蒸馏水检测蛋白质

㈠ 如何准确测定样品中蛋白质的含量

5种方法测定蛋白质含量

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

二、双缩脲法（biuret法）

1、实验原理

双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

2、试剂与器材

（1）试剂：a、标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用0.9%nacl配制，酪蛋白用0.05n nach配制。

b、双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜和6.0克酒石酸钾钠，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

（2）器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。

用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

（2）样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

三、folin—酚试剂法（lowry法）

1、实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。

在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

2、试剂与器材

（1）试剂

a、试剂甲： （a）10克碳酸钠，2克 naoh和0.25克酒石酸钾钠 。溶解于500毫升蒸馏水中。 （b）0.5克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。

b、试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠，25克钼酸钠及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，

开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准nach滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。

c、标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%nacl溶液。

（2）器材

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、秒表

d、试管16支

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，

然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。

这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。

全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。

每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

folin—酚试剂法实验表 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6 （约250mg/ml）

蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量（mg） 吸光度值（a700）

（2）样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。

通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易folin—酚试剂法

1、试剂

（1）试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n 氯化钠、10%碳酸钠、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

（2）试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

（3）标准蛋白质溶液：同基本法。

2、操作步骤 测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。

用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与 folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。

五、考马斯亮兰法（bradford法）

1、实验原理 双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

2、试剂与器材

（1）试剂：

a、标准蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

b、考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

（2）器材：

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、试管16支

3、操作方法

（1）标准方法

a、取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。

最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

b、加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1ml水加5.0mg—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)

蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量（mg） 光吸收值 （a595）

c、用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。

（2）微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml水，考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。

㈡ 提供适量的蒸馏水,鉴定蛋白质的试剂可以用来鉴定还原糖吗

不可以，反过来可以(提供适量蒸馏水，量筒，鉴定还原性糖的试剂可以用来鉴定蛋白质)因为鉴定蛋白质的试剂是双缩脲试剂，鉴定还原性糖的试剂是斐林试剂，它们的成分及浓度如下
斐林试剂：甲液：0.1g/mL的NaOH溶液；乙液：0.05g/mL的溶液。
现配现用，在2mL的甲液中滴入4滴～5滴乙液，振荡使混合均匀后即可。
双缩脲试剂：A液：0.1g/mL的NaOH溶液；B液：0.01g/mL的溶液。

㈢ 菲林试剂中的甲液和乙液和蒸馏水可以检测葡萄糖和尿液中的蛋白质吗，为什么

可以 详见生物书

㈣ 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量实验中,使用的水一定是蒸馏水吗为什么

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量实验中，使用的水最低要求是蒸馏水，更高精度要求可能会使用双蒸水。

因为Bradford检测中要用的试剂配制，标准曲线的制作都要用到水。如果不是使用蒸馏水，可能水里面会有一些游离的离子或者电解质，会影响试剂配制的准确性，干扰实验结果。而水中残留的有机物等可能会和考马斯亮蓝发生变色反应，这样制作的标准曲线会比实际值偏高，导致最终浓度检测的结果比实际结果偏低。

㈤ 用什么方法检测蛋白质

目前食品中蛋白质的测定方法有蛋白质自动分析仪，近红外自动测定仪，紫外分光光度法以及凯氏定氮法等。本文采用纳氏试剂作为显色剂测定食品中蛋白质含量，适用范围广，可用于各类食品及保健食品的检测。用本法对标准品、质控样品进行测定获得满意结果，对批量样品的快速测定更具有实用性。现将结果报告如下。

材料与方法

仪器与试剂 WFZ800-D3型紫外分光光度计(北京第二光学仪器厂)。分析纯硫酸、硫酸铜、硫酸钾。(1)纳氏试剂：称取碘化汞100g及碘化钾70g，溶于少量无氨蒸馏水中，将此溶液缓缓倾入己冷却的32%氢氧化钠溶液500ml中，并不停搅拌，再用蒸馏水稀释至1L，贮于棕色瓶中，用橡皮塞塞紧，避光保存。(2)硫酸铵标准储备溶液(1.0g/L)：精确称取经硫酸干燥的硫酸铵0.4720g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混均此液每毫升相当于1.0mgNH3-N(10℃下冰箱内储存稳定1年以上)。(3)硫酸铵标准使用溶液(0.01g/L)：用移液管精密吸取1.0ml标准储备液(1.0g/L)于100ml容量瓶内，加水稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于10.0μg NH3-N。

方法

标准曲线绘制 取25ml比色管7支，分别准确吸取0.01g/L硫酸铵标准使用液0.00，0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，10.0ml(相当于标准0.0，5.0，10.0，30.0，50.0，70.0，100.0μg)，加水至10ml刻度，于标准系列管中各加2ml纳氏试剂，混匀后放置10min，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长420mm处测量吸光度，以标准管含量为横坐标(μg),对应的吸光度(A)值为纵坐标绘制标准曲线。

样品测定 选择牛奶和奶粉为检测样品。精密称取样品0.1～2.0g置于250ml三角瓶中，加入0.2gCuSO4、1.0gK2SO4、硫酸10ml，先小火加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，加大火力至液体呈蓝色，使H2SO4剩余量约为3ml左右为止，室温放冷后，沿瓶壁慢慢加入10ml水，移入100ml容量瓶中，用少量蒸镏水洗三角瓶3次，洗液全部并入容量瓶中，冷却，加蒸馏水至刻度，混匀。测定时取0.5ml，加水至10ml刻度，以后操作同标准曲线。同时做空白试验。

计算公式

X=c×Fm×V2V1×1000×1000×1000

式中：X-试样中蛋白质含量(g/100g或g/100ml)

C-试样测定液中扣除空白后氮的含量(μg)

V1-试样消化液定容体积(ml)

V2-测定用消化液体积(ml)

m-样品质量(g)或体积(ml)

F-氮换算为蛋白质的系数。

蛋白质的氮含量一般为15%～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.7，肉及肉制品为6.25，大豆为5.71。

结果

2.1 测定波长选择 含氮量为30μg的标准管在显色后，在波长400～440mm范围内每间隔5nm进行测定，最大吸收波长为420mm。

显色剂用量选择 含氮量为30μg的标准管分别加入不同量的纳氏试剂，在420mm的波长下分别测定其吸光度结果。纳氏试剂显色剂加入量为1.5～3.0ml时吸光度基本无变化，本法选择加入纳氏试剂2.0ml。

显色时间及稳定性 含氮量为30μg的标准管经显色后，分别在10，30min，1，2，4，8h进行测定。显色后10min～8h内吸光度稳定无变化。本法选显色10min后测定。

标准曲线 回归方程：y=0.016X-1.5×10-3，r=0.9998，最佳线性范围0.0～100μg。

精密度 牛乳和奶粉2种样品分别取6份按本法重复测定6次，牛乳和奶粉精密度测定结果：平均数分别为3.06，23.50；标准差分别为±0.029，±0.073；相对标准偏差分别为0.31%，0.94%。

对2种样品利用标准加入法作回收试验(表1) 结果可见，回收率为95.50%～99.44%。

2种方法测定结果比较 分别用GB/T5009.5-2003凯氏定氮法与本法测定。结果显示，2种分析方法的测定结果差异无统计学意义(t=0.026，P>0.05)。

测定标准物质 用本法测定4种不同的蛋白质标准物质，测定结果与标准物质含量一致。

以纳氏试剂作为显色剂快速测定食品中蛋白质的方法特点简单、快速，适用于批量样品测定。在碱性条件下NH3-N与纳氏试剂反应生成的黄色化合物稳定。本法与国标凯氏定氮法进行比较t=0.026,P<0.05，n=32，2种方法测定结果无明显差异。测定范围广，线性范围宽0.0～100.0μg；精密度高；相对标准偏差为0.31%～0.94%；回收率好，加标回标率为95.50%～99.44%。用本法测定标准物质结果一致，用于质量控制样本测定结果满意。本法仪器试剂简单，易于基层普及，有利于推广应用。

㈥ 验证细胞膜中有蛋白质，用细胞膜样液、蒸馏水、试管、滴管、双缩脲试济，怎样验证请详细一点。谢谢！

将细胞膜样液用蒸馏水稀释后，取2ml加入试管，加入2ml双缩脲试剂A液，使细胞样液呈碱性，再用滴管滴入双缩脲试剂B液2~3滴，振荡试管，若试剂呈紫色，则证明细胞膜样液稀释液中有蛋白质。

㈦ 在进行蛋白质盐析时,用自来水代替蒸馏水进行试验,试验结果会不同么为什么

肯定不同,因为自来水杂质较多.不同的盐,结果都不相同,何况水质不一.

㈧ 在进行蛋白质盐析时，用自来水代替蒸馏水进行试验，试验结果会不同么为什么

肯定不同，因为自来水杂质较多。不同的盐，结果都不相同，何况水质不一。

㈨ 蛋白质的检测用的是什么试剂（）A．双缩脲试剂B．双氧水试剂C．石灰水试剂D．蒸馏水试

在含有蛋白质的液体中，滴入双缩脲试剂，液体会变成紫色．因此，常用双缩脲试剂来检验是否存在蛋白质．
故选：A