A. 超濾離心管如何選擇以及使用方法
超濾離心管在蛋白質、DNA和生物分子的濃縮、純化和脫鹽過程中被廣泛應用。選擇和使用超濾離心管時，需要理解其與微濾的區別。
微濾（Microfiltration）利用微孔膜介質去除溶液中尺寸為0.1 μm至10.0 μm的顆粒或生物體，廣泛應用於生物制葯預過濾和除菌過濾。微濾在細胞實驗中常用於樣品和培養基滅菌，以及從細胞裂解物中去除完整細胞和碎片，確保下游應用結果准確性。
超濾（Ultrafiltration）通過壓力或濃度梯度使料液通過半透膜進行分離，能截留尺寸范圍為1-1000kDa的分子，並允許鹽和水等小分子通過。它廣泛應用於蛋白質溶液的分離和純化，以及核酸樣品制備，如分子克隆和質粒純化。與沉澱法相比，超濾更為溫和，避免生物大分子失活。
超濾離心管是一種利用離心力驅動溶液通過超濾膜進行快速濃縮、滲濾和緩沖液置換的裝置，由蓋子、過濾裝置和離心管組成。通過選擇適合的膜孔徑，可進行除熱源、澄清和分離大分子污染物，或濃縮和脫鹽目標分子。
選擇超濾離心管時，需考慮樣品起始量及超濾膜的截留分子量（MWCO）。樣品體積決定離心管尺寸，而截留分子量則需根據目標大分子的分子量選擇，通常選擇比目標分子小2-3倍的膜。
使用超濾離心管涉及准備、加樣、離心和回收步驟。准備階段需沖洗設備以消除甘油殘留，然後在離心前加入適量純水或緩沖溶液。離心前確保離心機轉子平衡，以保持穩定。回收時，從過濾裝置或離心管中輕輕提取樣品，注意不要接觸或損壞超濾膜。
遵循上述步驟，正確選擇和使用超濾離心管，將有效實現蛋白質、DNA和生物分子的高效濃縮、純化和脫鹽，為科學研究和工業應用提供可靠支持。
B. 外泌體的提取方法簡介
外泌體的提取方法簡介
外泌體在1983年首次在綿羊網織紅細胞中被發現，是一種直徑在30~150nm的類囊泡小體，屬於細胞外囊泡的一種。它們存在於多種生物體液中，如動植物細胞培養上清液、血漿、血清、唾液、尿液、腹水等，且在形成過程中內含特異蛋白和核酸等物質，如微管蛋白、肌動蛋白、熱休克蛋白以及信使RNA、微小RNA等。
外泌體作為葯物遞送載體具有三個顯著優勢：一是生物相容性好，免疫原性低，如未成熟的樹突狀細胞及間充質幹細胞，有利於葯效發揮和減少不良反應；二是外泌體包含特定的磷脂和功能性膜蛋白，通過膜融合和間隙連接等途徑避開內涵體-溶酶體途徑，高效率地將內含物遞送到胞質中；三是外泌體具有一定的天然靶向性，能夠參與機體免疫應答、抗體提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等過程，且作為納米載體能夠將基因或葯物運至靶器官，在臨床治療中有較好的應用前景。
因此，分離和提取外泌體，分析其組成和功能具有重要意義。本文將對外泌體的提取方法進行介紹。
1.基於離心的方法
超速離心法是分離外泌體的經典方法，利用外泌體與污染物在大小和密度上的差異，通過梯度離心實現分離和富集。此法在4℃條件下進行多次離心，去除細胞與碎片後，通過100000g超速離心達到目的。雖然操作簡單、獲取外泌體數量較多，但設備成本大、每次處理樣本數量有限、耗時長且存在外泌體聚集現象。在超高速離心基礎上，使用蔗糖密度梯度離心可以得到更高純度的外泌體，但前期准備工作繁瑣，且外泌體中可能含有難以去除的化學物。
2.基於尺寸大小的方法
超濾離心法利用截留分子中最大分子的截留分子量（MWCO）進行分離，通過選擇不同規格的超濾膜，使外泌體與其他大分子物質分離。這種方法簡單、省時，不影響外泌體的生物活性，但純度較低。
分子排阻色譜法（SEC）基於分子尺寸大小分離外泌體，樣品在多孔固定相中流動時，較小的雜質進入多孔不易洗出，而粒徑較大的外泌體較快流出，實現分離。利用這種方法的qEV試劑盒操作簡單、獲得外泌體純度高，但上樣體積有限，否則會降低分離效率。
3.基於免疫吸附的方法
免疫磁珠法利用外泌體表面特定抗原能與單克隆抗體結合的原理，通過抗體分離外泌體。具體步驟包括磁珠與外泌體共同孵育、離心收集、蒸餾水沖洗後重懸於緩沖液中。此法保證了外泌體的特異性良好和形態完整，操作簡單、成本低，但溶劑pH和濃度影響外泌體生物活性，且磁珠成本高，普及受限。
4.基於聚沉的方法
聚乙二醇（PEG）沉澱法在過去幾十年裡被用於病毒的富集，利用PEG的親水性改變外泌體的溶解度或分散性使其沉澱。此法操作簡單、無需特殊設備，產量高，適合下游分析試驗，但可能會沉澱非外泌體物質和大分子，純度不高。在沉澱前預處理去除細胞碎片，加入沉澱劑在4℃過夜孵育後，再通過SEC、離心法或濾膜有效去除蛋白聚合物及大分子囊泡，可提高外泌體純度。
5.基於微流控的方法
微流控技術利用微納米管道處理流體，是一種基於外泌體物理和生物化學性質的微尺度分離方法。除了基於免疫親和力、大小和密度的分離，還可以實現電泳和電磁操作等創新分選機制。然而，微流控技術缺乏標准化和大規模臨床樣本測試，缺少方法驗證，難以實現大規模應用。
總結而言，超速離心法仍是分離外泌體最常用的方法之一，結合蔗糖密度梯度離心可以得到更純凈的外泌體。盡管如此，設備成本大、耗時、處理量小等問題仍需關注。隨著外泌體相關研究的增加，更高效高產地分離純凈外泌體對推動外泌體相關制劑的研究和應用至關重要。