㈠ 為什麼谷氨醯胺易環化n末端
背景技術：
：越來越多的單克隆抗體葯物使用哺乳動物細胞(如cho、bhk等)表達，以確保獲得期望的折疊和糖基化。抗體葯物常呈現微觀不均一性，與小分子葯物相比，具有更加復雜的結構。這些微觀不均一性，例如「異質性」，包括電荷、分子量大小、形態等相關的異構體等，這些異構體來自於哺乳動物細胞培養、純化、制劑、儲存等生產過程的任何階段。其中由於抗體分子電荷差異導致的異質性稱為電荷異構體。採用離子交換層析方法可將抗體大致分為三組峰，以陽離子交換為例，中間峰為主峰，主峰前的峰為酸性異構體，主峰後的峰為鹼性異構體。由於這些異構體可能會對抗體的穩定性、活性、葯代動力學、葯效、免疫原性及安全性造成影響，因此，在治療性重組蛋白下游生產過程中，通常使用不同機制的純化步驟以減少異構體的含量，獲得高純度的單抗製品。人igg1和igg2型抗體大多含有n末端的谷氨酸/谷氨醯胺殘基，並會自發的或在酶催化條件下發生環化反應形成焦谷氨酸。在谷氨醯胺的環化過程中，n末端伯胺(中性ph時帶正電荷)會轉化成中性的醯胺從而導致抗體凈電荷的改變，同時伴隨著一個nh3的脫落。因此，未環化的焦谷氨酸變異體可通過陽離子交換色譜檢測為鹼性異構體，主峰通常為完全環化的異構體。wo2014/161940在利妥昔單抗的純化過程內將蛋白質的n-端谷氨醯胺和/或谷氨酸殘基轉化成焦谷氨酸，其純化步驟包括(a)用適合的樹脂進行蛋白質a捕獲，(b)在3.0-4.0范圍內的ph值下進行病毒滅活，(c)陰離子交換層析，(d)所述蛋白質的n-端谷氨醯胺和/或谷氨酸轉化成焦谷氨酸，(e)用適合的樹脂和梯度洗脫物進行陽離子交換層析以分離產物同種型，(f)病毒過濾，和(g)超濾/透濾(uf/df)。pd-l1(programmeddeath-ligand1)又稱為cd247和b7-h1，是程序性死亡分子1(programmeddeath-1，pd-1)的一個配體。pd-l1在多種腫瘤細胞表面高表達，且腫瘤的惡性程度以及不良預後與pd-l1的表達水平密切相關。在腫瘤微環境中，癌症細胞表面的pd-l1通過與t細胞表面的pd-1或cd80的結合，抑制t細胞的激活和增殖，促進效應t細胞進入衰竭或無反應狀態，誘導t細胞的凋亡，刺激輔助t細胞分化成為調節性t細胞，從而阻止t細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。抗pd-l1抗體可以通過阻斷pd-l1與pd-1及cd80的相互作用，使得相關的負調控信號不能被啟動與傳導，從而避免了在腫瘤微環境中的效應t細胞的活性被抑制，使t細胞可以發揮殺傷和抑制腫瘤細胞的功能。由於抗pd-l1抗體能夠直接作用於腫瘤組織，因而具有較高的特異性和安全性。目前國際上主要的抗pd-l1單抗葯物產品包括羅氏的atezolizumab和阿斯利康的rvalumab。wo2016022630公開了一類抗pd-l1抗體，對pd-l1具有較高的親和力，能夠顯著抑制細胞表面的pd-l1和pd-1的相互作用，並顯著促進t細胞分泌il-2和ifn-γ。因此，為了提高其成葯性，迫切需要開發抗體的純化方法，從而獲得可用於臨床治療的抗體。本發明有效控制了抗體制劑中聚合物的含量以及放置過程中聚合物含量增長、抗體活性維持的問題，從而獲得具有高度穩定性的制劑。技術實現要素：本發明的目的至少在於提供一種純化蛋白的方法。具體地，所述方法包括向蛋白質溶液加入一定量的磷酸鹽、磷酸根離子(po43+)和/或磷酸氫根離子中的一種或幾種，調節ph值，在一定溫度下孵育。在一些方案中，所述加入磷酸鹽、磷酸根離子(po43+)和/或磷酸氫根離子後，磷酸鹽、磷酸根離子(po43+)和/或磷酸氫根離子在蛋白溶液中的濃度為大於或等於約5mmol/l，優選約50mmol/l至500mmol/l，更優選約50-200mmol/l。在一些方案中，所述磷酸鹽為正磷酸鹽，磷酸一氫鹽，磷酸二氫鹽中的一種或幾種，所述磷酸氫根離子為磷酸一氫根和/或磷酸二氫根離子。磷酸一氫鹽的例子如磷酸氫二鉀，磷酸氫二鈉等，磷酸二氫鹽的例子如磷酸二氫鉀，磷酸二氫鈉等。所述磷酸鹽可以是磷酸鹽混合物，例如磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液，在一些具體實施方式中，可以向蛋白溶液中加入ph5.5的2mol/l磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液。在一些方案中，其中所述加入磷酸鹽、磷酸根離子(po43+)和/或磷酸氫根離子後，磷酸鹽、磷酸根離子(po43+)和/或磷酸氫根離子在蛋白溶液中的濃度為約100mmol/l，所述磷酸鹽為正磷酸鹽，磷酸一氫鹽，磷酸二氫鹽中的一種或幾種，所述磷酸氫根離子為磷酸一氫根和/或磷酸二氫根離子。在一些方案中，所述調節ph值至約5.0-6.5，優選約5.5，約5.8或約6.0。在一些方案中，所述孵育時間為約18-30小時，例如18小時，19小時，20小時，21小時，22小時，23小時，24小時，25小時，26小時，27小時，28小時，29小時，30小時，優選約24小時。在一些方案中，所述孵育溫度為約30-45℃，例如30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃，45℃，優選約35-40℃，更優選約35℃或38℃。在一些方案中，所述方法還包括用水或鹽溶液稀釋樣品以終止反應，可選地，用水或鹽溶液稀釋樣品至電導率降至約10ms/cm以下，來終止反應，優選地，電導率降至約5ms/cm以下來終止反應。水或鹽溶液可以使用本領域常用的去離子水，蒸餾水，雙蒸水，或其他可用於蛋白純化的水或鹽溶液，緩沖液等。在一些方案中，所述方法包括向蛋白質溶液加入約100mmol/l磷酸根，調節ph值至約5.5-5.8，在恆溫設備中孵育約24小時，保持溫度在約35-38℃范圍內，之後用水稀釋樣品至電導率降至約5ms/cm以下終止反應。本發明的目的至少還在於提供一種蛋白的純化方法，所述蛋白質末端谷氨醯胺或谷氨酸轉化為焦谷氨酸。本發明的目的至少還在於提供一種純化蛋白的方法，其特徵在於先將所述蛋白的末端谷氨醯胺和/或谷氨酸轉為為焦谷氨酸，再對蛋白進行陰離子交換層析。在一些方案中，向蛋白質溶液加入一定量的磷酸鹽、磷酸根離子(po43+)和/或磷酸氫根離子中的一種或幾種，調節ph值，在一定溫度下孵育，終止反應，對終止反應後獲得的蛋白溶液進行陰離子交換層析。本發明還提供一種純化蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：(a)親和層析；(b)病毒滅活；(c)深層過濾；(d)焦谷氨酸轉化；(e)陰離子交換層析；(f)陽離子交換層析；(g)病毒過濾和/或超濾。在一些具體實施方案中，親和層析包括但不限於消毒、平衡、上樣、淋洗三次、洗脫等步驟；病毒滅活可以通過在ph為3.5-4的檸檬酸緩沖液中，20～25℃下維持100-150分鍾；深層過濾；陰離子交換層析可以採用常規或商業化的各種填料，例如採用poros50hq陰離子填料，其步驟包括但不限於預平衡、平衡、上樣、平衡、再生、平衡、保存，其中預平衡液可選自500mmol/l乙酸鈉-乙酸緩沖液(ph5.5-6.0)，平衡液可選自50mmol/l乙酸鈉-乙酸緩沖液；焦谷氨酸轉化的例子包括2mol/l磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉溶液(ph5.5)，40℃恆溫孵育24h，將溶液稀釋至電導率≤5ms/cm以終止反應；陽離子交換層析可以採用常規填料，或商業化的填料，例如採用porosxs陽離子填料，其步驟包括但不限於平衡，上樣，淋洗，洗脫等；病毒過濾和/或超濾。本發明提供降低單克隆抗體電荷異構體、提高其純度的方法，通過在中間體中加入一定量磷酸根至100mmol/l，調節ph值至5.5～5.8，在恆溫設備中孵育24小時，保持溫度在35～38℃范圍內。之後用水稀釋樣品至電導率降至5ms/cm以下終止反應。在一些具體的實施方案中，所述蛋白是單克隆抗體，可選地，是結合人pd-l1的單克隆抗體或結合人cd20的單克隆抗體，包括但不限於nivolumab，pembrolizumab，ibi308，atezolizumab，avelumab，ravulumab，利妥昔單抗等，和/或wo2016022630中公開的全部pd-l1單克隆抗體，包括但不限於13c5，5g9，5g11，8c6，7b4，4d1，4a8，8h4，8h3，15f1等。在一些具體的實施方案中，所述蛋白是單克隆抗體，可選地，是人igg1，igg2型抗體和/或是含有n末端的谷氨酸/谷氨醯胺殘基的抗體。本發明的制備方法至少具有如下有益效果：採用向中間體中加入磷酸根進行孵育，控制孵育時間及溫度即可降低單抗中鹼性異構體，此方法溫和、易於控制，極大降低了生產復雜性，大大提了pd-l1單抗的純度。本發明還提供一種高度穩定的葯物組合物，其特徵在於：所述葯物組合物包含抗體，並至少包含緩沖液、等滲調節劑、穩定劑和/或表面活性劑中的一種或幾種。特別地，所述葯物組合物包含1-150mg/ml抗pd-l1人源化單克隆抗體(單抗)、3-50mm緩沖液、2-150mg/ml等滲調節劑/穩定劑和0.01-0.8mg/ml表面活性劑，且ph為約4.5-6.8。該制劑能阻止其中抗體的聚合物增長，同時，能長時間較好的維持抗體的生物結合活性，從而獲得具有高度穩定性的制劑。在一些方案中，以w/v計算，抗pd-l1人源化單抗濃度約為5-150mg/ml；優選為約10-60mg/ml；更優選為約10-30mg/ml。在一些具體方案中，抗pd-l1人源化單抗質量體積濃度約10mg/ml、約20mg/ml、約30mg/ml、約40mg/ml、約50mg/ml、約60mg/ml、約70mg/ml、約80mg/ml、約90mg/ml、約100mg/ml、約110mg/ml或約120mg/ml，優選為10mg/ml、約20mg/ml、約30mg/ml、約40mg/ml、約50mg/ml或約60mg/ml，更優選為約10mg/ml、約20mg/ml或約30mg/ml。在一些實施方案中，抗pd-l1人源化單抗質量體積濃度約10mg/ml。在另一些實施方案中，抗pd-l1人源化單抗質量體積濃度約30mg/ml。在另一些實施方案中，抗pd-l1人源化單抗質量體積濃度約60mg/ml。在一些方案中，所述緩沖液選自枸櫞酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、組氨酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液；優選枸櫞酸鹽緩沖液或組氨酸鹽緩沖液；更優選組氨酸鹽緩沖液。在一些方案中，所述緩沖液濃度約為4.5-50mm，優選約為5-25mm，更優選約為10-20mm，最優選約為10-15mm。在一些方案中，所述緩沖液為組氨酸鹽緩沖液。所述組氨酸鹽緩沖液濃度約為5-30mm，優選約為10-25mm，更優選為約為10-20mm，最優選約為10-15mm。在一些具體方案中，所述組氨酸鹽緩沖液約5mm、約10mm、約15mm、約20mm、約25mm或約30mm。在一些實施方案中，所述組氨酸鹽緩沖液約10mm。在另一些實施方案中，所述組氨酸鹽緩沖液約15mm。在另一些實施方案中，所述組氨酸鹽緩沖液約20mm。其中，所述組氨酸鹽緩沖液包含組氨酸和鹽酸。在一些方案中，所述緩沖液為醋酸鹽緩沖液。所述醋酸鹽緩沖液濃度約為5-30mm，優選約為10-25mm，更優選約為10-20mm，最優選約為10-15mm。其中，所述醋酸鹽緩沖液包含醋酸鹽和醋酸。本發明所述的「醋酸鹽」包括醋酸的葯學上可接受的各種無機酸鹽或有機酸鹽或其水合物，包括但不限於醋酸鉀或其水合物、醋酸鈉或其水合物；優選地，所述醋酸鹽為醋酸鈉或三水合醋酸鈉。在一些方案中，所述緩沖液為枸櫞酸鹽緩沖液。所述枸櫞酸鹽緩沖液濃度約為3-30mm，優選約為4.5-30mm，更優選約為5-20mm，最優選約為5-10mm。在一些具體方案中，所述枸櫞酸鹽緩沖液約5mm、約10mm、約15mm、約20mm或約25mm。在一些實施方案中，所述枸櫞酸鹽緩沖液約5mm。在另一些實施方案中，所述枸櫞酸鹽緩沖液約10mm。在另一些實施方案中，所述枸櫞酸鹽緩沖液約15mm。本發明所述的「枸櫞酸」包括枸櫞酸本身以及枸櫞酸的水合物，例如一水合枸櫞酸；所述「枸櫞酸鹽」包括枸櫞酸的葯學上可接受的各種無機酸鹽或有機酸鹽或其水合物，包括但不限於枸櫞酸鉀或其水合物、枸櫞酸鈉或其水合物；優選地，所述枸櫞酸鹽為枸櫞酸鈉或二水合枸櫞酸鈉。在一些方案中，等滲調節劑/穩定劑選自氯化鈉、甘露醇、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、木糖醇中一種或一種以上；優選氯化鈉、甘露醇和蔗糖中的一種或者一種以上；最優選蔗糖。在一些方案中，所述等滲調節劑/穩定劑的含量為約4-150mg/ml，優選為約6-120mg/ml，更優選為約40-100mg/ml，最優選為約60-80mg/ml。在一些方案中，以w/v計算，所述等滲調節劑/穩定劑為約20-150mg/ml的蔗糖，優選約為40-100mg/ml的蔗糖，更優選約為60-80mg/ml的蔗糖。在一些具體方案中，所述蔗糖的質量體積濃度約為40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。在一些具體實施方案中，所述蔗糖的質量體積濃度約60mg/ml。在一些具體實施方案中，所述蔗糖的質量體積濃度約70mg/ml。在一些具體實施方案中，所述蔗糖的質量體積濃度約80mg/ml。在一些具體實施方案中，所述蔗糖的質量體積濃度約90mg/ml。在一些具體方案中，以w/v計算，所述等滲劑/穩定劑為含質量體積濃度約5-20mg/ml氯化鈉溶液，優選為約5-10mg/ml氯化鈉溶液，更優選為6mg/ml氯化鈉溶液。在一些具體方案中，以w/v計算，所述等滲劑/穩定劑為含質量體積濃度約10-40mg/ml的甘露醇，優選約為10-30mg/ml的甘露醇，更優選約為20mg/ml的甘露醇。在一些方案中，所述表面活性劑選自聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆188；優選聚山梨酯80或聚山梨酯20；更優選為聚山梨酯80。在一些方案中，以w/v計算，所述表面活性劑的濃度約為0.05-0.6mg/ml，優選約為0.1-0.4mg/ml，更優選約為0.2-0.3mg/ml。在一些具體方案中，以w/v計算，所述表面活性劑為約0.01-0.8mg/ml的聚山梨酯80或聚山梨酯20。在一些具體方案中，所述表面活性劑為約0.05-0.6mg/ml的聚山梨酯80，優選約為0.1-0.4mg/ml的聚山梨酯80，更優選約為0.2-0.3mg/ml的聚山梨酯80，最優選約為0.2mg/ml的聚山梨酯80。在一些實施方案中，所述葯物組合物中聚山梨酯80含量約為0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml或0.6mg/ml；優選地，所述葯物組合物中聚山梨酯80含量約為0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml或0.5mg/ml；更優地，所述葯物組合物中聚山梨酯80含量約為0.2mg/ml、0.3mg/ml或0.4mg/ml；最優地，所述葯物組合物中聚山梨酯80含量約為0.2mg/ml。在一些實施方案中，所述葯物組合物中聚山梨酯80含量約0.1mg/ml。在另一些實施方案中，所述葯物組合物中聚山梨酯80含量約0.2mg/ml。在一些實施方案中，所述葯物組合物中聚山梨酯80含量約0.3mg/ml。在另一些實施方案中，所述葯物組合物中聚山梨酯80含量約0.4mg/ml。在一些實施方案中，所述葯物組合物中聚山梨酯80含量約0.5mg/ml。在一些方案中，所述葯物組合物的水溶液ph值選自4.0-6.8；優選4.5-6.5；更優選為5.5-6.0；最優選5.5。在一些實施方案中，葯物組合物水溶液的ph值為約4.5、約4.8、約5.0、約5.2、約5.4、約5.5、約5.6、約5.8或約6.0，優選為約5.0、約5.2、約5.4、約5.5或約5.6，更優選為約5.5。在一些實施方案中，葯物組合物水溶液的ph值為約5.0。在一些實施方案中，葯物組合物水溶液的ph值為約5.2。在一些實施方案中，葯物組合物水溶液的ph值為約5.4。在一些實施方案中，葯物組合物水溶液的ph值為約5.5。在一些實施方案中，葯物組合物水溶液的ph值為約5.6。在一些實施方案中，葯物組合水溶溶液的ph值為約5.8。在一些實施方案中，葯物組合物水溶液的ph值為約6.0。優選地，本發明提供的抗pd-l1人源化單抗包含如下氨基酸序列：與seqidno:1或seqidno:4所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的重鏈cdr1區；與seqidno:2或seqidno:5所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的重鏈cdr2區；與seqidno:3或seqidno:6所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的重鏈cdr3區；與seqidno:7或seqidno:10所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的輕鏈cdr1區；與seqidno:8或seqidno:11所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的輕鏈cdr2區；與seqidno:9或seqidno:12所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的輕鏈cdr3區。在一個具體實施方案中，本發明提供的抗pd-l1人源化單抗包含如下氨基酸序列：選自seqidno:1或seqidno:4的重鏈cdr1區；選自seqidno:2或seqidno:5的重鏈cdr2區；選自seqidno:3或seqidno:6的重鏈cdr3區；選自seqidno:7或seqidno:10的輕鏈cdr1區；選自seqidno:8或seqidno:11的輕鏈cdr2區；選自seqidno:9或seqidno:12的輕鏈cdr3區。優選地，本發明提供的抗pd-l1人源化單抗包含如下氨基酸序列：與seqidno:13或seqidno:14所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的重鏈可變區；與seqidno:15或seqidno:16所示的氨基酸序列有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同源性的輕鏈可變區。在一個具體實施方案中，本發明提供的抗pd-l1人源化單抗包含如下氨基酸序列，如seqidno:13所示的重鏈可變區；如seqidno:15所示的輕鏈可變區。在另一個具體實施方案中，本發明提供的抗pd-l1人源化單抗包含如下氨基酸序列，如seqidno:14所示的重鏈可變區；如seqidno:16所示的輕鏈可變區。在一個具體實施方案中，本發明提供的抗pd-l1人源化單抗包含如seqidno.17所示的重鏈氨基酸序列，和seqidno.18的輕鏈氨基酸序列。在另一個具體實施方案中，本發明提供的抗pd-l1人源化單抗包含如seqidno.19所示的重鏈氨基酸序列，和seqidno.20的輕鏈氨基酸序列。在另一個具體實施方案中，本發明提供的抗pd-l1人源化單抗包含如seqidno.21所示的重鏈氨基酸序列，和seqidno.18的輕鏈氨基酸序列。優選的，本發明提供的抗pd-l1人源化單抗為糖基化的。在一些方案中，葯物組合物為水溶性注射液，所述水溶性注射液包括但不限於未經凍乾的水溶性制劑或凍乾粉重構的水溶性制劑。在另一些方案中，葯物組合物為凍干制劑。所述凍干制劑是指經歷凍干過程制備制劑，凍干是一個穩定化過程，其中物質首先被冷凍，然後先通過升華降低溶劑數量(初級乾燥過程)，然後通過脫附作用降低溶劑數量(二級乾燥過程)，直到溶液數量為不再支持生物學活性或化學反應的值。本發明的凍干制劑還可以通過本領域已知的其它方法乾燥，如噴霧乾燥和鼓泡乾燥(bubbledrying)。本發明提供的制劑，其在2～8℃或25℃保存至少6個月的情況下聚合物不超過1.1％，優選地不超過0.9％，更優選為不超過0.5％。在本發明的另一個方面，本發明還提供製備前述的葯物組合物的方法，包括將抗pd-l1人源化單抗與其他試劑相混合，例如與緩沖液、等滲調節劑/穩定劑和/或表面活性劑中的一種或幾種相混合。在本發明的又一個方面，本發明還提供用於治療受試者中瘤形成病狀的方法，包括給所述受試者施用前述的葯物組合物。除特別聲明外，本發明中的「約」是指在所給定的具體數值范圍±5％范圍內波動，優選在±2％范圍內波動，更優選在±1％范圍內波動。例如ph值為約5.5表示ph為5.5±5％，優選ph為5.5±2％，更優選ph為5.5±1％。本文中「聚合物」是指抗pd-l1人源化單抗由於肽鏈上的氨基酸殘基相互作用或是分子間因疏水作用或者靜電作用等，發生聚集而產生的聚合物。本文中「降解物」是指抗pd-l1人源化單抗在水溶液中經脫醯胺或肽鏈斷裂等反應中產生的比抗pd-l1人源化單抗分子量小的產物。本發明制備的高質量的抗pd-l1人源化單抗制劑具有高度的穩定性，解決了產品中聚合物含量過高影響產品安全性的問題，同時也解決了放置過程中聚合物含量增長影響制劑穩定性以及維持抗體活性的問題。附圖說明圖1pd-l1焦谷氨酸環化設計空間具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步的描述，然而，本發明中這些實施例僅用於闡明而不限制本發明的范圍。同樣，本發明不限於本文描述的任何具體優選的實施方案。本領域技術人員應該理解，對本發明技術特徵所作的等同替換，或相應的改進，仍屬於本發明的保護范圍之內。除特別說明的以外，以下實施例採用的試劑均為市售產品，溶液的配製可以採用本領域常規技術。實施例中抗pd-l1人源化單抗按wo2016022630中所述方法製得，經親和層析後，按常規的抗體純化方法得到含有該抗體的洗脫液。實施例1酸區、鹼區異構體含量的測定弱陽離子交換色譜根據待分析物所帶電荷數的差異進行分離，能夠分離單克隆抗體中的電荷異構體。樣品在低鹽、中性ph下帶正電荷，吸附在色譜柱上，採用鹽濃度和/或ph梯度進行洗脫，各電荷異構體組分按照等電點由低到高的順序依次被洗出，通過紫外檢測。採用峰面積歸一法可確定樣品的主峰含量，酸性峰含量和鹼性峰的含量。採用具有紫外檢測器的thermou3000高效液相色譜儀進行，平衡色譜柱至基線平穩，流動相a：20mmol/l磷酸二氫鈉ph6.5±0.1，10％乙腈，流動相b：20mmol/l磷酸二氫鈉，300mmol/l氯化鈉，ph7.0±0.1，10％乙腈。各參數見下表1：表1弱陽離子交換色譜液相分析參數對於抗pd-l1人源化單抗5g11，由於該抗體分子n端富含谷氨酸/谷氨醯胺，帶正電荷多，因此在cex-hplc檢測時表現鹼性峰含量高(30％以上)。為了降低鹼性峰含量，將抗體蛋白和磷酸鹽一起在高溫下孵育一定時間，可以實現谷氨酸/谷氨醯胺失去正電荷而環化為焦谷氨酸，從而使鹼性峰朝著主峰和酸性峰方向轉化。實施例2實驗設計優化焦谷氨酸環化工藝為了獲得適用於生產的焦谷氨酸環化工藝，獲得
㈡ CEX是什麼 cation exchange chromatography
陽離子交換色譜