氨基酸和蛋白質離子交換層析

① 蛋白純化--色譜層析

蛋白純化中的色譜層析技術主要包括凝膠過濾色譜、離子交換層析與親和層析。

• 凝膠過濾色譜：

  • 原理：根據分子的流體動力學體積或大小差異來分離蛋白質。分子大小與凝膠孔徑的差異導致其在色譜柱中的洗脫順序不同。
  • 特點：設備簡單，操作方便，重復性好，樣品回收率高。適合分離蛋白質、核酸等大分子物質。但解析度不高，尤其對於分子量相近的物質分離效果有限，且處理量小，樣品粘度不宜太高，分離操作較慢。

• 離子交換層析：

  • 原理：通過離子交換劑與流動相中的離子進行可逆交換來實現分離。根據離子的可離解性、電荷與表面電荷分布的差異進行分離。
  • 特點：廣泛應用於氨基酸、蛋白等生化物質的分離純化。操作相對簡單，但離子強度、pH、溫度、溶劑等條件對分離效果有重要影響。

• 親和層析：

  • 原理：利用分子間的特異性識別和相互作用來分離純化物質，如酶與底物、抗原與抗體之間的結合。
  • 特點：具有高選擇性、高解析度與高結合載量的優點，可以一步完成高純度的分離，適用於多種生物大分子的純化。

② 離子交換層析可用於哪些種類蛋白質的分離

離子交換層析是利用蛋白質在不同PH帶不同種電荷的方法，利用離子交換的方法分離專蛋白的。
離子交換屬內的介質一般是樹脂，陽離子交換型的，使用前樹脂先用鹼處理成鈉型，將氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3時，氨基酸主要以陽離子形式存在，與樹脂上的鈉離子發生交換而被「掛」在樹脂上，再用洗脫劑洗脫。不同的氨基酸（帶的電荷不同）與樹脂的親和力不同，要將其分離洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，反之亦然。

不同反荷離子與樹脂親和力是不同的，其強弱關系為陽性競爭離子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+ 陰性競爭離子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F- 如果某種離子溶液洗脫效果不好，可用另一種親和力強的離子代替之，等電點＞7選擇陽離子交換樹脂，等電點＜7選擇陰離子交換樹脂。

③ 蛋白質水解產物陽離子交換柱層析時的洗脫順序

pI 10.76的那個應該帶正電荷。陽離子交換柱本身帶負電荷。

④ 求問怎麼用離子交換樹脂層析分離混合氨基酸

離子交換樹脂作為一種合成高聚物，不溶於水，能吸水膨脹。高聚物分子由能電離的極性基團及非極性的樹脂組成。極性基團上的離子能與溶液中的離子起交換作用，而非極性的樹脂本身物性不變。通常離子交換樹脂根據所帶基團可分為強酸（＝R＝SO3H）、弱（＝COOH）、強鹼（＝N+＝R：）和弱鹼（＝NH2＝NHR＝NR2）。離子交換樹脂適用於分離小分子物質，如氨基酸、腺苷、腺苷酸等。然而，對於生物大分子如蛋白質，則不太適宜，因為它們不能擴散到樹脂的鏈狀結構中。因此，如果需要分離生物大分子，可以選擇多糖聚合物如纖維素、葡聚糖為載體的離子交換劑。

本次實驗利用磺酸陽離子交換樹脂（Dowex 50）分離混合氨基酸，包括酸性氨基酸（天冬氨酸）、中性氨基酸（丙氨酸）和鹼性氨基酸（賴氨酸）。在特定的pH條件下，這些氨基酸解離程度不同，通過調整脫液pH或離子強度可以實現分離。實驗中所用到的材料包括層析柱、恆流泵、梯度混合器、試管及試管架、紫外分光光度計、2mol/L HCl、2mol/L NaOH、0.1mol/L HCl、0.1mol/L NaOH、pH4.2的檸檬酸緩沖液、pH5的醋酸緩沖液、0.2％中性茚三酮溶液以及氨基酸混合液。

樹脂處理步驟為：首先將樹脂置於100ml燒杯中，加入25ml 12mol/L HCl攪拌2小時，傾棄酸液後用蒸餾水洗滌至中性。隨後，再加入25ml 12mol/L NaOH攪拌2小時，傾棄鹼液後用蒸餾水洗滌至中性。最後，將樹脂懸浮於50ml pH4.2檸檬酸緩沖液中備用。

裝柱步驟包括：取直徑0.8cm～1.2cm、長度10cm～12cm的層析柱，底部墊玻璃棉或海綿圓墊，自頂部注入經處理的樹脂懸浮液。關閉層柱出口，待樹脂沉降後，放出過量溶液，再加入一些樹脂，使樹脂沉積至8cm～10cm高度即可。於柱子頂部繼續加入pH4.2檸檬酸緩沖液洗滌，確保流出液pH為4.2，關閉柱子出口，保持液面高出樹脂表面1cm左右。

加樣、洗脫及洗脫液收集步驟為：打開山口使緩沖液流出，待液面幾乎平齊樹脂表面時關閉出口。用長滴管將15滴氨基酸混合液直接加到樹脂頂部，打開出口使其緩慢流入柱內。當液面剛平樹脂表面時，加入0.1mol/L HCl 3ml，以10滴/分鍾～12滴/分鍾的流速洗脫，收集洗脫液，每管20滴，逐管收存。當HCl液面剛平樹脂表面時，用1ml pH4.2檸檬酸緩沖液沖洗柱壁一次，接著用2ml pH4.2檸檬酸緩沖液洗脫，保持流速10滴/分鍾～12滴/分鍾並注意勿使樹脂表面乾燥。

在收集洗脫液的過程中，逐管用茚三酮檢驗氨基酸的洗脫情況，方法是：於各管洗脫液中加10滴pH5醋酸緩沖液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10分鍾，如溶液呈紫藍色，表示已有氨基酸洗脫下來。顯色的深度可代表洗脫的氨基酸濃度，可比色測。在用pH4.2檸檬酸緩沖液把第二個氨基酸洗脫出來之後，再收集兩管茚三酮反應陰性部分，關閉層析柱出口，將樹脂頂部剩餘的pH4.2檸檬酸緩沖液移去。於樹脂頂部加入2ml 0.1mol/L NaOH，打開出口使其緩慢流入柱內，按上面步驟續用0.1mol/L NaOH洗脫並逐管收集，注意保持流速10滴/分鍾～12滴/分鍾，每管20滴。做洗脫液中氨基酸檢驗，在第三個氨基酸用0.1mol/L NaOH洗脫下來以後，再繼續收集兩管茚三酮反應陰性部分。

最後，以洗脫液管號為橫坐標，洗脫液各管光密度（以水作空白，在570nm波長讀取吸光度）或顏色深淺（以-，±，+，++．．．表示）為縱坐標作圖，即可畫出一條洗脫曲線。

實驗注意事項包括：保持流速10滴/分鍾～12滴/分鍾，並注意勿使樹脂表面乾燥。在裝柱時必須防止氣泡、分層及柱子液面在樹脂表面以下等現象發生。