，进口划膜式优于国产划膜式。
因划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕.进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕也就比较严重。 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线（鬼线），而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象。
6. 膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18mm（or 20mm）和25mm两种， 分别使用在做测试条和做测试板上。然而，不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。点样位置上移，金标复合物通过T线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高。反之灵敏度降低。这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。
7. 溶液在膜上的扩散
溶液在膜上的点样量一般情况下为1ml/cm。溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的。一般情况下不影响你的试验。如果你发现线条出现两端红，中间淡的现象，就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。
8. 点膜前后的封闭作用
从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的，直接点膜就可使用.然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论。其实封闭不象大家认为的那样，一封闭什么问题都解决了. 老问题走了新问题又来了，而且更麻烦，我要说的是慎用封闭。我极其反对点膜前封闭的做法。原因为厂家在生产膜时候，各种配方是混合加入原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内，必然扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了许多问题，也降低了工作效率。也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题，其实可以通过其他办法来解决，封闭必然是下测。
我经常使用的封闭手法有两种：流动封闭，将作用物质处理在样品垫上。膜上定点封闭，将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上。该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头，可以将不合格的半成品大板重新复活。只要是将封闭做在了膜上，就必然会对产品的稳定性造成影响，具体的影响程度要通过稳定性测试来评判。
9. 膜的储存
刚生产出的膜一般含有5-10%的水分。关于膜的老化机理，有个理论支持，不过争议比较大。理论认为：膜的老化是因为膜上的水分蒸发，使膜变得疏水，带电荷并变脆。储存膜一般要求是避光，密封，过干或过湿都不利。在这种保存条件下，一般可以放置两年。但是如果膜上做了封闭处理，就要根据具体试验情况来判断了。有些膜由于生产工艺的问题，使用后灵敏度会在一段时间内发生变化，遇到这种问题，就需要在点膜后放置一段时间，待稳定后方可进入调试生产。
硝酸纤维素膜NC膜
规格: 15X20cm
孔径: 0.45μm
保存: 5-15℃密封保存,保质期一年
产品简介: 本品外观洁白，膜正面呈光泽，与水接触应立即浸润，不能立即浸润老者视为失活，不能点样，膜面有花斑或有粉性结构皆视为次品。用于转移电泳，宜选孔经0.22或0.45，以保证膜的强度，并减少穿透损失，硝纤膜过份干燥时脆,湿时有弹性，操作时室内应保持中常温度，避免过份干燥，防止发脆，本品静电吸附膜的亲水性好，渗滤时间适中，蛋白吸附力强，转膜的蛋白集中而不扩散，显色的灵敏度和特异性高，背景低。