液相離子交換柱拖尾

A. 氨基酸的離子交換柱色譜分離中為什麼會拖尾

色譜產生拖尾的原因太多了，建議你去「色譜世界」網站看看，這個網站在色譜方面非常專業，高手較多，應該能幫到你的。

B. 簡述hplc級流動相使用前如何處理

一、基質（擔體）

HPLC填料可以是陶瓷性質的無機物基質，也可以是有機聚合物基質。無機物基質主要是硅膠和氧化鋁。無機物基質剛性大，在溶劑中不容易膨脹。有機聚合物基質主要有交聯苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有機聚合物基質剛性小、易壓縮，溶劑或溶質容易滲入有機基質中，導致填料顆粒膨脹，結果減少傳質，最終使柱效降低。

1．基質的種類

1）硅膠

硅膠是HPLC填料中最普遍的基質。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術鍵合上各種配基，製成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質填料適用於廣泛的極性和非極性溶劑。缺點是在鹼性水溶性流動相中不穩定。通常，硅膠基質的填料推薦的常規分析pH范圍為2~8。

硅膠的主要性能參數有：

①平均粒度及其分布。
②平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。
③比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質的k值越大。
④含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質的k值越大。
⑤含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越強，對溶質的吸附作用越大。
⑥端基封尾。在反相色譜法中，主要影響鹼性化合物的峰形。
⑦幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格較便宜，缺點是渦流擴散項及柱滲透性差；後者無此缺點。
⑧硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，鹼性成份不拖尾。

2）氧化鋁

具有與硅膠相同的良好物理性質，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩定。不過現在已經出現了在水相中穩定的氧化鋁鍵合相，並顯示出優秀的pH穩定性。

3）聚合物

以高交聯度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質的填料是用於普通壓力下的HPLC，它們的壓力限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質疏水性強。使用任何流動相，在整個pH范圍內穩定，可以用NaOH或強鹼來清洗色譜柱。甲基丙烯酸酯基質本質上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更強，但它可以通過適當的功能基修飾變成親水性的。這種基質不如苯乙烯-二乙烯苯那樣耐酸鹼，但也可以承受在pH13下反復沖洗。

所有聚合物基質在流動相發生變化時都會出現膨脹或收縮。用於HPLC的高交聯度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質中，因為小分子在聚合物基質中的傳質比在陶瓷性基質中慢，所以造成小分子在這種基質中柱效低。對於大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此，聚合物基質廣泛用於分離大分子物質。

2．基質的選擇

硅膠基質的填料被用於大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用於大分子量的被分析物質，主要用來製成分子排阻和離子交換柱。

二、化學鍵合固定相

將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定相的突出特點是耐溶劑沖洗，並且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。

1．鍵合相的性質

目前，化學鍵合相廣泛採用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成Si-O-Si-C鍵形的單分子膜而製得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2，由於空間位阻效應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有40~50%的硅醇基未反應。

殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對極性溶質（特別是鹼性化合物）產生次級化學吸附，從而使保留機制復雜化（使溶質在兩相間的平衡速度減慢，降低了鍵合相填料的穩定性。結果使鹼性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應後，要用三甲基氯硅烷(TMCS)等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping），以提高鍵合相的穩定性。另一方面，也有些ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的"濕潤"性能。

由於不同生產廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例。

pH值對以硅膠為基質的鍵合相的穩定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在pH=2~8的介質中使用。

2．鍵合相的種類

化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。

常用的極性鍵合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基於極性鍵合基團與溶質分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。

常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等，以C18應用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈烷基可使溶質的保留值增大，並常常可改善分離的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質相似。

另外C18柱穩定性較高，這是由於長的烷基鏈保護了硅膠基質的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。

3．固定相的選擇

分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構體或含雙鍵數不等的環狀化合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產生選擇性相互作用，故被廣泛用於糖類的分析，但它不能用於分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發生反應生成Schiff 鹼。二醇基鍵合相適用於分離有機酸、甾體和蛋白質。

分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術，例如反相離子抑制技術和反相離子對色譜法等，非極性鍵合相也可用於分離離子型或可離子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是應用最為廣泛的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用於極性化合物的分離，而苯基鍵合相適用於分離芳香化合物。
另外，美國葯典對色譜法規定較嚴，它規定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜圖易於重現；而中國葯典僅規定填料種類，未規定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難於重現實驗，在某些情況下還浪費時間和試劑。
三、流動相

1．流動相的性質要求

一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特徵。

選好填料（固定相）後，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面：

①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。鹼性流動相不能用於硅膠柱系統。酸性流動相不能用於氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易於回收。應選用揮發性溶劑。

2．流動相的選擇

在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。
正相色譜的流動相通常採用烷烴加適量極性調整劑。

反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所佔比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜最常用的流動相。但Snyder則推薦採用乙腈-水系統做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，並可滿足在紫外185~205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統要優於甲醇-水系統。

在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值並分離良好，也需採用梯度洗脫技術。

反相色譜中，如果要在相同的時間內分離同一組樣品，甲醇/水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈/水或四氫呋喃/水的沖洗強度配比有如下關系：

C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氫呋喃＝0.66C甲醇

C為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當於89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃/水的沖洗強度。

3．流動相的pH值

採用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱鹼（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，並改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱鹼，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱鹼樣品時，通常在流動相中加入少量弱鹼，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

註：流動相中加入有機胺可以減弱鹼性溶質與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

4．流動相的脫氣

HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（雜訊增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。

溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），並導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。

除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若採用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鍾的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。

離線（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣後，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。

在線（系統內）脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。

一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難於普及。

5．流動相的濾過

所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明"已濾過"）。

用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用於過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用於過濾水溶液，嚴禁用於有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用於HPLC。對於混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合後濾過，首選有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。

6．流動相的貯存

流動相一般貯存於玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用於HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配製使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，並在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉澱和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。

7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題

鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC系統中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合後，可能會反應生成一些對不銹鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不採用，或新鮮配製。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配製使用。如果是和乾燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。

8．HPLC用水

HPLC應用中要求超純水，如檢測器基線的校正和反相柱的洗脫。

進行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養時，沒有有機物污染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應慢，對很低水平的有機物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量。總有機碳(TOC)分析儀（把有機物氧化成CO2，測游離的CO2）常用於I類（NCCLS）水中低濃度有機物的測定。

I類水標准：
NCCLS ASTM
電阻率，MΩ•cm，25℃，最小 10.0 18.0
硅酸鹽，mg/L，最大 0.05 0.003
微粒，µm濾器 0.22 0.2
微生物，CFU/ml 10 分三檔
美國葯典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用標准蔗糖溶液1.19 mg/L），電導率在室溫pH 6時≤2.4 µS/cm（即≥0.42 MΩ•cm）。HPLC級水增加吸收特性：在1cm池中，用超純水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分別不得過0.01、0.01和0.05。增加不揮發物，≤3ppm（中國葯典純水≤10ppm）。

C. 如何有效選擇高效液相色譜柱

使用高效液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由於被測物種不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，最後通過分析比對這些信號來判斷待側物所含有的物質。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應用於化學和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是採用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鍾內完成。

D. 提高液相色譜中柱效的有效途徑有哪些

1、可以進行一下操作
（1）、將色譜柱頭尾調換，反沖色譜柱。
（2）、將柱子清洗：甲醇--乙腈--異丙醇--氯仿--環己烷--氯仿--異丙醇--乙腈--甲醇，每種溶劑沖洗30min~40min。
（3）、酸鹼沖洗柱子：（假設之前是中性流動相）含0.5%甲酸的甲醇水9010沖洗40min--甲醇水9010沖洗40min--含0.5%氨水的甲醇水9010沖洗40min，（或先鹼後酸）。
2、平時使用過程中多注意其使用事項也是有助於儀器性能的使用的

色譜柱的保存
（1）反相色譜柱每天實驗後的保養： 使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成後應用10%的甲醇/水沖洗30分鍾，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鍾。注意：不能用純水沖洗柱子，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。
（2）長期保存色譜柱： 如色譜柱要長時間保存，必須存於合適的溶劑下。對於反相柱可以儲存於純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存於嚴格脫水後的純正己烷中，離子交換柱可以儲存於水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，並將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度最好是室溫。
色譜柱的再生
因為色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數的增加，會出現拖尾峰(tailing peak)。前者少見。>色譜峰高降低，基線的兩個交點間的距離。W＝4σ>峰寬加大或出現肩峰的現象，一般來說可能是柱效下降。
（1）反相柱的再生：依次採用20-30倍的色譜柱體積的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成後再以相反順序沖洗色譜柱。
（2）正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然後再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴格脫水。
3、色譜柱在使用過程中易出現的問題和解決辦法 色譜柱在使用中最常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬於正常現象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統管路堵塞及壓力感測器故障除外），以下列舉了部分常見原因及解決辦法：
（1）色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染； 解決方法：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內超聲清洗10分鍾，後再用純水超聲。

E. 高效液相是什麼原理

高效液相的原理：

液相色譜是一類分離與分析技術，其特點是以液體作為流動相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。

在色譜技術發展的過程中．為了區分各種方法，根據固定相的形式產生了各自的命名，如紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。

液相色譜是一類分離與分析技術，其特點是以液體作為流動相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。

在色譜技術發展的過程中．為了區分各種方法，根據固定相的形式產生了各自的命名，如紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。

經典液相色譜的流動相是依靠重力緩慢地流過色譜柱，因此固定相的粒度不可能太小(100μm～150μm左右)。

分離後的樣品是被分級收集後再進行分析的，使得經典液相色譜不僅分離效率低、分析速度慢，而且操作也比較復雜。

直到20世紀60年代．發展出粒度小於10μm的高效固定相，並使用了高壓輸液泵和自動記錄的檢測器，克服了經典液相色譜的缺點，發展成高效液相色譜，也稱為高壓液相色譜。

(5)液相離子交換柱拖尾擴展閱讀：

高效液相統稱為高柱效、高壓力、高效率的液相色譜。

根據液相色譜原理，對物質進行分離。其原理可採用分配色譜，也可採用吸附色譜等等，其大體結構為：

泵（用來輸送流動相，即溶劑/洗脫液,A相一般為水溶性溶劑，B相一般為有機溶劑，如乙腈、甲醇等），調節閥（分為單向或雙向調節閥），色譜柱（用來分離物質，物質一般加在柱頭），檢測器（檢測物質分離情況，一般可分為紫外，蒸發光散射等等）。

根據泵的結構可分為一元泵、二元泵、四元泵等，根據泵的壓力可分為低壓單元、高壓單元等。

高效液相色譜法有「四高一廣」的特點：

①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鍾，有些樣品甚至在5分鍾內即可完成，一般小於1小時。

③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級。

⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

⑥柱子可反復使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。

高效液相色譜的缺點是有「柱外效應」。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

F. 液相色譜原理

原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於高效液相色譜計算公式： 高效液相色譜計算公式
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。 當吸附競爭反應達平衡時： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當交換達平衡時： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機相 式中：X 水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y---形成的離子對化合物。 當達平衡時： KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相 根據定義，分配系數為： DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關系] 離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）： 擔體圖示
抑制柱上發生的反應： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-，可用電導法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
分析方法：
綜述
色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用於分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升。除另有規定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。 正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進化學鍵合固定相反應
樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變, 以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於20分鍾內記錄完畢。 2.系統適用性試驗 按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整,應達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度和拖尾因子.
色譜柱的理論板數
在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖化學鍵合固定相應用
，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數，如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優劣等），使理論板數達到要求。
分離度
定量分析時，為便於准確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中後一峰的保留時間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規定外，分離度應大於1.5。
拖尾因子
為保證測量精度，特別當採用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規定外，T應在0.95～1.05間。 也可按各品種校正因子測定項下，配製相當於80％、100％和120％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計算平均校正因子，其相對標准偏差應不大於2.0％。

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G. 關於液相色譜流動相的基礎問題

一、液相色譜流動相的性質要求

一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特徵。
選好填料（固定相）後，強溶劑使溶質在填料表面的吸附減少，相應的容量因子k降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數。塔板數N一般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面：
①流動相應不改變填料的任何性質。低交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質。鹼性流動相不能用於硅膠柱系統。酸性流動相不能用於氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數與樣品差別較大的溶劑作流動相，以提高靈敏度。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。

二、液相色譜流動相的pH值

採用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱鹼（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，並改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱鹼，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱鹼樣品時，通常在流動相中加入少量弱鹼，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

註：流動相中加入有機胺可以減弱鹼性溶質與殘余硅醇基的相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

三、液相色譜流動相的選擇
在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而增加；BR>正相色譜的流動相通常採用烷烴加適量極性調整劑。

反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調整劑的性質及其所佔比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統已能滿足多數樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜最常用的流動相。但Snyder則推薦採用乙腈-水系統做初始實驗，因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，並可滿足在紫外205nm處檢測的要求，因此，綜合來看，乙腈-水系統要優於甲醇-水系統，但價格較貴。

在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k值並分離良好，也需採用梯度洗脫技術。

四、液相色譜流動相的濾過
所有溶劑使用前都必須經0.45μm（或0.22μm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明"已濾過"）。

用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用於過濾有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用於過濾水溶液，嚴禁用於有機溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用於HPLC。對於混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合後濾過，首選有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。

五、液相色譜流動相的脫氣
所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。

溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），並導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。

除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。超聲脫氣比較好，10-20分鍾的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了，此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液面不要高出水面太多。

六、液相色譜流動相的貯存
流動相一般貯存於玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用於HPLC系統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配製使用。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，並在短期內使用完畢。

H. 液相色譜法實驗前為什麼要沖洗色譜柱

轉載：《分析測試網路網》

1.色譜柱簡介
最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統使用非極性添充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用,正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用於離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填充劑用於分子排阻色譜；手性鍵合填充劑用於對映異構體的拆分分析。
填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含炭量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響待測物的保留行為和分離效果。孔徑在15nm（1nm=10埃）以下的填料適合於分析分子量小於2000的化合物，分子量大於2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用PH2~8的流動相。當PH大於8時，可使載體硅膠溶解；當PH小於2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用PH大於8的流動相時，應選用耐鹼的填充劑，如採用高純硅膠為載體並具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包裹聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當需使用PH小於2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機-無機雜化填充劑等。
2.色譜柱的沖洗體積確定
一般情況都是沖洗色譜柱10-20倍柱體積，具體可以這樣計算，根據柱內徑和柱長算出色譜柱內體積。短柱一般時間就是30分鍾、長柱一般沖洗60分鍾就可以了。舉例：內經為4.6mm、長250mm，其柱內體積=3.14*4.6*4.6/4*250=4.153毫升，流速是1.0毫升每分鍾，折中取15被柱內體積，則沖洗時間就出來了。
3.色譜柱沖洗
沖洗色譜柱最好在分析結束後，用流動相沖洗到基線平穩，然後用10%左右的有機溶劑沖洗色譜柱，主要是沖洗干凈流動相中的緩沖鹽。然後用100有機溶劑沖洗。最好是梯度變化沖洗。分析物可能為一些能溶解在水中，有些需要用純溶劑才能完全去除。如果分析時間緊迫一定要把鹽分沖洗干凈，一般情況不要用純水沖洗色譜柱，特別是反向柱的填料的鍵合集團容易折斷，對色譜柱造成損傷。色譜柱被使用在某種程度上就是開始被污染了，所以色譜柱的壽命和我們使用的情況有很大的關系。雖然被污染但是對我們分析目標物沒有造成影響我們也就是認為還能用。
4.色譜柱維護沖洗
常見故障篩板阻塞，解決辦法是：a、過濾流動相；b、過濾樣品；c、運用在線過濾或保護柱。
柱頭塌陷解決方法是：：a、避免使用PH>8的流動相（針對大部分硅膠的柱子）；b、使用保護柱 ；c、使用預柱（飽和色譜柱）。
前面談到的不管用什麼溶劑一定要加入一定比例的用機溶劑，主要是考慮到一些疏水基團在有機溶劑裡面容易伸展利於沖洗其包藏的雜質等。當我們的色譜柱在壓力和柱效下降時，我可以拆開泵近端柱頭的螺絲取出篩板，清洗篩板以及觀察裡面的填料，如填料污染嚴重，就要進行挖取一部分被污染的填料然後用其他廢棄的柱子相同填料來填補，用新的篩板或清洗好的篩板擰好螺絲。然後沖洗觀察柱壓變化和測試柱效等。

5.特殊沖洗 強保留物質和大分子化合物在色譜柱中累積，對樣品中的化合物產生額外的保留行為，不僅引起峰形變寬、拖尾，使柱效下降，同時也會引起保留時間的變化，累積到一定程度時還會導致柱壓升高。由於強保留物質和大分子化合物對色譜分離的影響是一個累積效應，需要一定的時間才會體現出來，但對許多樣品特別是復雜樣品而言，很難判斷其是否含有強保留物質，因此要防止強保留物質的累積，需要在每天的日常維護中用純甲醇或乙腈清洗色譜柱。
清洗方法：
1.未使用緩沖鹽：每天分析完成後，用純甲醇或純乙腈反向沖洗色譜柱60min。
2. 使用過緩沖鹽：分析完成後，先用上述方法除去緩沖鹽，然後再用純甲醇或乙腈反向沖洗色譜柱 60min。
3.補救方法：
水——乙腈——氯仿（或異丙醇）——乙腈——水
每一步以 1.0ml/min 流速反向沖洗色譜柱 60min。

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I. 液相的柱壓不穩定，總是上下波動且幅度很大，可以怎麼解決

當液相柱壓不穩定時可以進行以下操作：

1、檢查是否脫氣，壓力不穩定很可能是管路中有氣泡。

2、更換密封墊，泵密封墊損壞，會把空氣帶進泵內。

3、打開泵的排氣閥，按purge健排氣，或者以大流速（2ml/m）排氣，流動相真空脫氣或者超聲脫氣。

4、換下雙泵,沖洗閥的過濾芯，將流動相混合均勻後,超聲20min後,真接單泵分析就可。

5、檢查是否是柱子久用引起的柱壓不穩，用異丙醇：甲醇＝10:90沖，流速要調低。

(9)液相離子交換柱拖尾擴展閱讀

在選擇色譜柱之前，先多了解自己的樣品和雜質，他們的類型結構、極性、酸鹼性、分子量大小等等。

1.樣品是極性的且弱酸性的，就可以選擇C18在100%酸性水溶液條件下檢測，即要選擇承受100%純水且對極性化合物保留很好的色譜柱。

2. 如果樣品極性太強，或酸性太強，可以選擇CN，NH2，或硅膠柱，HILIC（親水色譜），也有使用C18+強陰離子對試劑或強陰離子交換色譜柱。

（缺點是離子對試劑平衡時間長，對流動相pH要求比較精密，否則很難重復實驗，另外離子對試劑很難洗下來，基本上用了離子對的色譜柱就不能再用於其它實驗）。

3. 若樣品是鹼性的，可選擇高純硅膠柱（高純硅膠缺少金屬雜質，且硅膠端基封尾）或一些經過修飾的C18柱（如極性嵌入技術或鹼去活技術等）。

他們都會減少鹼性化合物的拖尾，一般會選擇中性或偏鹼的條件下做，因為這樣可增加鹼性樣品的保留。

4.如果鹼性化合物的極性太強，或鹼性太強，可以選擇寬pH的C18色譜柱在高pH值檢測（優點是方法開發簡單，缺點是目前實 現這一技術的色譜柱品牌比較少，價格也高）。

或者選用HILIC色譜柱（硅膠柱在反相條件下使用，這也是很經典的檢測鹼性樣品的方法）選擇強離子交換柱也有使用C18+強陰離子對試劑或強陰離子交換色譜柱。

J. 液相色譜柱怎麼換

先用95%乙腈+5%水沖洗舊柱子（沖去柱子中殘留的緩沖鹽和之前難以洗脫的組分），關掉流速，待流速降至0後，把柱子兩邊的PEAK頭擰下來，用配套的塞子將換下的柱子兩頭堵上，密封保存更換新的色譜柱時，應先將需換上的柱子兩邊的塞子旋開。

確定好柱子標示的方向後，先接柱子入口端，並使柱子出口端略高於入口端，這樣就使流動相流過柱子時能將其中的氣泡排出，待氣泡排盡後，再接上柱子的出口端，用純的乙腈小流速沖洗半小時，再用流動相按0.2， 0.5， 1.0逐漸加大流速來沖洗。

(10)液相離子交換柱拖尾擴展閱讀：

操作注意事項：

為使柱外效應減至最小，使檢測結果更加准確，液相色譜儀各裝備的管路連接非常重要一般而言，液相色譜儀的第一次安裝都是由色譜儀廠家技術員安裝完成的，整個液相色譜儀及其配套裝備都是安裝的很完美的客戶後期在更換色譜柱要注意的問題是接頭的處理。

一般柱子入口和出口接頭為不銹鋼卡套接頭，當完成第一次安裝後，不銹鋼卡套已固定死，因此，早更換色譜柱時應當注意的問題是柱子接頭處的形狀和長度，否則會產生一個非常大的死體積