離子交換色譜柱scx填料

1. 液相色譜C18色譜柱特點及相關參數

GP-C18 Bio-C18 Amethyst(紫晶) 色譜柱-美國賽分-sepax-北京康農興牧
常規用途分析型液相色譜柱 >> 反相液相色譜柱（RPLC）介紹：

GP-C18色譜柱(GP-C8,GP-C4詳見產品手冊) •方法開發的首選柱，
•高度可控的單分子層形成和封尾技術
•高的柱間重現性
•高的選擇性和分離效率
•適合分離酸性、中性和鹼性化合物，以及許多葯物、多肽等
•推薦使用有機溶劑或有機溶劑/水體系的流動相

可替代Symmetry C18、LunaTMC18、Symmetry Shield RP18、LunaTMDiscoveryTMC18、Zorbax Eclipse XDB C18、Inertsil ODS-2 ODS-3、SupelcosilTMLC-18-DB、Kromasil C18、lTSKgel ODS-100Z
GP-C18以全覆蓋的鍵合硅膠為填料，具有優異的穩定性。獨特的單官能團化學鍵合技術可避免形成復合的C18分子層。均勻的塗層確保了固定相具有高選擇性和高效率的分離特點。
GP-C18填料技術參數
硅膠：球形,高純度(<10ppm金屬雜質)
孔徑：120Å
粒徑：1.8、2.2、3、4、5、7和10µm
孔體積：1.0mL/g
比表面積：300m²/g
固定相結構：單層全封尾
碳載量：17%
PH值范圍：2-11
HP-C18色譜 柱
•可使用100%的水相做流動相
•高度可控的單分子層形成和封尾技術
•高的柱間重現性
•高的選擇性和分離效率
•適合分離酸性、中性和鹼性化合物，以及許多葯物、多肽等
可替代AquasilC18、ArlantisTM、Zorbax SB-Aq SynergiHydro-RP、HydroBondPS C18、HydroBond AQ、UltraAqueous C18、ProntoSIL C18 AQ、YMC-Pack ODS-AQ、EliteSino ChromODSBP TSKgelODS100V HP-C18填料技術參數
硅膠：球形,高純度(<10ppm金屬雜質)
孔徑：120Å / 200Å（用於大分子）
粒徑：3、4、5、7、10µm / 3、5、10µm
孔體積：1.0mL/g
比表面積：300m²/g /200m²/g
固定相結構：單層全封尾
碳載量：17% / 10%
PH值范圍：2.0-9.0
BR-C18色譜柱
•高度可控的單分子層形成和封尾技術
•高的柱間重現性
•高的選擇性和分離效率
•寬的pH適用范圍1.5-10.5
•適合分離酸性、中性和鹼性化合物，以及許多多肽和蛋白等

可替代Zorbax Extend C18 Vydac218TP C18; ;Jupite300 C18 BR-C18填料技術參數
硅膠：球形，高純度(<10ppm金屬雜質)
孔徑：120Å
粒徑：3、5和10µm
孔體積：1.0mL/g
比表面積：350m²/g
固定相結構：單層全封尾
碳載量：19.5%
PH值范圍：1.5-10.5
Bio-C18色譜柱
Bio-C18填料有200和300Å兩種孔徑規格，適合於肽段的指紋圖譜識別，天然和人工合成多肽以及低分子量蛋白等的分離。所採用的化學鍵合技術可以確保ODS單分子層不會在純水溶液中發生塌陷。
•高度可控的單分子層形成和封尾技術
•高的柱間重現性
•高的選擇性和分離效率
•可使用純水作為流動相
•適合分離多肽、蛋白以及許多葯物等
可替代XterraC18;XbridgeC18 Bio-C18填料技術參數
硅膠：球形,高純度(<10ppm金屬雜質)
孔徑：200Å / 300Å
粒徑：3、4、5和10µm / 3和5µm
孔體積：1.0mL/g / 0.95mL/g
比表面積：200m²/g / 105m²/g
固定相結構：單層全封尾
碳載量：10% / 7%
PH值范圍：2.0-9.0
Amethyst(紫晶) P分析型液相色譜柱
通用型C18，推薦中葯分離選擇此柱。
• 採用高度可控的單官能團鍵合和封尾技術
• 高的柱間重現性
• 高的選擇性和分離效率
• 可在pH 1.5-9.0范圍內使用
• 適合分離許多葯物分子以及多肽等
• 可用100%水作為流動相

Amethyst C18-P填料技術參數
硅膠：球形,高純度(金屬雜質<10ppm)
孔徑：120Å
粒徑：3、5和10µm
孔體積：1.0mL/g
比表面積：300m²/g
固定相結構：單官能團全封尾
碳載量：20.0%
pH值范圍： 1.5-9.0
Amethyst(紫晶) H分析型液相色譜柱
Amethyst C18-H 一般用途C18 ，推薦西葯如抗生素葯的分離選擇此柱。
• 採用高度可控的單分子層形成和封尾技術
• 高的柱間重現性
• 高的選擇性和分離效率
• 最高可耐受pH值至11
• 可在pH 1.5-10..5范圍內使用
• 適合分離酸性、中性和鹼性化合物，以及多肽和蛋白等 Amethyst C18-H填料技術參數
硅膠：球形,高純度(金屬雜質<10ppm)
孔徑：120Å
粒徑：3、5和10µm
孔體積：1.0mL/g
比表面積：350m²/g
固定相結構：三官能團單分子層全封尾
碳載量：19.0%
pH值范圍： 1.5-10.5
Sapphire(寶石)分析型液相色譜柱
Sapphire C18 復雜樣品的分離
• 採用高度可控的單分子層形成和封尾技術
• 高的柱間重現性
• 對疏水和親水化合物都具有高選擇性和分離效率
• 與其它C18填料相比具有更大的比表面積，更長的樣品保留時間，以及更高的上樣量
• 特為鹼性化合物如胺類等的分離而設計
• 可用純水作為流動相
• 適合分離酸性、中性和鹼性化合物，以及許多葯物分子和多肽等 Sapphire C18填料技術參數
硅膠： 球形,高純度(金屬雜質<10ppm)
孔徑：100Å
粒徑：3、5和10µm
孔體積：1.05mL/g
比表面積：450m²/g
固定相結構：單官能團全封尾
碳載量：17.0%
pH值范圍： 1.5-9.0
體積排阻柱 SRT-SEC SRT-SEC 可完全替代TSK 凝膠柱。
SRT SEC固定相是以高純度具有良好機械穩定性的硅膠為基質，表面化學鍵合有一層均一、親水、納米厚度的中性聚合物薄膜。該固定相的合成採用賽分公司獨有的表面化學鍵合技術，可確保柱與柱之間的高度重現性。SRT SEC固定相具有高的化學和機械穩定性，與生物分子等之間的非特異性相互作用也很小。孔徑規格有100、150、300、500、1000和2000Å，可確保高分離容量解析度
Nanofilm-SEC Nanofilm-SEC 針對柱容性蛋白，解決TSK 壽命問題的色譜柱，使用壽命更長。
Nanofilm SEC固定相是以高純度具有良好機械穩定性的硅膠為基質，表面化學鍵合有一層均一、親水、納米厚度的中性聚合物薄膜。該固定相的一個特點是可使用低鹽濃度，或含有機溶劑的緩沖液作為流動相進行生物樣品的分離，並具有高的解析度和樣品回收率。該色譜填料為窄粒徑分布的球形硅膠顆粒。孔徑規格有150、250、450和950Å。
離子交換柱 硅膠基質 HP-SCX 推薦用於鹽酸二甲雙胍的分析新康泰克葯物的分析
HP-SAX 推薦用於核苷類物質的分析草柑膦的分析
聚合物基質 Proteomix離子交換色譜柱
推薦用於蛋白質、低聚核苷酸和多肽的分離而設計，具有高解析度、高效率和高回收率的特點。
Sepax 首創1μm顆粒製造技術。專利技術的表面修飾，不但消除固定相與提高了生物分子之間的非特異性互相作用同時有效的無孔填料的吸附容量，從而使色譜柱在應用中具有極高的柱效和回收率

2. 聚合物填料色譜柱適合分離什麼樣品

液相色譜柱的分類：(按色譜固定相基質分)

一.硅膠基質：

1.反相色譜柱：

反相色譜填料常是以硅膠為基礎，表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。

反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。

樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合最先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。

常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。

2.正相色譜：

正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)，以及其他具有極性官能團，如胺基團(NH2,APS)和氰基團(CN，CPS)的鍵合相填料。

由於硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他團的極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中的各組份的極性大小，即極性強弱的組份最先被沖洗出色譜柱。

正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)等。

3.離子交換色譜柱：以磺化交聯強陰/陽離子鍵合硅膠色譜柱，常用規格：強陰離子色譜柱(SAX)，強陽離子交換色譜柱(SCX)

二 .聚合物基質：

聚合物調料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優點是在PH值為1～14均可使用。相對與硅膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白質等樣品的分離非常有效。現在的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。

三.其他無機填料：

其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化。由於其特殊的性質，一般僅限於特殊的用途。如石墨化碳也用於正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強，石墨化碳可用於分離某些幾何導構體，又由於HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可用於HPLC，

氧化鋁微粒剛性強，可製成穩定的色譜柱柱床，其優點是可在PH高達12的流動相中使用。

但由於氧化鋁與鹼性化合物作用也很強，應用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應用，新型氧化鋯填料也可用於HPLC，商品化的僅有聚合物塗層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用PH范圍1～14，溫度可達100℃。由於氧化鋯填料幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優勢尚在進行中。

3. 液相色譜柱的填料有哪些

液相色譜柱的填料基質：1、硅膠基質- pH 2-8：高或低pH下，硅膠會溶解。2、Al2O3·nH2O - pH1-14：化學修飾困專難。3、聚合物基質 - pH1-14：孔屬結構復雜，孔徑不均勻導致柱效不夠高，有機溶劑可能導致聚合物基質溶漲而受損。

北京路達恆宇科技有限公司PLRP-S液相色譜柱剛性聚合物固定相機械強度高，適合酸性/中性/鹼性所有化合物，方便再生,恢復原有柱效和壓力，保留穩定,重復性好,壽命長。

4. scx是什麼色譜柱

SCX（強陽離子交換）是一類以單分散無孔聚合物微球為基質的高效離子交換色譜柱，它是為快速和高效的分離分析蛋白質和多肽而設計的。

5. 色譜硅膠的孔徑及用途

Kromasil柱

Kromasil是瑞典AKZO NOBEL公司生產的高性能硅膠基質液相色譜柱填料品牌。
Kromasil是一種高純度球形硅膠填料，金屬雜質含量極低，減少了有些金屬螯合物在硅膠基質上的絡合作用。
Kromasil硅膠的表面由獨特的硅羥基基團組成，硅烷的覆蓋率高，在較高的或較低的PH條件下不易水解和分解，可在PH=1.5～9.5條件下穩定使用。
Kromasil 的含碳量高，表面極性小，分離效能高。通常在分析鹼性樣品時，與酸性硅羥基反應會產生不利的拖尾現象，而Kromasil化學純度極高，它的表面由分布獨特、相對中生的硅羥基基團組成，並使不需要的酸性硅羥基基團減少到最低，從而使之具有良好的峰對稱性種較高的柱效。

Hypersil BDS

Hypersil BDS 類色譜填料是極好的反相柱填料，有很好的耐久性及重現性，應用范

圍極其廣泛。Hypersil BDS 硅膠擔體鍵合前經過專門的鹼鈍化處理，將殘余硅羥基降至極

限，這種改善的表面，使得鍵合後的硅膠具有很高的配位度，大大降低了硅羥基與分析物之

間的相互作用，改善了色譜峰形，降低了色譜峰的拖尾程度，提高了峰的對稱性。

Hypersil BDS填料的特徵：

l 對鹼性化合物有更好的峰型。

l 更長的壽命。

l 更好的穩定性。

l 同鹼性化合物一樣，酸性和中性化合物也有非常優異的峰值--真正的通用柱填料。

緊管常規填料色譜柱具有優異的選擇性和較長的色譜柱壽命。且對於簡單的兩元流動相(如

甲醇/水)，當樣品為酸性、中性和弱鹼性化合物時均可獲得較佳的峰不對稱度。但當分析葯

物等樣品中的強極性含氮的化合物時，樣品峰型就極查，拖尾嚴重，並導致定量分析精度下

降，時常會出現一些小峰埋沒於前一拖尾峰的尾巴中，造成該現象的原因是固定相上尚有殘

余的硅羥基。盡管很多廠家對硅膠表面作了第二次反應，即所謂的「封尾」，以減小殘余硅

羥基的作用，但往往都不能完全消除殘余的硅羥基的影響。Hypersil公司開發的將殘余的硅

羥基降至極限的Hypersil BDS(Base Deactived Silica,鹼純化硅膠)系列產品，並用現代衍生反應技術生產出特別適用於鹼性化合物的真正均一反相填料。

Hypersil 300A 填料是基於5um和10um,
孔徑為300A 的硅膠為基質的HPLC填料適合越來越多的生物大分子分離與分析的需要,現可提供C18 C8 C4 的填料

*Hypersil 300A C18 適合親水性強的分子量大於5000的小肽酶的水解片斷及各種天然和合成小肽的分析
*Hypersil 300A C4 適合疏水性的小肽及大分子的多肽分析
*Hypersil 300A C8 選擇性介於C18和C4之間適用於親水性及弱疏水性的小肽和蛋白質酶的水解片斷及各種天然和合成小肽的分析。

Hypersil ODS填料

Hypersil 填料是基於粒度為3um 、5um和10um, 孔徑為120A的硅膠為基質的HPLC填料其生產過程的質量控制標准非常嚴格全世界數千個實驗室使用Hypersil色譜柱已長達20多年很多應用實例可以從多種文獻及著名雜志上查到。大量的試驗測試已經證實Hypersil ODS2填料是替代Waters Spherisorb ODS2的最佳填料無論是在酸性還是鹼性樣品的分析上選擇性與峰型幾乎與其保持一致。

LiChrosorb填料常規色譜分析柱

產品介紹： LiChrosorb是德國MERCH公司出品的一種多孔無定型硅膠基質填料品牌，在過去的25年中非常成功地應用於液相色譜分離。
產品特點：LiChrosorb RP-8和RP-18適合於鹼性樣品的色譜分析。

技術參數：

LiChrosorb填料參數

Spherisorb 填料
Waters公司出品的Spherisorb填料有3um、5um和10um, 孔徑為80A 硅膠為基質的HPLC填料其高的分離性能已得到廣大色譜用戶的認可

Spherisorb填料有C18 C8 CN C6H5和NH2等固定相C18有經封尾處理的ODS-2和未經封尾處理的ODS-1 兩種ODS-2 的碳含量為11.5%ODS-1的碳含量為5.75%

Spherisorb SAX強陰離子交換柱和SpherisorbSCX強陽離子交換柱分別適合於對小分子的酸性和鹼性化合物的分析比
通常的正相和反相色譜柱有更佳的分離性能

BETASIL 填料
ThermoHypersil-Keystone公司非常有特點的新型通用填料裝填的色譜柱-BETASIL 為了達到原裝柱的水平公司採用全新結構柱管裝填以滿足您更高分析要求的需要

*高純硅膠徹底減去活處理提供完美的峰型
*高比表面積高覆蓋鍵合相
*真正的高效柱理論塔板數較高
*較強的保留,反相色譜應用中適宜強極性化合物的分離

6. 2. 蛋白質組學樣品前處理（3）

說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學院與康昱盛主辦的蛋白質組學網路大課堂整理而成，侵刪。該課程由復旦大學生物醫學研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。

我們通過上一篇筆記里介紹的各種方法把蛋白質提取出來以後，這事兒還沒完，因為我們需要對提取出來的蛋白進行一下質控，以確認是否成功提取出了足夠的蛋白，是否有污染等。

如上圖，質量控制分兩個部分：

含量測定 ：檢測是否有充足的蛋白被提取出。注意上圖里提到的不兼容問題，如果你樣品里加過SDS，就不要用Bradford法來測定蛋白濃度，而可以選用BCA方法；反之，如果你樣品里加入了還原劑，就不要用BCA方法來測定蛋白，可以選用Bradford法。

SDS-PAGE ：檢測蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我們上了50個樣，能看到的條帶卻很少，說明定量不準確。如果想從幾組樣品中尋找差異蛋白，特別需要做一次SDS-PAGE檢測同類樣品蛋白的提取效率。

以上圖為例，0號樣品中間的條帶不見了，可能是提取蛋白不充分引起的差異，也可能是樣品本身的差異。我們可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異，建議用label free的方法，每個樣品單獨做定量，而不要用iTRAQ或TMT標記定量，否則會因為中間這個高豐度蛋白的影響，而導致定量不準。

我們再看來幾種常見的問題，以及解決方法，如下圖：

情況1：提取出來的結果差異很大。這種情況需要重新提取，以檢測到底是提取不充分造成的差異，還是樣品本身的差異；

情況2：左邊是分子量marker,右邊是實際樣品，可以看到實際樣品的條帶很少，可能是提取不充分，需要重設提取參數，使用更劇烈的條件，更長的時間，重新提取；

情況3：橫紋、縱紋比較多，很可能是核酸或脂蛋白的影響，這種情況需要進行脫鹽處理，也就是利用脫鹽柱與肽段結合，而與其它物質不結合，從而達到去除污染的目的。

情況4：兩個條帶很類似，但一條明顯比另一條淡。可能造成這種情況的原因有哪些呢？第一種情況，由於這是同樣類型的樣品，比如都是小鼠肌肉組織，一個樣品的蛋白質抽提充分，而另外一個樣品蛋白抽提不充分，就會導致兩條帶不一樣，這種情況下需要重新抽提。還有一種可能，考慮到是等量上樣跑的SDS-PAGE，如果兩個條帶顯示出的蛋白含量差別很大，則可能因為參考的含量測定結果不準確引起的，這時候需要重新定量。

蛋白提取後，還需要做脫鹽處理，我們來看看可以用哪些方法實現。

超濾： 可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積較小的樣品。操作步驟可以是，從100μL超濾濃縮到40μL，再加緩沖液至100μL，再超濾到40μL，反復幾次。事實上，超濾是很難把污染（比如SDS）完全去掉的，最終仍然會有極少量的污染物存在，但當這些污染物的濃度降到一定程度時，則樣品的純凈度我們認為是可以接受的了。

透析 ：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用於體積比較大的樣品，比如尿液，可以將鹽透析至外面的透析液里。

丙醇沉澱 ：-20℃丙酮（V _樣品 ：V _冷丙酮 =1：3以上）沉澱2個小時以上。

C18色譜柱脫鹽法 ：Waters公司生產的XBridge C18色譜柱，利用柱子上的填料與蛋白結合，而鹽類物質則流穿過去，從而達到分離的目的。

脫鹽完成以後，接下來我們就要進行相當重要的一步：還原烷基化及酶解。整個流程，大夥兒看下面這張圖：

這裡面有兩件事要先跟大夥兒聊聊。

首先，我們來說說為什麼步驟里要把丙酮沉澱放在烷基化以後。通過之前的學習，我們知道丙酮可以溶解樣品的去污劑、還原劑等，而蛋白是不會在丙酮中溶解的，而是會沉澱下來，這樣就達到了去除雜質的目的。

烷基化以後，球狀蛋白變成鏈狀，再通過丙酮沉澱去掉尿素或SDS等污染物，然後復溶（即重新溶解，以備下一步酶解操作），那麼鏈狀的蛋白比球狀蛋白的復溶效果會更好，可以避免因為復溶不充分而造成的損失。因此，丙酮沉澱要放在烷基化之後再做。

另外，關於酶切這一步，有些抗體如果只用胰酶進行酶切，由於酶切位點太少，導致切出來的肽段太長，不便於質譜檢測。這種情況下可以結合其它酶，比如Lys-C，進行多酶酶切，使肽段變得短一些。經過測試我們發現，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鑒定率。

酶解需要在buffer體系下完成，比如25mM碳酸氫銨體系（易揮發，pH 7-8）最為常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺鹽，10-100mM）。

酶的用量可以參考以下的公式：

W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50

此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性問題。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能與SDS同時使用。

前面提過，質譜儀是一種離子飽和性儀器，高豐度蛋白的存在會對低豐度蛋白的信號產生抑制，並且質譜儀反應也需要一定的時間。例如，人的細胞內通常會表達20300種蛋白，它們酶解後，每種蛋白會產生10-20種肽段，那麼就有幾十萬種肽段，質譜很難同時檢測到這么多種肽段。所以對肽段混合物進行分級，可以降低檢測的難度，得到更多的肽段/蛋白鑒定結果。

我們既可以從蛋白水平進行分離，也可以從肽段水平進行分離，還可以將多種分離手段結合起來。從蛋白水平的分離，大家都比較熟悉吧？通常我們用SDS-PAGE或IEF等技術，利用蛋白質的分子量、形狀、等電點等理化性質的不同，將混合在一起的蛋白質分開。

第二種分離方案是在肽段水平上進行，根據肽段的不同性質，使用不同填料進行分離。

SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅膠為基質的強陽離子交換柱，可以與陽離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陽離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陽離子的肽段分離的目的。

SAX（Strong Anion Exchange）：硅膠鍵合季銨基團的強陰離子交換柱，可以與陰離子結合，並通過buffer進行離子交換，將陰離子分離和洗脫出來，達到與其它不帶陰離子的肽段分離的目的。

RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色譜柱，與正相柱在表面鍵合極性官能團不同，反相柱的表面鍵合的是非極性的官能團，例如，鍵合十八烷基官能團，稱為C18柱，其它常用的還有C8，C4和C2等。這里我們選用C18柱，根據肽段疏水性的不同，達到分離的目的。

HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：親水色譜柱可以用來分離極性化合物。由於強極性肽段在反相色譜柱中保留情況都比較差，很難將它們分開，而親水色譜柱卻可以用來固定強極性的肽段，並結合高比例有機相與低比例水相組成的流動相，來實現分離的目的，且這樣的流動相組成尤其有利於提高電噴霧離子化質譜（ESI-MS）的靈敏度。

High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相條件，結合pH2的RPLC酸性條件，進行分離。

多維分離：例如，先從蛋白水平進行分離，再從肽段水平進行分離，或者多種肽段水平的分級分離結合起來使用。接下來我們重點聊一下各種多維分離的策略和效果。

我們先來看看上面這張圖。左上角的「A圖「展示的是通過High pH - Low pH RPLC將樣品分成了40個餾分，然後進行叉開的合並，合並為20個餾分，這樣的合並可以讓樣品中的肽段分布更加均勻。

右上角的」B圖」展示的是通過SDS-PAGE進行分離，也分成20個餾分，然後用兩種合並方案，分別合並為5個餾分和6個餾分，這樣做的目的也是為了讓樣品的肽段分布更加均勻。

左下角的「C圖」針對同一種樣品，對High/Low pH RPLC和SDS-PAGE兩種分離策略進行了比較，發現經過兩種分離方法後，有5408個蛋白是都可以鑒定到的，另外有1951種蛋白是只在High/Low pH RPLC分離策略中鑒定到的，而用SDS-PAGE分離，則可以鑒定到其它389種蛋白。從這個圖上看，兩種方法有互補性。

右下角的四幅小圖說明，當我們在做分級分離時，分的級別越多，能鑒定到的蛋白也就越多。不過這種增長並不是呈線性關系的，分級的級數達到一定程度時，能鑒定到的蛋白數量的增長就會飽和。所以比較省時省力又能保證效果的做法時，選擇一個合適的分級數即可。

我們來看一下目前發表的文獻里，利用多級分離所能鑒定到的蛋白數量。

就像前面說到的，對蛋白及多肽分離的級數越多，能鑒定到的蛋白也就越多，但常常因為機時的限制，再加上這種變化趨勢到一定程度總會飽和，所以我們通常有個權衡。比如常規的分10個餾分，基本上可以鑒定到5000-8000個蛋白。如果是血清樣品，可以餾分更多一些，尤其是RPLC一維，如果分到40或60個餾分，再合並為10或20個餾分，比直接分成10個或20個餾分能鑒定到的蛋白要多30%左右！

樣品前處理的各個步驟就介紹到這，下篇將繼續分享樣品前處理的最新方法與進展

7. 急！！！色譜柱常用填充料及原理

常見色譜柱中的填料分類

1、液相

a、反相（與離子對）方法
C18（十八烷基或ODS）----------- 普適性好；保留性強，用途廣
C8（辛基） -----------與C18相似，但保留值稍小
C3，C4 -----------保留值小；大多用於肽類與蛋白質
C1【三甲基硅烷（TMS）】------保留值最小；最不穩定
苯基，苯乙基 -----------保留值適中；選擇性有所不同
CN（氰基） -----------保留值適中；正相和反相均可使用
NH2（氨基） -----------保留性弱；用於烴類；欠穩定
聚苯乙烯基b -----------在1＜PH＜13的流動相中穩定；對某些分 離峰形好，柱子壽命長

b、正相方法
CN（氰基） -----------普適性好；極性適中；用途廣
OH（二醇基） -----------極性大於CN
NH2（氨基） -----------極性大，欠穩定
硅膠b ------------普適性好；價廉；操作欠方便；用於制備LC

c、空間排阻方法
硅膠b -----------普適性極好；作吸附劑用
硅烷化硅膠 -----------吸附性弱，溶劑兼容性好；適用於有機溶劑
OH（二醇基） ------------欠穩定；在水SEC中使用（凝膠過濾）
聚苯乙烯基b ------------廣泛用於有機SEC（凝膠滲透）；一般與水和極性大的有機溶劑不相容

d、離子交換方法
鍵合相 ------------穩定性與重現性均不好
聚苯乙烯基b -------------柱效不高；穩定；重現性好

a ：除另有說明，均為硅膠基質鍵合相
b ：此類填料為非鍵合相

2、GPC

3、氣相

4、spe中的填料

轉自：分析測試網路網

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8. thermo離子交換sax使用方法

Thermo 離子交換色譜柱使用
首先，感謝您選擇性能優越的Thermo色譜柱產品。
為了使您的色譜柱能發揮最大的性能，敬請先閱讀以下說明：
1、適用類型
Thermo離子交換色譜柱包括：BioBasic AX，SCX，Hypersil SAX，Hypersil Gold AX，SAX等。
2、柱體積
色譜柱的柱體積可以通過以下公式估算：
V=0.68 πr2L
V為色譜柱柱體積（mL），r為色譜柱內徑（cm），L為色譜柱長度（cm）。
3、色譜柱柱效測試與保存
離子交換色譜柱出廠時都經過柱效測試，請參考柱效報告。
在條件允許情況下，請對新色譜柱進行柱效測試。
離子交換色譜柱出廠時均保存在乙醇溶液中（如有不同，以柱效報告為准）。
4、溫度
所有硅膠基質色譜柱使用溫度應低於60℃。
5、樣品
最好將樣品溶解在流動相或極性相近的溶劑中。如果使用梯度洗脫，則需要將樣品溶解在初始流動相或極性相近的溶劑中。
樣品溶液不應含有任何顆粒物，最好使用0.5μm或更小粒徑的濾膜過濾。同時建議在色譜系統中使用在線過濾器。
6、流動相
所用溶劑通常為水、乙腈、甲醇等，Thermo的離子交換色譜柱可以100%水為流動相，進行鹽的梯度洗脫。
流動相中含有機相時，請注意降低鹽的濃度，以防止溶劑混合後鹽從流動相中析出。更換流動相時也要注意這一問題，可先用含較高純水的流動相除鹽過渡。
請將流動相的pH值控制在2-8。緩沖鹽濃度在500 mM以下。
所有流動相，最好當日實驗當日配製，並使用2μm濾膜過濾。
7、色譜柱安裝
請小心操作色譜柱。
不要摔、碰色譜柱，這樣會損壞色譜柱床，使色譜柱性能下降。
使用合適的連接管路和接頭，確保色譜柱連接處死體積降到最低（使用不銹鋼接頭時需要尤其注意）。我們建議使用SLIPFREE 接頭，此接頭與Thermo色譜柱以及其他品牌色譜柱均完美匹配。
8、色譜柱平衡
新柱在使用前，請預先用20倍柱體積甲醇/或乙腈沖洗色譜柱，然後以初始流動相（不含鹽）沖洗10倍柱體積。
在進行正式分析之前，請使用至少20倍柱體積的流動相沖洗色譜柱，以使色譜柱達到平衡。
9、色譜柱保護
對於成分復雜的「臟」樣品以及組分未知的樣品，請盡量使用在線濾器或保護柱，如果可能，使用SPE小柱對樣品進行前處理是更好的選擇。上述做法可以有效延長色譜柱使用壽命。
10、色譜柱清洗
常規清洗：
每天完成分析之後，用100% 水沖洗30倍柱體積除鹽，然後用20% 甲醇/或乙腈沖洗20個柱體積，保存在20% 甲醇/或乙腈中。
清洗強保留污染物：
如果發現離子交換色譜柱柱效出現大幅下降，可通過如下方法清洗離子交換色譜柱：首先用高濃度的緩沖鹽溶液清洗（濃度是流動相的5-10倍，但不得超過1M），沖洗30倍柱體積。用100% 水沖洗20倍柱體積以除鹽後，再用100%甲醇/或乙腈清洗30倍柱體積。最後用20%甲醇/或乙腈水溶液（不含鹽）保存。
11、色譜柱保存
用100% 水沖洗30倍柱體積除鹽後，若短期不使用（<1周），用20% 甲醇/或乙腈沖洗20倍柱體積後，保存在20% 甲醇/或乙腈中；若需長期放置（>1周），用50% 甲醇/或乙腈沖洗20倍柱體積後，保存在50% 甲醇/或乙腈中。
注意：如果違反上述規程，可能使色譜柱失去保修。

9. 色譜柱的填料

常見的分配柱填料：碳十八柱 （ODS/C18)、碳八柱（MOS/C8）、碳六柱（Hexyl/C6）、
碳四柱（Butyl/C4）、碳一柱（Methyl/C1）、陰離子交換柱（SAX)、
陽離子交換柱（SCX）、苯基柱（Phenyl）、氨基柱（Amino/NH2）、
氰基柱（Cyano/CN/Nitrile）
常見的吸附柱填料：硅膠柱

10. 磺酸基陽離子交換柱的磺酸基陽離子交換柱產品

Venusil SCX HPLC Columns強陽離子交換柱
粒徑5um 孔徑300A 比表面積50m2/g
強陽離子交換柱：以超純硅膠為基質，表面鍵合有芳內香族磺酸基團。容300A，5um；比表面積50m2/g。可用於分離鹼性、水溶性化合物和生物分子。中國葯典2005版中，鹽酸二甲雙胍的有關物質測定方法即使用磺酸基陽離子交換（SCX）色譜柱。
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*100mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*150mm/5um
Venusil SCX HPLC Columns 4.6*250mm/5um
三聚氰胺VSc 958505-m Venusil scx4.6*250mm/5um
（建議配保護柱卡套使用壽命更長）