去離子型甲醯胺

❶ 提取RNA時如何去除DNA的污染

提取RNA時如何去除DNA的污染的方法：

1. 注意實驗室的標准化問題，注意污染的存在，同時嚴格按照說明書上的操作應該沒有

2. 問題。發現DNA污染，用DNAse I 消化1小時，37度

3. 離心取上清的時候，一定要小心不要取到中間的膜和下面的液體。

4. 直接加NaOH溶液與提取液混合攪拌,然後離心就可以了.因為RNA可溶於NaOH溶液,而DNA不可溶,離心後的上清液就不含有DNA了。

RNA提取步驟：

1. 勻漿處理：

①組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10%。

②單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決於細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

③細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2. 將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鍾，使核酸蛋白復合物完全分離。

3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃10000×g離心10分鍾，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振盪15秒，室溫放置3分鍾。

5. 2-8℃10000×g離心15分鍾。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。

6. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見後。用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鍾。

7. 2-8℃10000×g離心10分鍾，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。

8. 用75%乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鍾，棄上清。

9. 室溫放置乾燥或真空抽干RNA沉澱，大約晾5-10分鍾即可。不要真空離心乾燥，過於乾燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5%SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鍾使RNA溶解。如RNA用於酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲醯胺溶解，-70℃保存。

注意事項：

1. 從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉澱。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉澱RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。

2. 勻漿後加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉澱可以保存於75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3. 分層和RNA沉澱時也可使用台式離心機，2600×g離心30-60分鍾。

   預期產量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：

   肝和脾6-10μg，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤1-4μg，上皮細胞8-15μg，成纖維細胞5-7μg 。

❷ 電泳緩沖液加到什麼位置

電泳緩沖液加到一樣的位置。

電泳緩沖液的主要作用是使膠的導電性和體系的一致，這樣跑出的條帶才會一致；加樣緩沖液的主要作用是使PCR產物與其混合，使DNA沉於加樣孔的底部，防止DNA跑出來。

許多批號的試劑級甲醯胺，其純度符合使用要求，無須再進行處理。不過，一旦略呈黃色，則應用在磁力攪拌器上將甲醯胺與Dowex XG8混合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理，並用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲醯胺分裝成小份，充氮存於-70℃。

作用

緩沖液在電泳過程中的一個作用是維持合適的pH。電泳時陽極與陰極都會發生電解反應，陽極發生的是氧化反應（4OH--4e->2H2O+O2)，陰極發生的是還原反應（4H++4e->2H2)，長時間的電泳將使陽極變酸，陰極變鹼。

電泳緩沖液的另一個作用是使溶液具有一定的導電性，以利於DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢；太高時就會造成過大的電流使膠發熱甚至熔化。

❸ 甲醯胺使DNA變性的原理是什麼

變性原理：尿素及復甲醯胺：它制們可與鹼基間形成氫鍵
加熱：高溫（70℃以上）可破壞鹼基間的氫鍵。

離子強度：提高溶液的離子強度，可中和DNA分子鏈上磷酸基團的負電荷，降低它們之間的排斥力，穩定DNA的結構。

極端的pH值：pH＜1時，DNA的磷酸二酯鍵會被水解；pH＞11.3時，DNA的所有氫鍵斷裂。

疏水作用：甲醇可增加鹼基的溶解度，三氟醋酸鈉可降低DNA分子的疏水作用，破壞雙螺旋結構引起變性。

尿素及甲醯胺：它們可與鹼基間形成氫鍵。

鹼基堆積：氫鍵和鹼基堆積是一致的，鹼基堆積是一種協同作用，處於中間的鹼基比兩邊的鹼基穩定.

❹ 組織研碎後Trizol一般裂解多長時間

trizol說明書里好像不是很詳細，用起來效果也一般。還是往聖的typhon好用，說明書也很詳細。

RNA的提取
准備試劑
氯仿，異丙醇，75%乙醇，無RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配製)。
操作步驟
1．勻漿處理
a、組織:將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml Typhon；肝臟、腦等柔軟組織用勻漿儀進行勻漿處理。然後加入1mlTyphon，反復輕柔吹打，直至溶液不抽絲，樣品體積不應超過Typhon體積10%。
b、單層培養細胞:去除細胞培養基，PBS沖洗一次，直接在培養板中加入Typhon裂解細胞，每250px2面積加1ml，用移液器吸打幾次，轉移至1.5ml離心管，反復吹打，直至溶液不抽絲。Typhon的用量應根據培養板面積而定。Typhon加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c、細胞懸液:離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml Typhon，反復吸打直至溶液不抽絲。加Typhon之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鍾，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃ 12000×g離心10分鍾，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除，取澄清的勻漿液進行下一步操作。
4．第一步每使用1ml Typhon加入0.2ml氯仿，輕柔振盪或吹吸15秒，室溫放置3分鍾。
5．2-8℃ 12000×g離心15分鍾。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色或淡黃色水相，中間為固相。RNA主要在水相中，水相體積約為所用Typhon試劑的60%。
6．把水相轉移到新管中（如要分離DNA和蛋白質可保留有機相），用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml Typhon加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鍾。
7．2-8℃ 10000×g離心10分鍾，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。
8．用75%乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml Typhon至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鍾，棄上清。
9．室溫放置乾燥或真空抽干RNA沉澱，不要晾得過干，否則不易溶解，大約晾5-10分鍾。加入25-200μl無RNase的水或0.5%SDS（本公司均有售），用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鍾使RNA溶解。如RNA用於酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲醯胺溶解。-70℃保存。
RNA的提取注意事項
1．從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA是可加入少許糖原以促進RNA沉澱。例如加800μl Typhon勻漿樣品，離心取上清液後，異丙醇沉澱RNA前加5-10ug RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。
2．勻漿後加入Typhon，加氯仿之前樣品可在-60—-70℃保存至少一個月。RNA沉澱可保存在75%酒精中2-8℃一個星期以上或-5—-20℃一年以上。
3．分層和RNA沉澱時也可使用低速台式離心機，2600×g離心30-60分鍾。
RNA的提取常見問題分析
得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B．RNA沉澱未完全溶解
A260/A280<1.65：
A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶於水，而溶於了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。
B.樣品勻漿時加的試劑量太少。
C.勻漿樣品時未在室溫放置5分鍾。
D.吸取水相時混了有機相。
E.RNA沉澱未完全溶解。
RNA降解：
A.組織取出後沒有馬上處理或冷凍
B.待提取RNA的樣品沒有保存於-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.細胞在胰酶處理時過度
D.溶液或離心管未經RNase去除處理
E.電泳時使用的甲醛pH值低於了3.5
DNA污染:
A.樣品勻漿時加的試劑量太少
B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或鹼性溶液
蛋白聚糖和多糖污染:
沉澱RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中,每使用1mlTyphon在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl)混合離心,按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉澱出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應在勻漿後離心，加入以上操作步驟。
DNA的分離
准備試劑
乙醇、0.1M檸檬酸鈉(含10%乙醇)、75%乙醇、8mM NaOH
操作步驟
1．樣品加氯仿分層後,移去上層水相,用乙醇沉澱中間層和有機相中的DNA。每使用1mlTyphon加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鍾，2-8℃不超過2000×g離心5分鍾。
2．移去上清，（如需要分離蛋白質，可保留，進一步操作見後）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉澱。每用1mlTyphon加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鍾，2-8℃2000×g離心5分鍾，棄上清，重復一次。
3．用75%乙醇再洗一遍DNA沉澱，每使用1mlTyphon加入1.5-2ml75%乙醇,室溫放置10-20分鍾(不時顛倒混合)2-8℃2000×g離心5分鍾,棄上清。
4．室溫放置晾乾DNA5-15分鍾，用8mMNaOH溶解DNA。從50-70mg組織或10細胞中分離的DNA溶於300-600μl8mMNaOH，DNA的濃度通常為0.2-0.3μg/μl。提取的DNA沉澱不易溶於水和Tris緩沖液中，建議用弱鹼溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA後可用TE、HEPES調節pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物，可>12000×g離心10分鍾除去。
DNA的定量
取一份溶於8mMNaOH的DNA加水測A260值。一單位A260值相當於50μg/ml雙鏈DNA。理論上，人、大鼠、小鼠1×106二倍體細胞含DNA的量約分別為7.1μg,6.5μg,5.8μg。
分離DNA的應用
1．用於PCR 溶於8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES調pH至8.4,取0.1-1μgDNA用作PCR模板。
2．酶切反應 用HEPES或1mMEDTA調節pH至適當值。每μgDNA使用3-5單位的酶,酶用量為3-5 IV/mgDNA。
DNA分離注意事項
1．DNA在中間層和有機相中時可在2-8℃保存過夜。
2．DNA沉澱在75%乙醇中2-8℃可保存數月。
3．DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置過夜，如長期保存需用HEPES調節pH至7-8並且加EDTA至1mM可置於4℃或-20℃長期保存。
DNA的分離常見問題分析
得率低
A.樣品勻漿和裂解的不徹底
B.最終得到的DNA沉澱沒有完全溶解
A260/A280<1.70
A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶於水，而溶於了TE中
B.酚除去不徹底，可用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉澱。
DNA降解
A.組織取出後沒有馬上處理或冷凍
B.待提取RNA的樣品沒有保存於-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.樣品勻漿時使用了高速勻漿儀
RNA污染
A.氯仿分層後水相未完全去除
B.DNA沉澱用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）洗脫不徹底
蛋白質的分離
准備試劑
異丙醇、含0.3M鹽酸胍的95%乙醇、無水乙醇、1%SDS
操作步驟
1．取沉澱DNA後剩餘的上清，用異丙醇沉澱蛋白質。每使用1mlTyphon加1.5ml異丙醇，室溫放置10分鍾，2-8℃12000×g離心10分鍾棄上清。
2．用含0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質沉澱。每使用1mlTyphon加2ml洗滌液，室溫放置20分鍾，2-8℃7500×g離心5分鍾，棄上清，重復兩次。用2ml無水乙醇同樣方法再洗一次。
3．真空抽干蛋白質沉澱5-10分鍾，用1%SDS溶解蛋白質，反復吸打，50℃水浴使其完全溶解，不溶物2-8℃10000×g離心10分鍾除去。分離得到的蛋白質樣品可用於Westernblot或-5--20℃保存備用。
蛋白質的提取注意事項
1．蛋白質沉澱可保存在含0.3M鹽酸胍的95%乙醇或無水乙醇中2-8℃一個月以上或-5--20℃一年以上。
2．用0.1%SDS在2-8℃透析三次，10000×g離心10分鍾取上清即可用於Western blot。
蛋白質的提取常見問題分析
得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B.最後得到的蛋白質沉澱未完全溶解
蛋白質降解：
組織取出後沒有馬上處理或冷凍
電泳時條帶變形：
蛋白質沉澱洗滌不充分

❺ 甲醯胺的性質

沸點：210℃（180°C開始部分分解成一氧化碳和氨氣）
熔點：2-3℃
閃點：154°C
比重：1.1334(20°C)。
折射率：1.4468
溶解情況：能與水和乙醇混溶，微溶於苯、三氯甲烷和醚。
性狀與味道：無色透明油狀液體，略有氨味。
其他：本品具有吸濕性。

化學性質 有甲醯基和一個醯胺基各顯示其化學性質，還有一個醯胺鍵

❻ 請問有誰知道核酸引物和探針PAGE純化的步驟

第20章 細胞基因分離鑒定和原位雜交

第一節 細胞DNA、RNA的分離鑒定技術

一、培養細胞基因組DNA的提取及鑒定
人和哺乳動物細胞基因組DNA的分離通常是在有EDTA、Sarkosye等一類去污劑存在下，用蛋白酶K消化細胞，隨後用酚、氯仿抽提，經RNase處理和純化來提取DNA，可用於細胞凋亡中對所引起DNA斷裂、凝膠電泳呈現「梯形」條帶的實驗，在細胞凋亡章節中已介紹了有關DNA的提取和凝膠電泳鑒定，除此之外，提取純化的DNA還可用於分析其結構，序列限制性內切酶片斷長度多態性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法：
(1)取單層細胞，經無鈣、鎂PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，細胞懸液經PBS洗2次,棄上清，取細胞沉澱。
(2)加入2ml細胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混勻，加入蛋白酶K至終濃度為0.5～1g/L、Sarkosye終濃度為0.5%，混勻裂解蛋白呈糊狀。
(3)50℃水浴2小時，轉入37℃水浴過夜，次日加入等體積的飽和酚，輕輕顛倒混勻，以防止DNA斷裂，約3分鍾。
12000r/min離心15分鍾（室溫）
(4)取水相，再加入等體積酚/氯仿(1:1),同樣顛倒混勻，去除蛋白質
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(5)再重復步驟(4)，再用等體積酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等體積氯仿，去除酚及蛋白質，顛倒混勻
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(7)取水相，加入2倍體積的預冷無水乙醇，沉澱DNA，混勻-20℃放置1小時
12000 r/min離心15分鍾（室溫）
(8)用70%乙醇洗滌一次，按上法離心將沉澱真空乾燥10分鍾。
(9)加入RNase A至終濃度100mg/L，37℃水浴消化1小時，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K至終濃度0.4g/L、Sarkosye至終濃度0.5%，混勻，50℃水浴2小時，加入Nace至終濃度10mmol/L。
(11)用等體積飽和酚各抽提一次，步驟同前。
(12)吸上清，加入氯仿/異戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍體積預冷無水乙醇，-20℃ 1小時。
(14)取沉澱用70%乙醇洗一次，真空乾燥10分鍾後溶於少量TE中，4℃貯存。
(二)DNA純度檢測及含量計算
DNA濃度用紫外分光光度計測定，核酸的光吸收值位於波長260nm處，蛋白質則位於280nm，分別測定後，其OD260/OD280的比值應大於1.75.低於此值，說明DNA中仍殘留較多的蛋白質，此時可用酚、氯仿繼續抽提純化。若比值大於1.9表明DNA鏈破壞，斷裂嚴重，已成為小分子，因此操作應輕柔。
取少許DNA溶液，經紫外線掃描，吸收峰值位於波長260nm處，其純度應為OD260/OD280=1.8
OD260值為1的溶液大約含50μg/mL DNA，故DNA的濃度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀釋倍數。
DNA總量(μg)=DNA濃度(μg/mL)×總體積(mL)
DNA分子量大小測定，可用含溴化乙錠的1%瓊脂凝膠電泳法測定，根據加入標准品片斷的電泳遷移距離計算樣品片斷分子量大小，此技術還可用作分離基因組DNA，進一步進行Southern吸印分析。
二、培養細胞總RNA的提取及鑒定
細胞中含有三類RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA傳遞蛋白質全部遺傳信息是克隆表達功能性蛋白基因的最佳來源，是蛋白質合成的場所,有特殊意義,不同的細胞所表達某種蛋白的mRNA的種類和產量是不同的，為了提高細胞轉錄的mRNA的種類和產量，通常需加入誘導劑來對細胞進行刺激培養，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取細胞總RNA的方法，常用強烈變性劑如鹽酸胍溶液處理細胞，我們在細胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介紹了異硫氰酸胍一步法，但不純，本文介紹用鹽酸胍來裂解細胞可導致細胞結構破壞，核蛋白二級結構破壞，可利於提取總RNA，也可從總RNA中提取mRNA，從而分析mRNA表達量，建立cDNA文庫，以及對mRNA的調控和進行反義RNA研究。
變性液：7mol/L鹽酸胍，25m mol/L棕檬酸鈉pH7.0，0.5%Sarkosye，0.1mol/L β-巰基乙醇。
水平衡酚：在飽和酚中加入等體積DEPC處理的三蒸水(或新鮮無菌的三蒸水)混勻後去除水相，再重復處理二次即可。
所用玻璃、塑料製品、金屬器材可用0.1% DEPC水浸泡過夜後消毒無菌，其中玻璃、金屬器材也可用180℃干烤6小時，以去除被污染的RNA酶。
(一)總RNA的提取方法：
1、消化收集細胞方法同前。
2、向離心管中的細胞沉澱物中加1.5mL變性液，立即充分混勻。
3、加入1.5mL水平衡酚、0.15ml 2mol/L乙酸鈉PH4.0、以及0.05mL氯仿，劇烈振盪混勻30秒後，立即置冰上放置15分鍾，4℃ 12000r/min離心15分鍾。
4、取水相，加入等體積酚/氯仿(1:1)混勻，劇烈振盪10分鍾，4℃12000rpm離心15分鍾。
5、取水相，加入等體積氯仿，劇烈振盪10分鍾，再同上離心，再如此反復抽提一次後取水相，加入等體積的預冷的異丙醇(或異戊醇)混勻，低溫放置20分鍾，再同上離心。
6、取沉澱用70%預冷乙醇洗兩次，乾燥10分鍾，溶於DEPC處理的三蒸水中以溶解RNA，分裝,-20℃凍存。
(二)總RNA的鑒定及含量計算
1、RNA純度及含量測定
取少量提取的RNA，經紫外線掃描，吸收峰位於波長260nm處，RNA純度為OD260/OD280=1.8～2。
OD260值為1的RNA溶液約含有40μg/mL，故RNA濃度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀釋倍數。
2、RNA分子量大小鑒定
2.1 配液：
(1)10×MOPS電泳緩沖液配製
將41.2g[2-(N-瑪琳代)丙磺鹼，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶於800mL經DEPC處理的50mmol/L乙酸鈉液中，用2mol/L NaoH調整pH至7.0，加入20mL經DEPC處理的0.5mol/L EDTA(pH8.0)，再加經DEPC處理的水至總體積為1000mL過濾除菌，避光室溫保存。
(2)甲醛加樣緩沖液：1mmol/L EDTApPH8.0、0.25%溴酚蘭、0.25%二甲苯青FF、
50%甘油
2.2 操作步驟：
(1)制平板膠：1.2%瓊脂糖煮沸，冷卻至60℃，加入10×MOPS緩沖液及甲醛溶液，使三者的比例為3.5:1.1:1，或三者的終濃度分別為1.2%、1及10%，於室溫放置30分鍾或更長時間，使膠凝固。
(2)在無菌離心管中混合下列液體。
RNA(最多30μg) 4.5uL
10×MOPS電泳緩沖液 1.0uL
甲醛 3.5uL
65℃溫育15分鍾，水浴冷卻、離心
(3)加入2ul DEPC處理的加樣緩沖液上樣，進行電泳，5V/cm電壓，3小時直到溴酚蘭至膠的中部，可用已知RNA標本作分子量標准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)電泳完畢，取出凝膠，浸泡在溴化乙錠溶液中(終濃度0.5g/L)染色30～45分鍾，紫外透射儀觀察分子量大小。

第二節 核酸蛋白轉移電泳及雜交

一、DNA Southern Blot及雜交
本技術可用於基因組DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性內切酶長度多態性，對遺傳性疾病的早期基因診斷、產前診斷或基因變異等方面的研究有應用價值，其過程包括：樣品DNA內切酶水解、水解片斷的瓊脂糖凝膠電泳分離、分離後水解片斷的轉移(固定)、特異性DNA片斷的分子雜交及放射自顯影。
(一)樣品DNA內切酶水解
限制性內切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶其特點是具有高度特異性的DNA裂解點和不同電離子強度的特殊反應條件。不同產品其反應條件不同，應根據說明書操作。單位(U)RE活性是在37℃ 1小時內能將1μg DNA所有特異性位點切斷的酶用量。若用兩種以上不同的內切酶，要注意RE的最適鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化緩沖液
10×buffer O—無鹽：100mmol/L Tris HCL pH7.4
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)
10×bnffer L—低鹽：緩沖液O
0.5mol/L Nacl
10×bnffer H—高鹽：緩沖液O
1.0mol/L Nacl
2、操作步驟：
(1)將DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,並加入適量H2O總體積為18μL，混勻。
(2)加入2mL 10×限制酶緩沖液，根據廠家建議的鹽濃度選擇不同的緩沖液。
(3)加1～2U限制性內切酶充分混合。
(4)37℃溫育適當時間，時間需先進行預試驗，摸索所需消化的時間，通常用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶解充分，各片斷分子量從大到小分布均勻。
(5)加入0.5mol/L EDTA pH8.0使達到終濃度為10mmol/L終止反應。
(6)消化後的DNA直接進行瓊脂糖電泳，方法同前，可用於分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及雜交。
將經電泳走在瓊脂糖中的DNA變性、中和後，以毛細管作用在高鹽緩沖液中轉移至硝酸纖維膜上，再用放射性探針檢測與之雜交的DNA。
1、配液：
(1)變性溶液：1.5mol/L Nacl 0.5mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCL pH8.0加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解175.3g Nacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數滴10mol/L NaoH調pH至7.0加水至1000ml，高壓消毒滅菌。
(4)預雜交液：12.5mL 1mol K3 PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt'S溶液
5mL 5mg/mL魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
82.5mL H2O(總體積為500mL)
(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(組分V)
加H2O至500ml
2、操作步驟(如圖20-1)：

圖20-1 Southern Blot裝置圖
(1)內切酶消化的DNA，總體積為50uL，加入10uL加樣緩沖液進行12-24瓊脂糖電泳。
(2)用溴化乙錠染色，紫外燈下觀察並照像，在膠的旁邊放一尺子。
(3)將電泳膠取出，用以下各溶液浸泡處理，同時輕輕搖動：
500mL 0.2mol/L HCL 10分鍾，水洗若干次
500mL變性液中浸泡15分鍾×2
500mL中和溶液浸泡30分鍾。
(4)剪一張硝酸纖維素膜，每邊小於膠3mm。
(5)剪3～5層濾紙，大小每邊比硝酸纖維膜小7mm，再剪一張濾紙，比膠的寬度長30～40cm，在一盤中加入數百毫升20×SSC，盤上搭一塊玻璃，濾紙可從玻璃雙側浸到盤中的溶液。
(6)逐層放置濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜，其上再鋪濾紙及吸水紙，並加以重物，膠和硝酸纖維膜之間不可有氣泡，轉移24～36小時
(7)取出該膜，用圓珠筆標記方向，放入2×SSC中5分鍾，用濾紙吸干,80℃烘烤2小時。
(8)將該轉移膜放在塑料袋中，加入6～10mL預雜交液，排出氣泡，封口，42℃ 3小時或過夜。
(9)將標記的DNA探針煮沸5分鍾，立即冷卻，加入雜交液中，濃度為5×105 CPM/ML。
(10)倒去預雜交液，加入含探針的雜交液封口，42℃ 6h或過夜。
(11)取出轉移膜，按以下條件洗膜
1×SSC，0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分鍾，氣中乾燥。
(12)將雜交後的膜曝光於X光片，暗盒中放射自顯影2～7天，-70℃。
(13)X片顯影、定影，然後讀片
結果分析：此雜交技術可以對基因結構進行分析。雜交陰性帶的大小，分布規律及根據帶條信號強度測量其含量。
二、RNA Northern Blot及雜交
此法是將RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中可相互分離，隨後將RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上，用放射性標記的探針進行DNA-RNA雜交，此法是研究RNA(特別是mRNA)的主要方法之一，可測量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 預雜交液：12.5m 1mol/L K3PO4 pH7.4
125mL 20×SSC
25mL 100×Danhardt's液
5mL 5mg/mL 魚精DNA
250mL 100%去離子甲醯胺
加H2O 至500mL-20℃貯存
Northern 雜交液：500mL預雜交液加入標記探針及10%磷酸葡聚糖。
2、操作步驟：
(1)RNA變性電泳方法同前
(2)待溴酚蘭走至膠的中部時，用水清洗膠數次，放置於500mL 10×SSC中浸泡45分鍾，輕輕搖動。
(3)測量膠的大小，按下列順序，從下向上為①橫跨玻璃雙側的濾紙，雙邊可浸至20×SSC溶液；②膠；③硝酸纖維素濾膜；④親和層吸紙；⑤吸水紙；⑥重物、轉移4～6小時。
(4)取出濾膜80℃烘烤2小時。
(5)用6～10mL Northern預雜交液，42℃預雜交過夜。
(6)將已標記的探針煮沸，立即冷卻，加入6～10mL Northern雜交液。
(7)去除預雜交液，加入含探針的雜交液，42℃，雜交過夜。
(8)按下列條件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
0.25×SSC 0.1%SDS室溫2×15分鍾
(9)曝光於X光片暗盒中放射自顯影1天。顯影，定影，根據自顯影條帶的位置判定特定片斷的位置和順序，也可測含量。
三、蛋白Western Blot及分析
此項技術是一種蛋白質的固定和分析技術，是將已用聚丙烯醯胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Sonthern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合後，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。
1、配液：
(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸於4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S
1%乙酸
2、操作步驟（如圖20-2）：

圖20-2 Western Blot裝置圖

(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。
(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。
(3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。
(4)將以上「三明治」樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。
(5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉移4小時或過夜。
(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鍾，蛋白染色水中脫色2分鍾，照像，用印度墨水將分子量標准染色，在水中完全脫色。
(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶於100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。
(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入後室溫放置1小時，將濾膜轉到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。
(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。
(10)將濾膜放在100mL新配製的DAB底物溶液中，大約2～3分鍾就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。
結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。

第三節 細胞的原位雜交技術

原位雜交(ISH)是一種可在細胞塗片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA的技術，此方法原理是由DNA或RNA的序列與互補的標記單鏈DNA/RNA探針結合形成標記的雙鏈雜交分子，本技術可對組織細胞原位的待測核酸分子進行定性，定量及定位分析。在細胞分化調節、基因定位、腫瘤遺傳學、分子病理學、病毒學等領域得到廣泛應用。經典的原位雜交技術包括載玻片處理，組織細胞的固定，探針的制備或選購，原位雜交，洗滌以及檢測，其中探針制備技術不屬於本章專業技術，故不作具體評敘，略交待制備使用原則。本章節主要介紹培養細胞的原位雜交技術。
一、探針的制備原則和選擇
探針為RNA或雙鏈、單鏈DNA，雙鏈探針較單鏈探針有很多缺點，探針必須變性、復性，降低了探針雜交效率，雙鏈探針在溶液中形成長的鏈狀結構傾向，限制了它的組織穿透能力。適用於基因組DNA雜交。由於原位雜交的探針將與高密度的細胞融合，因此，需要減短探針的長度或增加探針的濃度，但是過高濃度的探針往往會增加非特異性結合，因此每種探針應選擇適當的濃度。
探針的獲得常採用隨機引物延伸法的PCR合成和擴增，可獲大量的DNA探針，或利用帶有噬菌體強啟動子多克隆位點的質粒載體來合成RMA探針，也可利用質粒菌擴增質粒，經酶切後純化的基因片斷，均可以獲得制備探針原料。這些探針可以用同位素標記，也可以用非同位素標記，即光敏生物標記或地高辛配基標記於脫氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通過隨機引物或缺口平移法與探針的核酸分子相連，構成地高辛一配基標記的核酸探針。比探針可用抗地高辛抗體偶聯酶或熒光素通過松體結合和底物顯色或產生熒光來檢測。
這些探針基本均有市售，無需自行制備，只要根據說明書使用即可。
二、載玻片和蓋玻片預處理
為了防止探針的非特異貼附而保證細胞粘附而需處理：
1、用於檢測RNA的載玻片的處理
(1)用0.1mol/L HCL洗載玻片20分鍾，再用無水乙醇洗數次使其乾燥。
(2)在下列溶液中，65℃處理2小時
3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分鍾，180℃烘烤2小時。
2、用於檢測DNA的載玻片的處理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)塗載玻片。
3、對於蓋玻片：於0.1mol/L HCL中浸泡20分鍾，用無水乙醇洗，乾燥後用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小時。
三、組織細胞固定
理想的細胞固定過程應該保護細胞形態，同時確保目的基因DNA或RNA序列暴露。對於RNA-RNA原位雜交有效的固定劑是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸緩沖液PBS、賴氨酸、過碘酸鹽及重酪酸鹽）。
1、塗片細胞原位雜交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗滌細胞，於0.1%胰蛋白酶消化，收獲細胞計數，塗載玻片上。
(2)若檢測RNA，固定於4%多聚甲醛pH7.0，在4℃下放60分鍾，PBS洗5分鍾，系列乙醇脫水乾燥，-20℃保存。
(3)若檢測DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小時，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾，浸泡在下述溶液中2×5分鍾：
0.25%(v/v)Tritonx-100；0.25%(v/v)Nonidet P40；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鍾。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中，37℃處理10分鍾，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃處理15分鍾，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鍾。
注意：對於DNA-DNA原位雜交多聚甲醛或福爾馬林均可，但對於地高辛檢測法必須用4%多聚甲醛，固定至少16小時，而且用蛋白酶K處理，這樣可明顯減少背景染色。
四、原位雜交
原位雜交與鹽濃度、溫度、甲醯胺濃度、pH等有關，DNA復性的溫度是16～32℃，DNA-RNA原位雜交，25℃最佳，RNA-DNA雜交，可用較高溫度，在pH5～9范圍內復性率基本上與pH無關。最好選用溫和的鹼性條件。甲醯胺有機溶劑可降低雙鏈核酸的穩定性，可避免雜交過程中處於過高的溫度，防止高溫破壞組織。
(一)同位素標記DNA探針的原位雜交
同位素標記的DNA探針，敏感性高，但要注意非特異結合，如35S標記探針在雜交前，用未經標記的dUTP預雜交，可減少非特異，可獲較好的細胞內定位，此外還常用3H或125I標記探針，但3H放射線弱，自顯影需100天曝光，不太理想，方法如下：
(1)取已形成單層的細胞的蓋玻片，懸浮細胞可採用離心法，將細胞粘附到塗有明膠的載玻片上。組織印片，冰凍切片等標本。
(2)將標本浸入甲醇固定5分鍾，再過3次4℃預冷的10%三氯醋酸。
(3)將細胞片標本浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥，這時培養細胞蓋玻片應該用中性樹膠固定於載玻片上，注意細胞面向上。
(4)將細胞片放置在金屬盤內，並將托盤放入43℃水浴箱中預熱。
(5)直接向固定的細胞面滴加5mL含探針雜交液，然後用16mm蓋玻片覆蓋，其邊緣用橡膠液封閉。
(6)43℃恆溫水浴箱內培養18小時，此間保持箱內高濕度，防止因蓋玻片封閉不嚴導致雜交緩沖液乾涸。
(7)反應結束後，將玻片置於冰塊上，用鑷子小心剝下蓋玻片周邊的橡膠，將載玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使蓋玻片脫落。
(8)將載玻片放入濕盒中，加2×SSC溶液浸沒玻片，加蓋玻片並用膠帶封閉濕盒。然後，將濕盒移入水浴箱中53℃處理30分鍾。
(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分鍾。
(10)玻片浸入70%乙醇脫水，空氣乾燥。
(11)將乾燥後的乾燥標本浸入新配製的核4乳膠液（核4乳膠液蒸餾水=1:1），垂直取出玻片，用濾紙擦去背面多餘膠，室溫乾燥5小時（在暗室中進行）。
(12)用黑紙包裹標本放在4℃冰箱曝光（3H標記的探針通常需2～4周，有時需長達100天，可造成高背景，而不理想）。
(13)按常規顯影、定影、水洗。
(14)對標本進行Giemsa或HE染色、脫水、封片。
結果分析：鏡下觀察，如需定量，可在鏡下計數銀顆粒或拍攝顯微照片，用圖象分析儀進行灰度分析。
(二)同位素標記RNA探針的原位雜交
RNA探針容易制備，合成率較高，成本低，易純化，可提高檢測敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA雜交比DNA-DNA雜交穩定，能適應更多的條件。
(1)標本處理同前
(2)將RNA標記探針溶於雜交緩沖液中（5×107CPM/ml放射強度）。
50～70%去離子甲醯胺 2×SSC
0.5×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH7.0
200μg/mL變性魚精DNA 85℃ 5分鍾
(3)每張載玻片上滴加雜交液，使每張載玻片探針總量為2×105CPM，用一硅化的蓋玻片蓋住，封以不透性礦物油，在利於探針的溫度下（常為42℃）雜交7～18小時。
(4)用氯仿洗數次，去除礦物油，室溫下使蓋玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC液，雜交溫度下60分鍾，室溫2×SSC洗5分鍾，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除單鏈RNA，再滴加50%～70%去離子甲醯胺，0.1×SSC,室溫15分鍾，室溫下用0.1×SSC洗5分鍾。
(5)將切片脫水，浸入由1%甘油稀釋的放射自顯影乳劑（1:1）中，放入暗盒中，在有硅膠乾燥劑存在下-70℃，存放5天（或者曝光於X光膠片24～48小時），隨後浸於液體乳劑。
(6)用HE染色。
(三)地高辛標記的DNA探針原位雜交
放射性同位素標記探針缺點是有放射損傷，易污染環境，需特殊防護和實驗條件，有半衰期受限、標記不穩定及曝光時間長。若改用生物素、乙醯氨基、熒光或地高辛標記可避免，其中以地高辛標記探針最敏感，隨機引物標記地高辛，其標記率很高，此探針用於原位雜交可獲高敏感性，好的細胞定位以及低背景。非同位標記探針還可以通過雙標記原位雜交法，同時測多條DNA序列。
(1)配液：①雜交緩沖液：2×SSC
5%（W/V）磷酸葡聚糖
50%去離子甲醯胺
②緩沖液I： 0.1mol/L Tris-HCL pH7.5
0.5mol/L Nacl
③緩沖液II： 0.1mol/L Tris-HCL pH9.5
0.1mol/L Nacl
5mmol/L MgCl2
(2)操作步驟：
①組織標本處理同前。
②將140ng/mL地高辛標記的探針加到雜交緩沖液中，每張滴加50μL雜交緩沖液，用蓋玻片蓋住，四周封以樹膠。
③將目的DNA和DNA探針放入90℃，進行變性10分鍾，雙鏈打開，42℃，在潮濕環境中雜交16小時。
④去除蓋玻片，按下列條件洗滌：
2×SSC室溫10分鍾→2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC室溫10分鍾→0.2×SSC 42℃ 20分鍾。
⑤再按以下方法處理：
1) 在緩沖液I中洗30分鍾。
2) 在含有20%羊血清的緩沖液I中洗30分鍾。
3) 滴加1:5000標有鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶的地高辛抗體，在裝有緩沖液I的濕盒中溫育20分鍾。
4) 在緩沖液I中洗2×20分鍾。
5) 在緩沖液II中洗60分鍾。
6) 加入下述溶液：緩沖液II
0.33mg/mL 四唑氮蘭
0.17mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate
7) 將切片浸於20mmol/L Tris-HCL pH7.5，5mmol/L EDTA終止反應。
⑥ 用底物顯色、復染、脫水、封片，按免疫組化常規法進行。
說明：
(1)用不同濃度和不同溫度的鹽溶液洗滌是為了去除探針與不完全同源序列雜交，減少非特異性顯色，其原則鹽濃度由高到低，溫度由低到高洗滌，洗滌過程中切勿使切片乾燥。
(2)應該有陽性和陰性對照，陽性對照：用該探針與已知含互補序列的組織細胞標本進行雜交。陰性對照：①應用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未標記探針；③不加核酸探針進行雜交（空白對照）；④用不含探針DNA的無關質粒DNA替代探針進行雜交；⑤同義RNA（Sense probe）進行雜交。

❼ 核酸雜交液中的甲醯胺是那種呢單純的甲醯胺還是去離子甲醯胺，還是別的甲醯胺，謝謝

核酸雜交液中的甲醯胺一般用去離子甲醯胺。

❽ 病毒RNA的提取方法主要有哪幾種

方法很多（我從小木蟲粘貼了一份很全的流程），主流的有三種。
一、提禽流感病毒的詳細步驟，可參考（我提過N次做定量PCR都沒問題）：
1.取200ul樣品數+陰性對照+陽性對照個1.5ml滅菌eppendorf管
2.加600ul異硫氰酸胍，然後加入對照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻
3.13000rpm離心15min
4.在第3步離心快結束時，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預冷的異丙醇
5.取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結束往外拿的時候，管子盡量不要傾斜）轉移到第4步准備的管中，顛倒混勻
6.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體
7.加600ul 75％乙醇，顛倒數次以洗滌殘存異丙醇
7.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體
8.4000rpm離心10sec，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫乾燥2－3min（不可過分乾燥，防止下一步RNA不溶解）
9.加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓後的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec，冰上保存備用（最好2小時內使用，以免RNA降解）
二、用TRIzol LS提取
應用TRIzol LS提取病毒RNA
所提取物為血清、血液、細胞培養液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時盡量在人少時進行，防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應是無RNA酶的。
1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混勻，室溫放置10min。
1.2 加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震盪離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現象），室溫放置10min （由於氯仿沸點低、易揮發，振盪時離心管可能爆開，小心）。
1.3 離心 4℃、13000r/min、15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動白色中間相）。
1.4 加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。
1.5 離心 4℃、13000r/min、15min，（這時乍一看會發現管子里好像沒有東西，再仔細看看，會發現靠近管底的壁上有一星點的白色沉澱物，就是它了）用槍小心吸去所有上清。
1.6 1ml75%乙醇洗一遍，離心 4℃、8000r/min、10min，（這時又會發現管子沒東西了，不要擔心，有的，但是因為量太少看不見罷了）用槍小心吸去所有上清，在超凈台中乾燥5min。
1.7 加入適量DEPC處理水。（如果材料來源豐富的話，加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量；若要省著點用，則自己看著辦了，盡量不要加太多的水）。
1.8 建議立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇後凍存於－70℃，可保存一年；若加入DEPC水後則只能在－20℃保存1個月左右。
三、Trizol法提禽流感病毒protocol
Trizol法適用於人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。
1、 取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積 Trizol液，混勻；
2、 室溫放置5分鍾，然後以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖盪離心管15秒；
3、 取上層水相於一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鍾，12000g離心10分鍾；
4、 棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7500g離心5分鍾；
5、 重復第4步；
6、 小心棄去上清液，然後室溫乾燥5-10分鍾，注意不要乾燥過分，否則會降低RNA的溶解度；
7、 然後將RNA溶於水中，放置10分鍾。
[注意]
1、 整個操作要帶口罩及一次性手套，並盡可能在低溫下操作。
2、 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉澱在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年
真核生物的基因組是DNA，為什麼不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之後，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質。
所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因為獲取的DNA裡面會含有非編碼區。要表達真核生物的基因並表達出相應的蛋白，只能通過提取其mRNA並RT-PCR這條頗費周折的途徑。
1．RNA的提取
RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然後經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉澱，洗滌，晾乾，最後溶解。但是由於RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。
1．1 分離高質量RNA
成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長並且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。
一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結果。另外，分離poly(A)+RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。然而，當分析稀有mRNA時，poly(A)+RNA會增加檢測的靈敏度。
1．2 RNA提取的最大影響因素-RNA酶
在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由於RNA酶廣泛存在而穩定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在於操作人員的手汗、唾液等，也可存在於灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃製品、塑料製品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。
1．3 常用的RNA酶抑制劑
*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。
*異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
*氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑製作用。
1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准備的工作
*盡可能在實驗室專門辟出RNA操作區，離心機、移液器、試劑等均應專用。RNA操作區應保持清潔，並定期進行除菌。
*操作過程中應始終戴一次性橡膠手套和口罩，並經常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內或污染用具。盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。
*盡量使用一次性的塑料製品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經常使用RNase H、T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。
*關於一次性塑料製品，建議使用廠家供應的出廠前已經滅菌的tips和tubes等。多數廠家供應的無菌塑料製品很少有RNase污染，買來後可直接用於RNA操作。用DEPC等處理的塑料製品，往往由於二次污染而帶有RNase，從而導致實驗失敗。
*所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
*無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNase的活性。
*配製溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應採用未開封的新瓶裝試劑。
*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水沖洗，晾乾。
*配製的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配製，然後經0.22μm濾膜過濾除菌。
1．5 RNA提取的一般步驟
RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉澱RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA
破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布於上層，與蛋白層分開。
沉澱RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。
洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之後可以晾乾或者烤乾乙醇，但是不能過於乾燥，否則不易溶解。
融解RNA一般使用TE。
保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對於長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大於4kb的轉錄本對於痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲醯胺中，存於-70℃。用於保存RNA的甲醯胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源於胰臟的RNA至少可以在甲醯胺中保存一年。當准備使用RNA時，可以使用下列方法沉澱RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鍾。
1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法
TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在於水樣層中。收集上面的的水樣層後，RNA可以通過異丙醇沉澱來還原。在除去水樣層後，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉澱的方式還原。乙醇沉澱能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉澱出蛋白。共純化DNA對於樣品間標准化RNA的產量十分有用。
TRIZOL是有毒物，接觸皮膚或者不慎吞服，會導致灼傷，一旦接觸皮膚後立即以大量的洗滌劑和清水清洗。TRIZOL在室溫下能穩定保存12個月。盡管如此，為達到最佳效果，建議保存在2-8°C的環境下。
2．RT-PCR
RT-PCR是指將逆轉錄(Reverse Transcription；RT)反應和PCR (Polymerase Chain Reaction)反應組合在一起的方法。
2．1 RT-PCR的原理
RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用於對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易於操作。
RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然後取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優化的條件下，在一隻管中順次進行。
2．2 RT-PCR的步驟
⑴在冰浴離心管裡面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去離子水5uL，混勻，離心3-5秒；
⑵70度水浴5分鍾，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對）；
⑶加入5×反應液4uL，RNase抑制劑1uL，dNTP 2uL（這些應該先配好，然後分再裝到每一管），混勻；
⑷37度水浴5分鍾，加入1uL AMV-RT反轉錄酶，混勻；
⑸37度水浴1小時（此步是反轉錄過程）；
⑹70度10分鍾結束反應（此處是滅活酶活性，避免對後續實驗產生干擾），產物置冰上進行下一步PCR實驗，餘下的-70度保存。
2．3 RT-PCR的引物設計
RT-PCR引物設計和一般PCR引物設計可以遵循同樣的原則。細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點，而設計失敗的引物則各有各的缺點：
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。
* 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。
* 避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。
* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。
目的序列上並不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時並不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。
引物的穩定性依賴於儲存條件。應將乾粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大於10μM濃度溶於TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。乾粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。
2．4 引物退火溫度
引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對於設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。
根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低於估算的Tm 5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由於在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然後再根據較低Tm設計的退火溫度進行剩餘的循環。這使得在較為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2．5 提高逆轉錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助於RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對於多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然後迅速置於冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性後也是如此。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物（GSP）進行cDNA合成時。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。不要在高於60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鍾。除了使用較高的逆轉錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，並加入預熱的2×的反應混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助於防止較低溫度時所發生的分子間鹼基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。
2．6 促進逆轉錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內的添加劑加到第一鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定並解開RNA二級結構，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。為了在逆轉錄反應中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10％的甘油並在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為0.4％，這不足以抑制PCR。
在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，並不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。
使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉錄酶：逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA，不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，並降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。RNaseH-的MMLV逆轉錄酶及RNaseH-的AMV，比MMLV和AMV能得到更多量和更多全長。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。RT-PCR產物的大小受限於逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。RNaseH-的逆轉錄酶可以顯著提高長RT-PCR產物的產量，同時增加了熱穩定性，所以反應可以在高於正常的37-42℃的溫度下進行。
2．7 RNaseH處理
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對於某些模板，據認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了或AMV合成的cDNA所產生的信號。對於多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。
2．8 小量RNA檢測方法的提高
當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助於增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨後的沉澱。對於小於50mg的組織或106個培養細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。
2．9 一步法同兩步法RT-PCR的比較
兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個樣品檢測多個mRNA時比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優點。一步法RT-PCR在處理大量樣品時易於操作，有助於減少殘余污染，因為在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度，最低可以達到0.1pg總RNA，這是因為整個cDNA樣品都被擴增。對於成功的一步法RT-PCR，一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成。
2．10 增加RT-PCR特異性
第一鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法，各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。
隨機引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個轉錄本的多個位點退火，產生短的，部分長度的cDNA。這種方法經常用於獲取5'末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA，需要按經驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數真核細胞mRNA 3'端所發現的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機引物相比，cDNA的數量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優化。建議每20μl反應體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用於多數RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因為其熱穩定性較好，適用於較高的保溫溫度。
基因特異性引物（GSP）對於逆轉錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用於設計PCR引物的規則同樣適用於逆轉錄反應GSP的設計。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴增引物序列相同，或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。對於部分擴增對象，為了成功進行RT-PCR，需要設計多於一個反義引物，因為目的RNA的二級結構可能會阻止引物結合。建議在20μl的第一鏈合成反應體系中使用1pmol反義GSP。
2．11 提高逆轉錄保溫溫度
為了充分利用GSP特異性的全部優點，應該使用有較高熱穩定性的逆轉錄酶。熱穩定逆轉錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應嚴謹性。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃，那麼如果使用AMV或M-MLV在低嚴謹性的37℃進行逆轉錄，GSP所帶有的特異性就沒有完全利用。然而某些特別的逆轉錄酶可以在50℃或更高進行反應，這就會消除較低溫度時產生的非特異性產物。為獲得最大的特異性，可以將RNA/引物混合物直接從65℃變性溫度轉移到逆轉錄保溫溫度。這有助於防止低溫時分子間鹼基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉換。
2．12 減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產生於基因組DNA的產物，可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鍾以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發生的依賴於鎂離子的RNA水解。
為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產物分開，可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源於cDNA的PCR產物會比來源於沾染的基因組DNA的產物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產物來源於基因組。

❾ 甲醯胺的物化性質

性狀：透明油狀液體，略有氨臭，具有吸濕性，可燃。
相對密度：1.133(20/4℃)
沸點：210℃。
熔點：2.55℃。
閃點：154℃（開杯）
折射率：nD(25℃)1.4468。
燃點：>500℃。
粘度：（20℃）2.926mPa·s。
禁配物：強氧化劑、酸類、鹼。
溶解性：不溶於醚類及含氯溶劑，微溶於苯，能與水、甲醇、乙醇、乙酸、丙酮、二氧六環、乙二醇、苯酚和低級酯混溶。本品可以溶解酪蛋白，但不溶解白蛋白。也能溶解酪素、葡萄糖、玉米蛋白、明膠、動物膠、樹脂、澱粉、木素、乙酸纖維、尼龍以及某些無機鹽：銅、鉛、鋅、錫、鈷、鐵、鋁和鎳的氯化物，某些硫酸鹽，硝酸鹽。
化學性質：在室溫下甲醯胺的水解速度很慢，提高溫度或加入酸、鹼，均可使水解加速。在催化劑存在下，加熱至35℃以下，可分解出氰化氫。甲醯胺有兩個活潑的官能團，即羰基和醯胺基，容易起化學反應，生成許多含氮雜環化合物。甲醯胺能與無機酸反應，生成甲酸及銨鹽。在催化劑存在下與有機鹵化物或醇類反應，生成甲酸酯。本品還能與β-二酮、β-亞氨酮、脂肪偶姻、芳烴偶姻、雜環偶姻反應。能與鈷鹽、銅鹽及鎳鹽等結合生成絡合物。甲醯胺遇五氧化二磷等強脫水劑時，可生成氰化氫。與五硫化二磷反應，生成硫甲醯胺。甲醯胺能強烈腐蝕銅、黃銅、鉛、橡膠，所以貯存及運輸時，應注意。

❿ 去離子甲醯胺的一些嘗試性問題！！

甲醯胺不穩定，是因為受熱分解為氨和和一氧化碳！事實上甲酸，甲酸鹽，甲（酸專）醯胺都不穩定屬，受熱脫水生成CO。我想去離子甲醯胺並不是脫水形成的，因為脫水後就完全分解了！況且甲醯胺就這一種脫水分解的途徑！去離子甲醯胺其實就是很純的甲醯胺HCONH2！你可以看看這個http://www.biocity.biz/Catalog/Reagent/Sigma/200511/425.html