粗蛋白蒸馏装置漏气验证方法

1. 为什么蒸馏装置不能漏气

若蒸馏一些有毒物质,那后果不堪设想

2. 如何检测家禽类饲料中的粗蛋白

凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。
2、试剂
2.1 硫酸（GB 625）：化学纯，含量为98％，无氮。
2.2 混合催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水（GB 665），6g硫酸钾（HG 3—920）或硫酸钠（HG 3—908），均为化学纯，磨碎混匀。 2.3 氢氧化钠（GB 629）：化学纯，40％水溶液（m/V）。 2.4 硼酸（GB 628）：化学纯，2％水溶液（m/V）。
2.5 混合指示剂：甲基红（HG 3—958）0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220）0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。
2.6 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按GB 601制备。 2.6.1 盐酸标准溶液：c（HCl）=0.1mol/L。8.3mL盐酸（GB 622，分析纯），注入 1 000mL蒸馏水中。
2.6.2 盐酸标准溶液：c（HCl）=0.02mol/L。1.67mL盐酸（GB 622，分析纯），注入1 000mL蒸馏水中。 2.7 蔗糖（HG 3—1001）：分析纯。 2.8 硫酸铵（GB 1396）：分析纯，干燥。
2.9 硼酸吸收液：1％硼酸水溶液1 000mL，加入0.1％溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1％甲基红乙醇溶液7mL，4％氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。
3、 仪器设备

3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2 分样筛：孔径0.45mm（40目）。 3.3 分析天平：感量0.0001g。 3.4 消煮炉或电炉。
3.5 滴定管：酸式，10、25mL。 3.6 凯氏烧瓶：250mL。
3.7 凯氏蒸馏装置：半微量水蒸气蒸馏式。 3.8 锥形瓶：150、250mL。 3.9 容量瓶：100mL。 3.10 消煮管：250mL。
3.11 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动。
4、 试样的选取和制备
选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。
5 分析步骤
5.1.1 试样的消煮
称取试样0.5～1g（含氮量5～80mg）准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将 凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力 （360～410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。
5.1.2 氨的蒸馏：
将试样消煮液冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器 的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10～20mL注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
5.1.2.3 蒸馏步骤的检验
精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按5.1.2步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为21.19±0.2％，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。
5.1.3 滴定
用5.1.2.1或5.1.2.2法蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L或0.02mol/L（4.6.2）盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
6 、空白测定

称取蔗糖0.5g，代替试样，按第5章进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液体积不得超过0.3mL。
7、 分析结果的表述
7.1 计算见下式：
粗蛋白质（％）=（V2-V1）·c×0.0140×6.25/（m×V＇/V） ×100 式中：V2── 滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL； V1── 滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL； c── 盐酸标准溶液浓度，mol/L； m── 试样质量，g；
V── 试样分解液总体积，mL； V── 试样分解液蒸馏用体积，mL；
0.0140── 与1.00mL盐酸标准溶液〔c（HCl）=1.000mol/L〕相当的、以克表示的氮的质量。
6.25── 氮换算成蛋白质的平均系数。
7.2 重复性
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋白质含量在25％以上时，允许相对偏差为1％。 当粗蛋白含量在10％～25％之间时，允许相对偏差为2％。 当粗蛋白质含量在10％以下时，允许相对偏差为3％。

3. 有机化学实验，怎么检查水蒸气蒸馏装置不漏气

不行 水加热放出的水蒸气太多 如果只是小孔漏气 就检查不出来
手握蒸馏烧瓶 导管一端插入水中 如果有气泡冒出 说明气密性良好

4. 测蛋白时如何检查其是否漏气

直观点就是用眼看。再一个就是变色时间长的话也有可能漏气。最后，可以测一个硫酸铵。

5. 凯氏定氮法影响蛋白质测定结果准确性的因素有哪些

1、样品消化的完全程度。如：被浓硫酸脱水的样品（有机物），炭化成的内氮，由于消化不容完全就不能被二氧化硫完全还原成氨，就会造成测定结果偏低。
2、消化温度。消化食不能用强火，应保持缓和沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。
3、蒸馏装置的气密性。若气密性差（漏气），蒸馏出来的氨气就会挥发流失。（所以，漏斗加碱后应立刻水封，以免氨气由此处逸出而造成损失。）
4、吸收液的温度。硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱，而造成氨损失。

6. 进行蒸馏装置，如何检查装置气密性

1、如图将导管出口埋入烧杯的水中，用手掌焐热烧瓶，观察烧杯中管口是否有气泡回逸出，过一会儿答移开手，观察浸入水中的导管末端有无水上升形成水柱。若焐时有气泡溢出，移开手有水柱形成，说明装置气密性良好，可以安心开始实验。

(6)粗蛋白蒸馏装置漏气验证方法扩展阅读

对水蒸气发生器进行加热，稍后发现三口烧瓶中的水蒸气导入管口冒出气泡则证明密封良好，反之漏气。

它利用混合液体或液-固体系中各组分沸点不同，使低沸点组分蒸发，再冷凝以分离整个组分的单元操作过程，是蒸发和冷凝两种单元操作的联合。

与其它的分离手段，如萃取、Absorption等相比，它的优点在于不需使用系统组分以外的其它溶剂,从而保证不会引入新的杂质。

7. 粗蛋白的测定有没有比凯氏定氮更好地方法呀

主要成分是蛋白质。检验方法是剀氏定氮法。

蛋白质的测定方法

pro的测定方法分为两大类：一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。但是食品种类很多，食品中pro含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此pro的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。

一 凯氏定氮法

这种方法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解试样，而不能阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用H2SO4分解试样，需要较长时间，后来由Gunning加入改进，他改进的办法是在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的380上升到400℃，提高了不到67℃所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用。

我们在检验食品中pro时，往往只限于测定总氮量，然后乘以pro核算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。

1 凯氏常量定氮法：

不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的，首先第一个步骤是消化：

（1）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而pro则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。

（2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。

为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。

所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。

（1）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。

（2）吸收与滴定：

蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。

1．操作步骤：

准确称取样品中0.50-2.00g→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30分钟→至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却→加200ml水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加热→至到K氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗→用0.1N HCl滴定。

N（V2-V1）0.014

W

计算：

总氮量%= （N(V2-V1)×0.014）/W × 100

0.014----氮的毫克当量数

pro%=总氮%×K

乳制品K=6.38（N=15.7%）

小麦粉K=5.79（N=17.6%）

动物胶K=5.6（N=18.0%）

冰蛋K=6.7（N=14.8%）

大豆制品K=6.0（16.7%） K=6.25则（N=16%）

K-换称等数

各种试剂的作用:

浓H2SO4：

A ：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4还原为SO2，本身则变为CO2

B： 氧化

C： pro与浓H2SO4生成NH3↑，CO2，SO2，H2O↑

D： NH3与H2SO4生成硫酸铵

（1）CuSO4的作用（催化剂）

CuSO4为红色沉淀，当C完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为CuSO4的颜色

（2）K2SO4的作用（提高沸点）

沸点由330℃提高到400℃加速了反应过程。

（3）硒粉和过氧化氢，氧化汞都为催化剂，但为了防止污染通常采用硫酸铜

（4）50%NaOH的作用

下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:

（1）K氏烧瓶和取样量

如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。

（2）分解剂

A H2SO4和K2SO4的添加量

有机无分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml

这种比例在国内外都使用，是公认的

还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20ml

B 催化剂

用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2，的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO消化麦子为38，Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。

（3）热源的强度

消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。

（4）氨的蒸馏和吸收及滴定

蒸馏有两种:

1 直接蒸馏（装置简便，准确性好）

2 水蒸汽蒸馏

蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为12×4=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。

吸收液有：

1标准H2SO4 用标准碱返滴定，甲醛红指示剂

2 硼酸 用HCl进行滴定，混合指示剂

目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%。

〈6〉实验注意事项

a.样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。

b.样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。

c.消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml，促使氧化。

d.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

e.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。

f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。

g.氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。

h.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀无。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。

i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。

2 K氏微量定氮仪法

3 K氏半微量定氮仪法 (2 、 3原理一样)

操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。

N（V2-V1）0.014

W＊10／100

计算总氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100

对于微量定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸馏消化液也少，其它基本一样。

4 K氏自动定氮法

原理与上面一样，仪器，采用K氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。

二 水扬酸比色法：

1 原理： 样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。

2 方法 （1）标准曲线的绘制

取6个25ml容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6

分别加空白酸液 2ml

分别加磷酸盐缓冲液 5ml

稀释至总体体积至15ml

分别加水扬酸钠 5ml

37C水浴 15分钟

加入次氯酸钠 2.5ml

37C水浴 15分钟

取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。

（2）样品处理：

准确称样0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化剂→电炉上加热到沸腾后→加大

火力消化→直到出现暗绿色时→摇动瓶子→K氏瓶全部消化后→冷却→加水至250ml容量

瓶。

（3）样品测定：

准确吸取上述消化溶液10ml→于100ml容量瓶中→定容→准确吸2ml→于25ml容量瓶中→加

5ml磷酸缓冲液→以下操作与标准曲线绘制的步骤相同

并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。

（4）计算

C×F

含氮%= ---------------------------× 100

W×1000×1000

C---从标准曲线中查出测定样液的含氮量（Ug）

F---样品溶液的稀释倍数

W---样品重量（g）

pro%=总氮%×K（K可为6.25，也可查）

3注意事项：

A 当天消化液最好当天测定，结果重现性好，如果样液改至第二天比色就有变化。

B 当在PH和试剂适当范围内加入氯源后，颜色的显色和温度有关，应严格控制反应温度。

C 这种方法测定结果基本与K氏法一致。

4 试剂

（1）氯标液：称经110℃干燥2h的硫酸铵0.4719g→于烧瓶中定容10ml→此液1ml相当于

1.0mg氮标液→使用时配制成1ml相当于2.50Ug氮标液。

（2）空白酸液：称0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化剂→与样品一样消化→定容250ml→

使用时吸收此液10ml→加水至100ml为工作液备用。

（3）磷酸盐缓冲液：称7.1g磷酸氢二钠→加38g磷酸三钠→加20g三九石酸钾钠→加400ml水

溶解→过滤→另称35gNaOH溶于100ml水中→冷至室温→缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中→加

入水稀释至1000ml备用。

（4）水扬酸钠溶液：称25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁氰化钠溶于200ml水中过滤，加水稀释

至500ml

（5）次氯酸钠溶液：吸4ml安替富民液，用水稀释至100ml

5 仪器

（1）分光光度计

（2）恒温水浴

三 紫外分光光度法

1 原理：

pro及其降解产物的芳香环基 ，在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在280nm下，光吸收与pro浓度（3~8mg/ml）成直线关系，因此，通过测定pro溶液的吸光度，并参照事先用K氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。

2 试剂：

（1） 0.1mol/l柠檬酸水溶液。

（2）8mol/l脲[（NH2）2CO]的2NNaOH溶液。 脲的2N氢氧化钠液

（3） 95%乙醇

（4） 无水乙醚

3 仪器

（1） 751型的紫外分光光度计

（2） 离心机

4 操作方法

（1）标准曲线的绘制：准确称取样品.2.00g，置于50ml烧瓶中，加入0.1mol/l柠檬酸水溶液30ml，搅拌30分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以每秒钟3000~5000转的速度离心10分钟，分别吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6个10ml容量瓶钟，每个容量瓶，8mol/l脲的氢氧化钠溶液充分摇2分钟（如果离心再次离心），取透明液于比色皿中，在280nm下测定其吸光度。（做参比值）

以事先用K氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量微横坐标上面的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）样品测定

准确称取试样1.00g→于50ml烧杯中→加0.1mol/l柠檬酸溶液30ml→搅拌10分钟→四层纱布过滤到离心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容，摇匀后于280nm下测吸光度，从标准曲线上查出pro的含量。

计算： 蛋白质= C/W× 100

C----从标准曲线上查得的pro含量（mg）

W----测定样品溶液相当于样品量（mg）

说明：

a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性pro样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。

b.温度对pro水解有影响，操作温度应控制在20~30℃。

四 双缩脲法-皮尼克法

1 原理：

双缩脲在碱性条件中，能与CuSO4结合成红紫色的络合物。pro分子中含有肽链与双缩脲结构相似，也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的pro含量。但作为铜的稳定剂，酒石酸钾钠比甘油好些。小麦粉中的pro能直接地一边抽出一边进行定量。

2 试剂

⑴甘油作为稳定剂：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO450ml。

⑵酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO4液40ml。

配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。

3 方法：样品测定

标准曲线绘制

准确称0.6g样品→使用试剂（1）

准确称0.5g样品→使用试剂（2）

假如用试剂（2）

（1）准确称样→0.5g→于80ml离心管→加1mlClC4→混合→加50ml酒石酸钾钠稳定剂→盖上盖子离心10min（4000转/分）→放置1小时→吸混合液15ml→于20ml离心管中→离心到完全透明→取上清夜5ml于→10ml容量瓶→加水定容→于550nm处测定吸光度，从标准曲线上查出pro含量。

（2）标准曲线绘制

按样品测定方法，根据样品中pro含量，取离心澄清样液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于10ml容量瓶中→分别加水定容，按照样品测定其吸光度。

事先用K氏定氮法测定样品中pro含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

4 计算：蛋白质%=C/W×100

C----从标准曲线上查得得pro含量（mg）

W----测定样液时相当于样品重量（mg）

8. GB 6432-1986 饲料粗蛋白测定方法是什么呢

不知道，只知道现在用凯氏定氮法

一、原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4

反应式为：

2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04（其中CuSO4做催化剂）

2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中

反应式为:

(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4

2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O

3.用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量

反应式为：

(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3

二、试剂

所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。

2.1硫酸铜。

2.2硫酸钾。

2.3硫酸。

2.42%硼酸溶液。

2.5混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

2.640%氢氧化钠溶液。

2.70.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。

三、仪器

定氮蒸馏装置：如图所示。

凯氏定氮法仪器1.安全管

2.导管

3.汽水分离管

4.样品入口

5.塞子

6.冷凝管

7.吸收瓶

8.隔热液套

9.反应管

10.蒸汽发生瓶

四、操作方法

1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。

2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

3、向接收瓶内加入10ml2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。

同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。

计算：

X=(（V1-V2）*N*0.014)/(m*（10/100）)*F*100%

X：样品中蛋白质的百分含量，g；

V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；

N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

m：样品的质量（体积），g（ml）；

F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。

五、注意事项

（1）样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

（3）硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。

（4）在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

（5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

（8）氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。

（9）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。

（10）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。

（11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物[Cu(NH3)4]2+

（12）这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。

9. 有机化学实验，怎么检查水蒸气蒸馏装置不漏气呢

1、进行水蒸气蒸馏时，水蒸气导入管的末端为什么要插入到接近于容器的底部？
答：使专瓶属内液体充分加热和搅拌，有利于更有效的进行水蒸气蒸馏
2、在水蒸气蒸馏过程中，经常要检查什么事项？若安全管中水位上升很高时，说明什么问题？如何处理才能解决？
答：：（1）经常要检查安全管中的水位是否正常，有无倒吸现象，蒸馏部分混合物溅飞是否厉害。

（2）说明有某一部分阻塞。

（3）应立即旋开螺旋夹，移去热源，拆下装置进行检查（一般多数是水蒸气导入管下管被树脂状物质或者焦油状物所堵塞）和处理。

10. 在蒸馏实验中，如何检查装置的气密性

1、升高温度法；对于一些制取气体量较小的装置，可采用手握法，把导管回的一端浸在水里，答两手紧贴容器(试管)的外壁，如果装置不漏气，

里面的空气受热膨胀，导管口有气泡放出，手移开后，导气管内水柱上升，且较长时间不回落，说明装置气密性良好。

2、液面差法：用止气夹夹住橡胶导管部分，向长颈漏斗中加水，使之下端浸在水中，继续加水形成一段水柱，产生高度差，在一段时间内水柱不发生回落，说明气密性良好。

气密性检验的原则是，先让装置和附加的液体(一般指水)，构成封闭的整体，改变这个整体的温度，导致压强的变化，来判断气密性好坏，由于装置的不同，检验的方法也有所不同。

(10)粗蛋白蒸馏装置漏气验证方法扩展阅读：

在升高温度法中，如果环境的温度与人体的温度接近，用手握的方法，现象就不够明显，也就是说手的温度与环境的温度差不多时，手握改变不了这个整体的温度及压强。就应该采用微热法。

微热法具体操作为：用酒精灯在容器(可以用酒精灯直接或间接加热的容器)底部微微加热，或把容器浸在热水中，如果水中有气泡放出，停止加热后，导管内有一段水柱，且在一段时间内不回落，说明装置气密性良好。