⑴ 考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量的原理是什麼
在酸性條件下，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質疏水區結合，導致最大吸收峰由465 nm 變為595 nm，同時顏色也由棕色變為藍色,該藍色化合物顏色的深淺與蛋白質濃度的高低成正比關系。將蛋白質樣品或稀釋的BSA 與Bradford試劑混合，測量在595 nm處的吸收值，在建立由一系列稀釋的BSA建立的標准曲線的情況下，蛋白質的濃度可以根據標准曲線而確定。
考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合後變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用於蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩定。
該法是1976年Bradford建立，試劑配製簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測2.5μg/mL蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。
考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由於與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。
考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程：
該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的，但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然後，用蒸餾水補充至1000ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。
2．標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標准。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。
3．將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現沉澱，過濾除去。
5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．
6．根據標准曲線計算待測樣本的濃度。
⑵ 考馬斯亮藍g250配製，溶解時間
一般攪拌20分鍾吧，完全溶解不太可能，攪拌後加上水會容的更多一些，最後要過濾的