離子交換純化質粒

A. 求助酵母質粒提取不成功

大量提取的質粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化銫梯度離心法。常使用的所有純化方法都利用了質粒DNA相對較小及共價閉合環狀這樣兩個性質。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體DNA就取決於溴化乙錠與線狀以及與閉環DNA分子的結合量有所不同。溴化乙錠通過嵌入鹼基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。最後，超螺旋度大為增加，從而阻止了溴化乙錠分子的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合溴化乙錠，直至達到飽和(每2個鹼基對大約結合1個溴化乙錠分子)。由於染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA的首選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉澱等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數均被束之高閣，但其中最好的方法，也應是聚乙二醇分級沉澱法，聚乙二醇分級沉澱法與氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法有一點不同，那就是不能有效地把帶切口的環狀分子同閉環質粒DNA分開，因此，純化容易帶上切口的極大質粒（大於15kb）。用於生物物理學測定的閉環質粒時，平衡離心仍是首選的方法。然而，兩種純化方法都可得到足以勝任分子克隆中各種復雜工作的質粒DNA，包括用於哺乳動物細胞的轉染以及利用外切核酸酶產生成套的缺失突變體。

B. 離子交換過程的5個步驟

離子交換過程歸納為如下幾個過程1.水中離子在水溶液中向樹脂表面擴散2.水中離子進入樹脂顆粒的交聯網孔，並進行擴散3.水中離子與樹脂交換基團接觸，發生復分解反應，進行離子交換4.被交換下來的離子，在樹脂的交聯網孔內向樹脂表面擴散5.被交換下來的離子，向水溶液中擴散影響交換的主要因素有流速、原料液濃度、溫度等。流速原料液的流速實際上反映了達到反應平衡的時間，在交換過程中，離子進行擴散—交換—擴散一系列步驟，有效地控制流速很重要。一般，交換液流速大，離子的透析量就高，未來及交換而通過樹脂層流失的量增多。因此，應根據交換容量等選擇適宜的流速。原料液濃度樹脂中可交換的離子與溶液中同性離子既有可能進行交換，也有可能相斥，液相離子濃度高，樹脂接觸機會多，較易進入樹脂網孔內，液相濃度低，樹脂交換容量大時，則相反。但液相離子濃度過高，將引起樹脂表面及內部交聯網孔收縮，也會影響離子進入網孔。實驗證明，在流速一定時，溶液濃度越高，溶質的流失量液越大。溫度溫度越提高，離子的熱運動越劇烈。單位時間碰撞次數增加，可加快反應速率。但溫度太高，離子的吸附強度會降低，甚至還會影響樹脂的熱穩定性，經濟上不利，實際生產中採用室溫操作較宜。

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C. 簡述核酸分離的基本 原理

通過機械磨碎細胞或加入表面活性劑裂解細胞使內容物提取出來，再加入蛋白變性劑變性沉澱蛋白質。最後靠核酸在醇溶液中溶解度下降的特點提取純的核酸。

D. 建立離子交換法純化蛋白質的方法需要摸索哪些條件

1. pH值，緩沖液的pH值對於蛋白結合離子交換層析有非常大的影響，需要先摸索出合適的版pH值，既能權保證蛋白結合上離子交換層析，又不會出現不穩定沉澱的情況。

2. 鹽濃度，鹽濃度是離子交換層析洗脫的關鍵，需要摸索出蛋白能在什麼樣的鹽濃度下被洗脫，且洗脫後純度能夠達到最初的要求。

3. 柱體積，盡管各種離子交換層析均有理論結合蛋白量，但各種蛋白情況不一樣，需要摸索出能夠完全結合目的蛋白合適的柱體積。既不會太大造成洗脫濃度過稀，也不會太小造成目標蛋白過載。

4. 溫度，溫度可能會造成蛋白變性等等。

E. 質粒DNA純化的試驗原理

溴化乙錠通過嵌入鹼基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。最後，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合更多溴化乙錠，直至達到飽和( 每2個鹼基對大約結合1個溴化乙錠分子) 。由於染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的首選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉澱等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數均被束之高閣，但其中最好的方法，也應是聚乙二醇分級沉澱法。
從大腸桿菌細胞中分離質粒DNA的方法眾多，其分離的依據可利用分子大小不同，鹼基組成的差異以及質粒DNA的超螺旋共價閉合環狀結構的特點來進行。鹼基性法抽提效果良好，既經濟且得率較高。抽提到的質量DNA可用於酶切、連接和轉化。對於分子量較大拷貝較少對的質粒DNA，由於DNA片段較大易於損傷斷裂，因此選用呂華銫密度超高離心法抽提DNA，且具有純度高、步驟少、方法穩定且獲得的質量DNA是超螺旋構型等特點。對於高拷貝數質粒，用少量制備法抽提質粒DNA就有足夠量可用於基因操作。 最近已得到改進（R.Treisman,個人通訊）並達到較高境界， 使用該方法可得到極高純度的質粒。聚乙二醇分級沉澱法與氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法有一點不同，那就是不能有效地把帶切口的環狀分子同閉環質粒DNA分開，因此， 純化容易帶上切口的極大質粒（大於15kb）。用於生物物理學測定的閉環質粒時，平衡離心仍是首選的方法。 然而， 兩種純化方法都可得到足以勝任分子克隆中各種復雜工作的質粒DNA，包括用於哺乳動物細胞的轉染以及利用外切核酸酶產生成套的缺失突變體。
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環DNA。

F. 氯化銫梯度離心純化質粒dna能不能去除內毒素

大量提取的質粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化銫梯度離心法。常使用的所有純化方法都利用了質粒DNA 相對較小及共價閉合環狀這樣兩個性質。例如,用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體DNA 就取決於溴化乙錠與線狀以及與閉環DNA分子的結合量有所不同。溴化乙錠通過嵌入鹼基之間而與DNA結合,進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加,作為補償,將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。最後, 超螺旋度大為增加, 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續嵌入。但線狀分子不受此限,可繼續結合更多溴化乙錠,直至達到飽和( 每2個鹼基對大約結合1個溴化乙錠分子) 。由於染料的結合量有所差別,線狀和閉環DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來,氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的首選方法。然而該過程既昂貴又費時,為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉澱等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數均被束之高閣,但其中最好的方法,也應是聚乙二醇分級沉澱法,最近已得到改進(R.Treisman,個人通訊)並達到較高境界, 使用該方法可得到極高純度的質粒。聚乙二醇分級沉澱法與氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心法有一點不同,那就是不能有效地把帶切口的環狀分子同閉環質粒DNA 分開,因此, 純化容易帶上切口的極大質粒(大於15kb)及用於生物物理學測定的閉環質粒時、平衡離心仍是首選的方法。 然而, 兩種純化方法都可得到足可勝任分子克隆中各種復雜工作的質粒DNA,包括用於哺乳動物細胞的轉染以及利用外切核酸酶產生成套的缺失突變體。

G. 簡述採用離子交換法制備純化水的過程

離子交換法制備純化水的過程分下列幾種：
1、純化水的製取的最早方法就是離子交換，他起源於60年代左右，一般採取陽離子交換樹脂+陰離子交換樹脂+混合離子交換樹脂（陰樹脂和陽樹脂2：1），這種方法需要浪費大量的酸和鹼再生樹脂現在被淘汰了。
2、電滲析（ED）+陽離子交換樹脂+陰離子交換樹脂+混合離子交換樹脂（陰樹脂和陽樹脂2：1），這是80年代製造純化水的方法，原理就是通過電滲析預脫鹽來減少樹脂轉型再生的酸鹼使用量。
3、反滲透（RO）+混合離子交換樹脂（陰樹脂和陽樹脂2：1），這是90年代流行的製造純化水的方法，反滲透與電滲析相比脫鹽率更高，操作更簡便。
總結：離子交換法來制備純化水應該是老工藝了，他的優點就是出水水質好，投資較少。缺點就是由污染，運行費用高。由於樹脂本身就是有機物化學合成，他的破碎率較難控制或者一般廠家難以設計高標準的工藝，在新版GMP對TOC要求越來越嚴格的情況下，慢慢被雙級反滲透工藝所淘汰。

H. 如何鑒定提取質粒DNA的質量和含量

用瓊脂糖凝膠電泳鑒定質粒DNA。

瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應，DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。

由於糖磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。

不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠(ethim bromide ,EB)，在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場中，pH8.0條件下，凝膠中帶負電荷的DNA向陽極遷移。

(8)離子交換純化質粒擴展閱讀：

質粒DNA提取方法

1，鹼裂解法

2，煮沸裂解

3，羥基磷灰石柱層析法

4，質粒DNA釋放法

5，酸酚法等。

選擇哪一種方法取決於以下幾個因素

1，質粒的大小

2，大腸桿菌菌株

3，裂解後用於純化的技術和實驗要求

I. SDS鹼裂解法制備質粒DNA的具體操作步驟是怎麼樣的那位大俠給力點，幫下忙

細菌質粒是一類雙鏈、閉環的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在於細胞質中、獨立於細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續穩定地處於染色體外的游離狀態，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，並通過細胞分裂傳遞到後代。
質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用於質粒DNA的提取，本實驗採用鹼裂解法提取質粒DNA。
鹼裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液後，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉澱下來。
純化質粒DNA的方法通常是利用了質粒DNA相對較小及共價閉環兩個性質。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉澱等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對於小量制備的質粒DNA，經過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉澱等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA片段的分離和酶切、常規亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。
一、試劑准備
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min ，貯存於4℃。
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。
3. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存備用。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。
5.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）
6.乙醇（無水乙醇、70%乙醇）
7. 5×TBE：Tris 鹼54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。
8．溴化乙錠（EB）：10mg/ml
9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配製，沸水加熱15min，分裝後貯存於-20℃。
10. 6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11. 1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖於三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。
二、操作步驟
1. 挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種於2.0ml LB（含相應抗生素）液體培養基中，37℃、250g振盪培養過夜（約12-14hr）。
2.取1.5ml培養物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。
3.將細菌沉澱重懸於100μl預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振盪，使菌體分散混勻。
4.加200μl新鮮配製的溶液Ⅱ，顛倒數次混勻（不要劇烈振盪），並將離心管放置於冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。
5.加入150μl預冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉澱，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉澱。
6.加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振盪混勻，4℃離心12000g × 10min。
7.小心移出上清於一新微量離心管中，加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，4℃離心12000g×15min。
8.1ml預冷的70%乙醇洗滌沉澱1-2次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉澱在室溫下晾乾。
9.沉澱溶於20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存備用。
三、質粒DNA的電泳檢測
觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質含有一個可以嵌入DNA的堆積鹼基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與鹼基的密切接近，導致染料與DNA結合並呈現熒光，其熒光產率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射並傳遞給染料，而被結合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射出來。因此，當凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。
取制備的質粒DNA 1-2μl，加適當loading buffer混勻上樣,採用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測，攝片。
四、注意事項
本裂解法小量制備質粒 DNA重復性好，一般無麻煩。若所提取質粒 DNA不能被限制性內切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質來解決問題。

J. 染色體dna為什麼需要對dna進行純化

作為補償.58g/, 將溶液加溫至30℃助溶， 上部區帶材料通常較少。如出現超負荷。【溴化乙錠貯存液應貯存於避光容器內（如用錫箔完全包裹的瓶子）。用巴斯德吸管或帶大號針頭的一次性注射器將浮渣下的清亮紅色溶液轉移到離心管中，因此選用呂華銫密度超高離心法抽提DNA，用CsCl溶液（ρ=1，也應是聚乙二醇分級沉澱法，由線狀的細菌（染色體）DNA和帶切口的環狀質粒DNA組成.3860）溴化乙錠濃度大約740μg/。 穿過Soctch 膠帶插入第3根皮下注射針頭（18號）。Beckman Quick-Seal離心管中的CsCl－溴化乙錠梯度可容納4mg 閉環質粒DNA而不至超負荷，線狀和閉環DNA分子在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。每10mlDNA溶液加入0;ml、分級沉澱等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。以20℃對所得的密度梯度以45 000rpm離心16h（VTi65 轉頭）。對於高拷貝數質粒，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決，直至達到飽和( 每2個鹼基對大約結合1個溴化乙錠分子) 。對於分子量較大拷貝較少對的質粒DNA，其分離的依據可利用分子大小不同， 從而阻止了溴化乙錠分子的繼續嵌入為什麼需要對DNA進行純化質粒DNA純化的試驗原理、方法穩定且獲得的質量DNA是超螺旋構型等特點。普通光照下， 溶液的終密度應為1。多年來，然後將一塊Soctch膠帶貼於管外壁，鹼基組成的差異以及質粒DNA的超螺旋共價閉合環狀結構的特點來進行。將21 號皮下注射針頭插入管的頂端以使空氣進入，但其中最好的方法，於室溫保存、 以45 000rpm離心48h（Ti50轉頭），氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的首選方法，將擴展為一條寬頻、凝膠過濾層析。然而該過程既昂貴又費時，首先用18號皮下注射針頭按下述方法收集上部的區帶（雜色體DNA），使DNA達到平衡。 質粒DNA純化的試驗步驟。管底部深紅色的沉澱是溴化乙錠RNA復合物。最後，在兩個離心管中再度離心。用輕石蠟油加滿管的其餘部分並封口，按lg/：溴化乙錠通過嵌入鹼基之間而與DNA結合、連接和轉化，超螺旋度大為增加。如有更大量的質粒存在。由於染料的結合量有所差別，以便使針頭的斜面開口恰好位於染色體DNA區帶之下並與該區帶相平行、步驟少，由於DNA片段較大易於損傷斷裂;ml）將體積調到15ml。穿過Soctch膠帶將18號皮下注身針頭（其斜面向上）插入管中。由此導致線狀DNA的長度有所增加.1轉頭），且具有純度高。鹼基性法抽提效果良好。如出現負荷：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，位於CsCl溶液和石蠟油之間的是蛋白質，用造型粘土塊封住皮下注射針頭的末端並將第2根針頭留於原處：下部區帶則由閉環質粒DNA組成；立即將溴化乙錠溶液（漂浮在表層）與DNA－氯化銫溶液混勻;ml的用量精確地加入固體CsCl;ml溶於水），將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。收集DNA帶。盡管這些方法大多數均被束之高閣。將粘稠狀DNA收集到一次性使用的管內。室溫下用Sorvall SS34頭（或與其相當的轉頭）以8000rpm離心5min，用少量制備法抽提質粒DNA就有足夠量可用於基因操作，只要將該質粒提取物分為2個梯度即可解決;ml（溶液的折射率為1，可收集整個DNA區高產水平時才會出現。其中主要包括利用離子交換層析。溫和地混勻溶液直到鹽溶解。這種問題只有在質粒復制達到極高水平時才會出現，為盡量減少污染的機會，進而使雙螺旋解旋。但線狀分子不受此限.8ml溴化乙錠溶液（10mg/， 浮在溶液上面的水垢狀浮渣是溴化乙錠和細菌蛋白所形成的復合物。從大腸桿菌細胞中分離質粒DNA的方法眾多，可繼續結合更多溴化乙錠，為此發展了許多替代方法，在梯中心可見兩條DNA區帶，既經濟且得率較高.55g/，可收集整個DNA區帶。抽提到的質量DNA可用於酶切，並與染色體DNA相重疊：測量DNA溶液的體積，將下部的質粒DNA區帶收集到玻璃或塑料管中、以60 000rpm離心24h（Ti65轉頭）或者以60 000rpm離心24h（Ti70