① 蛋白質的分離方法
1.根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3]。使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低。蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一。凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外。目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]。
2.根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。
等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來。等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8。他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%。另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性。為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。
有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。
萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]。
反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。
3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。
離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純。另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]。
4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21]。范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定。
② 離子交換層析基本信息
離子交換層析是一種利用物質的電荷特性進行分離和純化的技術。其核心是基質，通常是帶有電荷的樹脂或纖維素。這些基質根據其電荷性質可分為兩類：陰離子交換樹脂，帶有正電荷，和陽離子樹脂，帶有負電荷。
在蛋白質分離純化過程中，離子交換層析的原理基於蛋白質的等電點特性。當蛋白質處於不同的pH環境中，其帶電狀態會發生變化。陰離子交換樹脂會結合帶有負電荷的蛋白質，使得這些蛋白質被吸附在柱子上。要將它們分離出來，可以通過逐步提高洗脫液中的鹽濃度，結合較弱的蛋白質首先會脫落下來。
相反，陽離子交換樹脂結合的是帶有正電荷的蛋白質。這些蛋白質的洗脫則需要採用不同的策略，如增加洗脫液中的鹽濃度或者提高其pH值，這樣結合強度較弱的蛋白質會先被釋放出來。通過這樣的方法，離子交換層析能夠有效地實現蛋白質的分離和純化。
離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1
③ 怎樣利用離子交換柱層析法分離不同的蛋白質
離子交換柱層析法的核心在於不同的蛋白質的等電點不同
所以說，利用版離子交換柱層析法分離不同的權蛋白質其實就是利用不同蛋白質不同的等電點來分離。比如目的蛋白等電點是5，那麼在環境pH為8.0的情況下，目的蛋白可以結合陰離子交換層析，而雜蛋白可能不能結合或者結合能力比目的蛋白弱。通過不同的鹽濃度的洗脫讓結合能力不同的蛋白在不同的組分被洗脫出來，最終完成對目的蛋白和雜蛋白的分離。
④ 離子交換層析分離兩性化合物的原理
離子交換層析分離兩性化合物的原理介紹如下：離子交換層析法（ion exchange chromatography，簡稱IEC）是從復雜的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物質的酸鹼性、極性，也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和pH值，物質就能含雹依次從層析柱中分離出來。離子交換層析法大致分為5個步驟：
1. 離子擴散到樹脂表面。
2. 離子通過樹脂擴散到交換位置。
3. 在交換位置進行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的結合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代。
4. 被交換的離子擴散到樹脂表面。
5. 沖洗液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中。
離子交換樹脂的交換反應是可逆的，遵循化學平衡的規律。定量的混合物通過管柱時，離子不斷被交換，濃度逐漸降低，幾乎全部都能被吸附在樹脂上；在沖洗的過程中，由於連續添加新的交換溶液，所以會朝正反應方向移動，因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。
如果被純化的物質是氨基酸類的分子，則分子上的凈電荷取決於氨基酸的等電點和溶液的pH值。所以當溶液的pH值較低，氨基酸分子帶正電荷，它將結合到強酸性的陽離子交換樹脂上；隨著通過的緩沖液pH逐漸增加，氨基酸將逐漸失去正電荷，結合力減弱，最後被洗下來。由於不同的氨基酸等電點不同，這些氨基酸將依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如 apartic acid 和 glutamic acid（在約pH 3~4時），隨後是中性氨基酸，如glycine和alanine。鹼性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的緩沖液中仍帶有正電荷，因此這些在約pH值清大高達10~11時才出現。
⑤ 離子交換層析可用於哪些種類蛋白質的分離
離子交換層析是利用蛋白質在不同PH帶不同種電荷的方法，利用離子交換的方法分離專蛋白的。
離子交換屬內的介質一般是樹脂，陽離子交換型的，使用前樹脂先用鹼處理成鈉型，將氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3時，氨基酸主要以陽離子形式存在，與樹脂上的鈉離子發生交換而被「掛」在樹脂上，再用洗脫劑洗脫。不同的氨基酸（帶的電荷不同）與樹脂的親和力不同，要將其分離洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，反之亦然。
不同反荷離子與樹脂親和力是不同的，其強弱關系為陽性競爭離子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+ 陰性競爭離子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F- 如果某種離子溶液洗脫效果不好，可用另一種親和力強的離子代替之，等電點＞7選擇陽離子交換樹脂，等電點＜7選擇陰離子交換樹脂。
⑥ 離子交換法提取的谷氨酸怎麼結晶呢
離子交換法提取谷氨酸是利用離子交換樹脂對發酵液中谷氨酸與其它同性離子吸附能力的差別 將這些離子選擇性地吸附到樹脂上 然後用洗脫劑先後洗脫 從而得到谷氨酸
谷氨酸是一種兩性電解質 其等電點 為pH3.22.當pH^3.2時 谷氨酸帶正電荷 呈陽離子狀態 它能被陽離子交換樹脂交換吸附
三 儀器與試劑（一）實驗器材 （1）玻璃層析柱 （2）試管 （3）移液管 （4）恆壓洗脫瓶 （5）部分收集器 （6）水浴鍋 （7）分光光度計 （8）電爐
（二）材料與試劑（1）苯乙烯磺酸鈉型樹脂（100～200目）（2）2mo1/L鹽酸溶液（3）2mo1/L氫氧化鈉溶液（4）標准氨基酸溶液 將天門冬氨酸和賴氨酸分別配成2mg/mL的0.1m1/L鹽酸溶液（5）顯色劑。2克水茚三酮溶於95%乙醇中 加水至100毫升
四 操作步驟
（1）樹脂的准備 樹脂過夜㓎泡 使樹脂膨脹 加2mo1/L NaOH至上述樹脂中攪拌2號傾棄鹼液 用蒸餾水洗滌至中性 加25m1 12mo1/L HC1攪拌2h 傾棄酸液 用蒸餾水充洗滌樹脂至中性
（2）層析柱的准備 將強酸性陽離子交換樹脂用HC1處理成H*型後洗至中性 攪拌1小時後裝入層析柱 使之自然降沉到一定高度
（3）加樣分離 將液面緩慢放至貼近層析柱表面 由柱上端仔細加入pH4.5的發酵液離心液3毫升 同時開始收集流出液 每管收集1毫升 測量收集液pH 洗脫液加入速度控制在0.5m1/mim 當樣品液彎月面靠近樹脂頂端時 立即加入發酵液 如此重復 不斷測量收集液的PH值 直至樹脂吸附飽和
（4）洗脫 加樣完畢後 用滴管小心注入60·C4%（或2%）氫氧化鈉溶液（切勿攪動床面）用試管收集洗脫液 每管收集1毫升 同時測量收集液pH 直至收集液