㈠ 離子交換層析具體操作
離子交換層析操作詳解
1. 預處理和裝柱是離子交換層析的關鍵步驟。首先，對於離子交換纖維素，需要流水沖洗去除碎屑，以確保均勻度。若產品已溶脹，可跳過這步，但需確保其成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑通常採用「鹼-酸-鹼」處理，轉變成-OH-或鹽型，陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，變為-H-型。裝柱前，平衡至所需的pH和離子強度，並減壓排除氣泡。為了防止顆粒分層，裝柱時需適當加壓，確保柱床緊實，以提高解析度。裝好後，需用起始緩沖液淋洗，直至達到平衡狀態方可使用。
2. 加樣與洗脫階段，樣品應與起始緩沖液保持相同的pH和離子強度，選擇的pH值應在交換劑與結合物相反電荷的范圍內，同時離子強度要低，可通過透析、凝膠過濾或稀釋來調整。不溶物需預先除去。合適的上樣量是關鍵，一般不超過柱子的負荷能力，上樣量通常為交換劑總量的1%-5%。洗脫樣品時，可通過改變pH或離子強度，或採用階段洗脫或連續梯度洗脫法，後者通過控制兩個容器中緩沖液濃度的梯度變化來達到最佳分離效果。在洗脫過程中，需確保洗脫液體積充足，梯度上限足夠高且上升速度適中，以防止目的物過早或過晚解吸。
3. 洗脫後的分析，以5-10毫升/管收集洗脫液，通過檢測方法（如生物活性測定或免疫學測定）確定目的物位置，然後進行回收。對於離子交換劑的再生，如纖維素可用NaCl和NaOH溶液處理，脂溶性物質則需非離子型去污劑或乙醇清洗。保存時，需添加防腐劑，陰離子交換劑通常使用氯已定，陽離子交換劑則使用乙基硫柳汞，有些產品可添加疊氮鈉。
離子交換層析操作需嚴格把控各個步驟，確保樣品處理得當，洗脫過程有效，以實現理想的分離效果。
離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1
㈡ 離子交換層析法分離單核苷酸 求一份實驗結果
氨基酸的分離鑒定——紙層析法
一,實驗目的
掌握氨基酸紙層析的方法和原理,學會分析待
測樣品的氨基酸成分.
二,實驗原理
紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析.濾紙纖維上的羥基具有親水性,吸附一層水作為固定相,有機溶劑為流動相.當有機相流經固定相時,物質在兩相間不斷分配而得到分離.
溶質在濾紙上的移動速度用Rf值表示:
Rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質的Rf值是常數.Rf值的大小與物質的結構,性質,溶劑系統,層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關.本實驗利用紙層析法分離氨基酸.
三,實驗器材
(1)大燒杯(5000mL):1隻/組
(2)微量注射器(100 L):1隻/ 組.
(3)噴霧器:公用.
(4)培養皿:1隻/組.
(5)層析濾紙(長22cm,寬14cm的新華一號濾紙):1張/組.
(6)直尺,鉛筆:自備.
(7)電吹風:1隻/組.
(8)托盤,針,白線:1套/組.
(9)手套:1雙/組.
(10)塑料薄膜:公用.
(11)小燒杯:50mL,1隻/組.
四,實驗試劑
(1)擴展劑:將4體積正丁醇和1體積冰醋酸放入分液漏斗中,與5體積水混合,充分振盪,靜置後分層,棄去下層水層.
(2)氨基酸溶液:0.5%的已知氨基酸溶液3種(賴氨酸,苯丙氨酸,纈氨酸),0.5%的待測氨基酸液1種.
(3)顯色劑:0.1%水合茚三酮正丁醇溶液.
實驗試劑
五,實驗操作
檢查培養皿是否乾燥,潔凈;若否,將其洗凈並置於乾燥箱內120℃烘乾.
(1)平衡:剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上,將層析缸或大燒杯到置於塑料薄膜上,再把盛有約20mL展層溶液的小燒杯置於倒置的層析缸或大燒杯中,用塑料薄膜密封起來,平衡20min.
(2)規劃:帶上手套,取寬約14cm,高約22cm的層析濾紙一張.在紙的下端距邊緣2cm處輕輕用鉛筆劃一條平行於底邊的直線A,在直線上做4個記號,記號之間間隔2cm,這就是原點的位置.另在距左邊緣1cm處畫一條平行於左邊緣的直線B,在B線上以A,B兩線的交點為原點標明刻度(以厘米為單位),參見左圖.
(3)點樣:用微量注射器分別取10mL左右的氨基酸樣品(每取一個樣之前都要用蒸餾水洗滌微量注射器,以免交叉污染),點在這四個位置上.擠一滴點一次,同一位置上需點2～3次,2～3mL/次,每點完一點,立刻用電吹風熱風吹乾後再點,以保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm.每人須點4個樣,其中3個是已知樣,1個是待測樣品.
(4)層析:用針,線將濾紙縫成筒狀,紙的兩側
邊緣不能接觸且要保持平行,參見圖3-3.向培養皿中加入擴展劑,使其液面高度達到1cm左右,將點好樣的濾紙筒直立於培養皿中(點樣的一端在下,擴展劑的液面在A線下約1cm),罩上大燒杯,仍用塑料薄膜密封.當擴展劑上升到A線時開始計時,每隔一定時間測定一下擴展劑上升的高度,填入表3-1中.當上升到15～18cm,取出濾紙,剪斷連線,立即用鉛筆描出溶劑前沿線,迅速用電吹風熱風吹乾.
(5)顯色:用噴霧器在通風廚中向濾紙上均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然後立即用熱風吹乾,即可顯出各層析斑點,參見左圖.
(6)計算各種氨基酸的Rf值,並判斷混合樣品中都有哪些氨基酸,各人將自己的實驗結果貼在實驗報告上,見表3-2.
(7)以層析時間為橫坐標,擴展劑上升高度為縱坐標畫圖,求出擴展劑上升到18cm時所需要的時間.
(8)將微量注射器內外用蒸餾水清洗干凈,倒掉用過的展層液和平衡液,將培養皿洗凈,整理好桌面上的儀器和試劑
㈢ 求問怎麼用離子交換樹脂層析分離混合氨基酸
離子交換樹脂作為一種合成高聚物，不溶於水，能吸水膨脹。高聚物分子由能電離的極性基團及非極性的樹脂組成。極性基團上的離子能與溶液中的離子起交換作用，而非極性的樹脂本身物性不變。通常離子交換樹脂根據所帶基團可分為強酸（＝R＝SO3H）、弱（＝COOH）、強鹼（＝N+＝R：）和弱鹼（＝NH2＝NHR＝NR2）。離子交換樹脂適用於分離小分子物質，如氨基酸、腺苷、腺苷酸等。然而，對於生物大分子如蛋白質，則不太適宜，因為它們不能擴散到樹脂的鏈狀結構中。因此，如果需要分離生物大分子，可以選擇多糖聚合物如纖維素、葡聚糖為載體的離子交換劑。
本次實驗利用磺酸陽離子交換樹脂（Dowex 50）分離混合氨基酸，包括酸性氨基酸（天冬氨酸）、中性氨基酸（丙氨酸）和鹼性氨基酸（賴氨酸）。在特定的pH條件下，這些氨基酸解離程度不同，通過調整脫液pH或離子強度可以實現分離。實驗中所用到的材料包括層析柱、恆流泵、梯度混合器、試管及試管架、紫外分光光度計、2mol/L HCl、2mol/L NaOH、0.1mol/L HCl、0.1mol/L NaOH、pH4.2的檸檬酸緩沖液、pH5的醋酸緩沖液、0.2％中性茚三酮溶液以及氨基酸混合液。
樹脂處理步驟為：首先將樹脂置於100ml燒杯中，加入25ml 12mol/L HCl攪拌2小時，傾棄酸液後用蒸餾水洗滌至中性。隨後，再加入25ml 12mol/L NaOH攪拌2小時，傾棄鹼液後用蒸餾水洗滌至中性。最後，將樹脂懸浮於50ml pH4.2檸檬酸緩沖液中備用。
裝柱步驟包括：取直徑0.8cm～1.2cm、長度10cm～12cm的層析柱，底部墊玻璃棉或海綿圓墊，自頂部注入經處理的樹脂懸浮液。關閉層柱出口，待樹脂沉降後，放出過量溶液，再加入一些樹脂，使樹脂沉積至8cm～10cm高度即可。於柱子頂部繼續加入pH4.2檸檬酸緩沖液洗滌，確保流出液pH為4.2，關閉柱子出口，保持液面高出樹脂表面1cm左右。
加樣、洗脫及洗脫液收集步驟為：打開山口使緩沖液流出，待液面幾乎平齊樹脂表面時關閉出口。用長滴管將15滴氨基酸混合液直接加到樹脂頂部，打開出口使其緩慢流入柱內。當液面剛平樹脂表面時，加入0.1mol/L HCl 3ml，以10滴/分鍾～12滴/分鍾的流速洗脫，收集洗脫液，每管20滴，逐管收存。當HCl液面剛平樹脂表面時，用1ml pH4.2檸檬酸緩沖液沖洗柱壁一次，接著用2ml pH4.2檸檬酸緩沖液洗脫，保持流速10滴/分鍾～12滴/分鍾並注意勿使樹脂表面乾燥。
在收集洗脫液的過程中，逐管用茚三酮檢驗氨基酸的洗脫情況，方法是：於各管洗脫液中加10滴pH5醋酸緩沖液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10分鍾，如溶液呈紫藍色，表示已有氨基酸洗脫下來。顯色的深度可代表洗脫的氨基酸濃度，可比色測。在用pH4.2檸檬酸緩沖液把第二個氨基酸洗脫出來之後，再收集兩管茚三酮反應陰性部分，關閉層析柱出口，將樹脂頂部剩餘的pH4.2檸檬酸緩沖液移去。於樹脂頂部加入2ml 0.1mol/L NaOH，打開出口使其緩慢流入柱內，按上面步驟續用0.1mol/L NaOH洗脫並逐管收集，注意保持流速10滴/分鍾～12滴/分鍾，每管20滴。做洗脫液中氨基酸檢驗，在第三個氨基酸用0.1mol/L NaOH洗脫下來以後，再繼續收集兩管茚三酮反應陰性部分。
最後，以洗脫液管號為橫坐標，洗脫液各管光密度（以水作空白，在570nm波長讀取吸光度）或顏色深淺（以-，±，+，++．．．表示）為縱坐標作圖，即可畫出一條洗脫曲線。
實驗注意事項包括：保持流速10滴/分鍾～12滴/分鍾，並注意勿使樹脂表面乾燥。在裝柱時必須防止氣泡、分層及柱子液面在樹脂表面以下等現象發生。