stv6型無菌檢查薄膜過濾器

A. 包裝材料的微生物限度也是做6天嗎

微生物限度

1. 包裝材料的大腸埃希菌檢查？

2. 根據包裝材料的不同，大腸埃希菌的檢查方法大致有兩種，一種是將浸提液合並後，取

3. 一部分，接種膽鹽乳糖培養基進行檢查；另一種是將浸提液合並後，薄膜過濾，然後按規定

4. 的方法檢驗。

5. 2. 抗真菌品的微生物限度檢查法

6. 這類產品的黴菌和酵母菌計數方法需要進行調整，可以根據產品劑型的不同，選擇薄膜

7. 過濾法或培養基稀釋法等方法。

8. 3. 為什麼在日常樣品檢測中還需要做陽性對照（國外不需要）？

9. 為了確保每一次檢測對可能存在的微生物都是有效的。

10. 4. 對於同一個品種，典為什麼不規定統一的檢測方法？

11. 本版典進行過這樣的嘗試，也有某些品種已經收載了統一的檢測方法，如用頭孢

12. 類抗生素的無菌檢查。之所以沒有大量收載，主要是由於檢測方法還沒有經過必要的復核。

13. 將微生物檢驗的統一方法收載在品種的各論項下，始終是努力的方向。

14. 5. 梭菌檢查中需置厭氧條件下培養48小時，是否指在厭氧培養箱中？

15. 需要在厭氧培養裝置中進行培養，未必一定是厭氧培養箱。

16. 6. 控制菌檢查方法驗證時，採用多種方法均未檢出控制菌，如何處理？

17. 在確保所使用的各種方法都沒有錯誤的情況下，如果仍無法使試驗菌生長，則應該採用

18. 薄膜過濾法進行檢查。理由是該方法能夠最大程度地去除產品的抑菌作用。

19. 7. 常規的監督抽樣檢品（包括原料）在進行微生物限度檢查時，是否一定要進行活蟎檢查

20. 並在原始記錄與報告書中體現？

21. 需要進行檢查。可以在原始記錄中體現，報告書上可以不出現，除非當發現有活蟎檢出。

22. 8. 包材微生物限度檢查規定了合格質量水平，通常產量下取樣8個，要求8個瓶子均符

23. 合規定，如何進行？

24. 每個瓶子分別進行實驗。

25. 9. 大腸埃希菌具體操作規程？

26. 參見中國品檢驗標准操作規程。

27. 10. 動物組織及動物類原材的提取物入，是否需要檢沙門菌？

28. 需要進行沙門菌檢查。

29. 11. 關於中國典菌落計數結果的判斷還存在疑義，望能舉例說明。

30. 不清楚所指的存在疑義是指哪方面。2010年版對結果報告進行了較大篇幅的修訂，目

31. 前的規定應該比05版更為清晰、明確。

32. 12. 需做沙門菌檢驗樣品量的確定？

33. 10g（ml）用於樣品計數檢驗和其他控制菌檢查，10g（ml）用於沙門菌檢查，10g（ml）

34. 用於沙門菌檢查的陽性對照。需要進行沙門菌檢查的樣品，檢驗用量應為30g（ml）。

35. 13. 日常的實驗室裝備能否達到梭菌無氧的培養要求？

36. 完全可以。可以採用厭氧培養盒（罐）。

37. 14. 如果一個產品有兩個規格，是否可以取其中之一做陽性對照？

38. 每個規格均需進行陽性對照。

39. 15. 細菌數為100g/g的，樣品稀釋級只做1:10,1:100的倍數就可以了嗎？

40. 可以。

41. 16. 培養時間3天，5天，可理解為72小時，120小時嗎？

42. 可以。這樣更為嚴謹。

43. 17. 中國品檢驗標准操作規范「已做驗證試驗的供試品，在檢查時刻不必再做陽性對照」

44. 如何理解？

45. 該標准操作規范中在無菌檢查法中規定「供試品無菌檢查應進行陽性對照試驗」，表明

46. 不論是否進行了方法驗證，在產品的每一次檢驗過程中，還必須進行陽性對照。

47. 在控制菌檢查的大腸埃希菌項下，指出「已做驗證試驗的供試品，在該供試品檢查時不必再

48. 作陽性對照」。該規定僅適用方法驗證與供試品檢查同時開展的情況。2005年版典和2010

49. 年版典在控制菌檢查中均對陽性對照試驗有明確規定，「進行供試品控制菌檢查時，應做

50. 陽性對照試驗。」產品檢驗中應以典規定為准。

51. 18. 無菌檢查和微生物限度檢查中，產品中規定的溶解液是否可以換成其他的溶液？

52. 可以。

53. 19. 制劑通則中，沒有微生物檢查項目的，是否可不進行微生物項目檢測？

54. 可以。主要是二部制劑通則中口服片劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑。

55. 20. 在細菌、黴菌和酵母菌計數中，適用性檢查細菌是培養48小時，黴菌和酵母菌是培養

56. 72小時，供試品檢查中細菌是培養3天，黴菌和酵母菌是培養5天，那方法驗證中應

57. 參照哪個時間進行培養。

58. 應按照供試品檢驗時的條件，即細菌3天，黴菌和酵母菌5天。

59. 21. 測定純化水微生物限度時，每張濾膜過濾量是多少合適？需要先稀釋嗎？過濾完後需不

60. 需要沖洗？假如我取10ml純化水通過雙杯體封閉式薄膜過濾器過濾，每張濾膜上的計

61. 數是以5ml為單位還是10ml為單位？

62. 過濾量應以培養後出現的微生物數不超過100cfu/膜為標准。一般可不稀釋。不需要沖

63. 洗。每張濾膜的過濾量為5ml。

64. 22. 2010典中關於純化水的微生物限度是：細菌、黴菌及酵母菌總數每1ml不得過100

65. 個。這句話的意思是細菌總數每1ml不得過100個，黴菌及酵母菌總數不得過100個，

66. 還是細菌+黴菌+酵母菌總數每1ml不得過100個。如果是三者總數的話，那細菌總數
    

B. 什麼是無菌檢查法

無菌檢查法
信息來源：中國葯典2000年版二部附錄 更新時間：2006-12-10 0:26:46
標題 無菌檢查法
附錄序號 附錄ⅩⅢ
內容全文 B. 無菌檢查法
無菌檢查法系指檢查葯品與敷料是否無菌的一種方法。
無菌檢查的全部過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物的污染。
生物製品應按衛生部《生物製品製造及檢定規程》中有關無菌檢查的規定辦理。
培養基及其制備方法
1.需氣菌、厭氣菌培養基(硫乙醇酸鹽液體培養基)
酪腖（胰酶水解）
15g
氯化鈉
2.5g
葡萄糖
5g
新鮮配製的0.1％刃天青溶液
1.0ml
L－胱氨酸
0.5g
(或新鮮配製的0.2％亞甲藍溶液 0.5ml)
硫乙醇酸鈉
0.5g
瓊酯
0.5～0.7g
(或硫乙醇酸0.3ml)
水
1000ml
酵母浸出粉
5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水內，微溫溶解後，調節pH為弱鹼性，煮沸，濾清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節pH值使滅菌後為7.1±0.2，分裝，115℃滅菌30分鍾。
在無菌檢查接種前, 培養基指示劑氧化層的顏色不得超過培養基深度約1/5。否則,須經水浴煮沸加熱, 只限加熱一次。
2.黴菌培養基
腖
5g
磷酸氫二鉀（K2HPO4)
1g
酵母浸出粉
2g
硫酸鎂（MgSO4·7H2O）
0.5g
葡萄糖
20g
蒸餾水
1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水內，微溫溶解後，調節pH約6.8，煮沸,加葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，115℃滅菌20分鍾。
3.選擇性培養基
(1) 對氨基苯甲酸培養基(用於磺胺類葯物的無菌檢查)
照上述需氣菌、厭氣菌培養基及黴菌培養基的處方及製法，各加對氨基苯甲酸0.125g，溶解後搖勻，分裝，115℃滅菌30分鍾。
(2) 吐溫培養基(用於油劑葯品的無菌檢查)
照上述需氣菌、厭氣菌培養基及黴菌培養基的處方及製法，各加10ml的吐溫80，搖勻後，分裝，115℃滅菌30分鍾。
4.營養肉湯培養基
腖
10g
肉浸液
1000ml
氯化鈉
5g
取腖與氯化鈉，加入肉浸液內，微溫溶解後，調節pH為弱鹼性，煮沸，濾清，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鍾。
5.營養瓊脂培養基
照上述營養肉湯培養基的處方及製法，加入15～20g瓊脂，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鍾。
6.0.5％葡萄糖肉湯培養基
腖
10g
葡萄糖
5g
氯化鈉
5g
肉浸液
1000ml
取腖與氯化鈉加入肉浸液內，微溫溶解後，調節pH為弱鹼性，煮沸，加葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2， 分裝，115℃滅菌30分鍾。
7.黴菌瓊脂培養基
照黴菌培養基的處方及製法，加入15～20g瓊脂，調節pH值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，115℃滅菌20分鍾，趁熱斜放使凝固成斜面。
上述培養基分別按15ml與40ml分裝於試管中，裝量約為試管高度的2/5，在115℃滅菌30分鍾。細菌培養基經30～35℃培養48小時，黴菌培養基經20～25℃培養72小時後，應無菌生長。
培養基的質量應通過靈敏度檢查。
培養基靈敏度檢查法
1.菌種
(1)藤黃微球菌(Micrococcus Lutea)[CMCC(B)28001]

(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
2.操作
取藤黃微球菌的營養瓊脂斜面和白色念珠菌的黴菌瓊脂斜面的新鮮培養物分別用0.9％滅菌氯化鈉溶液製成均勻的菌懸液;將生孢梭菌的不含瓊脂需氣菌、厭氣菌培養基的新鮮培養物,吸入滅菌離心管，離心，棄去上清液，菌體用0.9％滅菌氯化鈉溶液製成均勻菌懸液。分別取上述菌懸液用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋至與細菌濁度標 准管相同的濃度，然後，作10倍系列稀釋並計數。

將藤黃微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分別接種至9ml試驗培養基中,每個稀釋度至少接種3管,以未接種的培養基管作對照，細菌試驗管置30～35℃培養3天,白色念珠菌試驗管置20～25℃培養5天。逐日記錄結果。
3.結果判定
以接種後培養基管數的2/3以上呈現生長的最高稀釋度為該培養基的靈敏度（且接種菌量均應小於10個），三次試驗中，以兩次達到的最高靈敏度為判定標准。
需氣菌、厭氣菌培養基靈敏度為藤黃微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>，黴菌培養基靈敏度為白色念珠菌1:10<6>。
[附註]
肉浸液制備法
取新鮮牛肉，除去肌腱及脂肪，切細，絞碎後,每1000g加水3000ml，充分拌勻，在2～10℃浸泡20～24小時，煮沸1小時，濾過，壓干肉渣，補足液量，分裝，121℃滅菌30分鍾，置冷暗處備用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml,配成溶液代替。
對照用菌液
1.金黃色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）菌液
取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的營養瓊脂斜面新鮮培養物1白金耳，接種至需氣菌、厭氣菌培養基內,在30～35℃培養16～18小時後，用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋成1:10<6>。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液
取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需氣菌、厭氣菌培養基新鮮培養物1白金耳,再接種至相同培養基內，在30～35℃培養18～24小時，用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋至1:10<6>。
3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液
取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的黴菌瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳,接種至黴菌培養基內，在20～25℃培養24小時後，用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋至1:10<5>。
檢查法
1. 直接接種法
(1) 供試品如為注射液、供角膜創傷及手術用的滴眼劑或滅菌溶液, 任取供試品2支（瓶）以上，用適當消毒液清潔供試品容器的外表面後,以無菌操作吸取規定接種量的供試品溶液，分別接種於需氣菌、厭氣菌培養基5管，其中1管接種對照用菌液1ml，供作陽性對照；取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照, 另接種於黴菌培養基2管，供試品溶液的每管接種量與培養基的分裝量，應根據供試品的裝量,按下列規定取用：
供試品裝量
每管接種量
培養基分裝量
2ml或2ml以下
0.5ml
15ml
2ml以上至20ml
1.0ml
15ml
20ml以上
5.0ml
40ml
接種後輕輕搖動,使勻。需氣菌、厭氣菌培養基在30～35℃培養5日, 黴菌培養基在20～25℃培養7日，抗生素類葯品均培養7日，放射性葯品培養5～7日。培養期間應逐日檢查是否有菌生長（陽性對照在24小時內應有細菌生長）；如在加入供試品溶液後，培養基出現渾濁或沉澱，經培養後不能從外觀上判斷時,可取該培養液轉種入另1支相同的培養基中或斜面培養基上，培養48～72小時後，觀察是否再現渾濁或在斜面上有無菌落生長，並在轉種的同時，取培養液少量，塗片製成染色標本，用顯微鏡觀察是否有菌生長。
(2) 供試品如為注射用滅菌粉末或無菌凍干品，照該葯品項下的規定或按該葯品劑量項下的溶劑用量，加入滅菌水或0.9％滅菌氯化鈉溶液,使內容物溶解成均勻的供試品溶液，取規定接種量的供試品溶液，接種於上述培養基中。
(3) 供試品如為供直接分裝成注射用無菌粉末的原料葯，按各該葯品項下的規定製成溶液，依法接種於培養基中。
(4) 供試品如為外科敷料，取供試品2個包裝，以無菌操作拆開包裝,於不同部位剪取約1cm×3cm的樣品，分別接種於40ml培養基中。
(5) 供試品如有抑菌作用或含有抑菌物質時，可選用適宜的培養基，或種入較大量的培養基中，使該供試品稀釋至不具有抑菌使用的濃度；或照下述「薄膜過濾法」處理並接種於培養基中。
(6) 供試品如為抗生素葯品,取該品種正文中最大規格量的供試品不少於2瓶(支)。原料葯按制劑規格項下,取最大規格量2份，分別加入足夠使青黴素滅活的無菌青黴素酶溶液適量，搖勻，分別等量接種於每管裝量為40ml的培養基中。
(7) 供試品如為放射性葯品，取供試品1瓶(支)，以每管接種量為0.2ml，接種於每管裝量為7.5ml的培養基中。
2. 薄膜過濾法
(1)供試品如為抗生素葯品，取該品種正文中最大規格量的供試品不少於2瓶(支)。原料葯按制劑規格項下取最大規格量2份, 分別按該葯品項下規定的方法處理後, 加入0.9％滅菌氯化鈉溶液至少100ml或其他適宜的溶劑中, 搖勻, 以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大於0.45±0.02μm微孔濾膜的薄膜過濾器內,減壓抽干後,用0.9％滅菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶劑沖洗濾膜3次,每次至少100ml；取出濾膜,分成4片, 取3片分別放在3管各40ml需氣菌、厭氣菌培養基中, 其中1管接種對照用菌液1ml,供作陽性對照, 另1片放在黴菌培養基管中。取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照。

(2) 供試品如為抗厭氧菌葯品，取規定量的供試品，按上述方法經薄膜過濾器處理後，取出濾膜，分成4片，其中3片放在3管需氣菌、厭氣菌培養基管中，1管接種生孢梭菌對照用菌液1ml，供作陽性對照。另1片放在黴菌培養基管中。 取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照。
(3) 供試品如為抗真菌葯品，取規定量的供試品,按上述方法經薄膜過濾器處理後,取出濾膜,分成4片，取2片分別放在2管需氣菌、厭氣菌培養基管中；2片分別放在2管黴菌培養基管中,其中1管接種白色念珠菌對照用菌液1ml，供作陽性對照。取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照。
結果判斷
當陽性對照管顯渾濁並確有細菌生長，陰性對照管陰性時,可根據觀察所得的結果判定：如需氣菌、厭氣菌及黴菌培養管均為澄清或雖顯渾濁但經證明並非有菌生長,均應判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及黴菌培養管中任何1管顯渾濁並確證為有菌生長，應重新取樣，分別依法倍量復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應判為供試品不合格。

C. 無菌要檢驗方法須進行方法學驗證嗎

微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法.檢查項目包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控制菌檢查. 微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度 100級的單向流空氣區域內進行.檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出.單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證. 供試品檢查時,如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑,應證明其有效性及對微生物無毒性. 除另有規定外,本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃. 檢驗結果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 為單位報告,特殊品種可以最小包裝單位報告. 檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm2）. 除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100cm2；貴重品、微量包裝品的檢驗量可以酌減.要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加20g 或20ml（其中10g或10ml用於陽性對照試驗）. 檢驗時,應從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品,膜劑還不得少於4 片. 一般應隨機抽取不少於檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3 倍量供試品. 供試液的制備根據供試品的理化特性與生物學特性,採取適宜的方法制備供試液.供試液制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過45℃.供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1 小時. 除另有規定外,常用的供試液制備方法如下. 1.液體供試品取供試品10ml,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml,混勻,作為1∶10 的供試液.油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻.水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液. 2.固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法,混勻,作為1∶10 的供試液.必要時加適量的無菌聚山梨酯80,並置水浴中適當加溫使供試品分散均勻. 3.需用特殊供試液制備方法的供試品 (1)非水溶性供試品方法1 取供試品5g（或5ml）,加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g 司盤80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中,用無菌玻棒攪拌成團後,慢慢加入45℃的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1∶20 的供試液. 方法2 取供試品10g,加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯（採用薄膜過濾法過濾除菌.選用孔徑為0.22μm的脂溶性濾膜,在140℃乾熱滅菌2小時）和無菌玻璃珠的適宜容器中,必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量,充分振搖,使供試品溶解.然後加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液100ml,振搖5～10 分鍾,萃取,靜置使油水明顯分層,取其水層作為1∶10 的供試液. (2)膜劑供試品取供試品100cm2,剪碎,加100ml 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液（必要時可增加稀釋液）,浸泡,振搖,作為1∶10 的供試液. (3)腸溶及結腸溶制劑供試品取供試品10g,加pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用於腸溶制劑）或pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用於結腸溶制劑）至100ml,置45℃水浴中,振搖,使溶解,作為1∶10 的供試液. (4)氣霧劑、噴霧劑供試品取規定量供試品,置冰凍室冷凍約1 小時,取出,迅速消毒供試品開啟部位,用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔,放至室溫,並輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出.用無菌器吸出全部液,加至適量的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液（若含非水溶性成分,加適量的無菌聚山梨酯80）中,混勻,取相當於10g或10ml 的供試品,再稀釋成1∶10 的供試液. (5)貼劑供試品取規定量供試品,去掉貼劑的保護層,放置在無菌玻璃或塑料片上,粘貼面朝上.用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起.然後將其置於適宜體積並含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中,用力振盪至少30 分鍾,製成供試液.貼劑也可以其他適宜的方法制備成供試液. (6)具抑菌活性的供試品當供試品有抑菌活性時,採用下列方法進行處理,以消除供試液的抑菌活性後,再依法檢查.常用的方法如下. ①培養基稀釋法 取規定量的供試液,至較大量的培養基中,使單位體積內的供試品含量減少,至不含抑菌作用.測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時,取同稀釋級的供試液2ml,每1ml 供試液可等量分注多個平皿,傾注瓊脂培養基,混勻,凝固,培養,計數.每1ml 供試液所注的平皿中生長的菌數之和即為1ml的菌落數,計算每1ml 供試液的平均菌落數,按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時,可加大增菌培養基的用量. ②離心沉澱法 取一定量的供試液, 500 轉/分鍾離心3 分鍾,取全部上清液混合,用於細菌檢查. ③薄膜過濾法 見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的「薄膜過濾法」. ④中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品,可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分.中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中. 細菌、黴菌及酵母菌計數計數培養基的適用性檢查細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查,成品培養基、由脫水培養基或按培養基處方配製的培養基均應檢查. 菌種 試驗用菌株的傳代次數不得超過5 代（從菌種保存中心獲得的冷凍乾燥菌種為第0 代）.並採用適宜的菌種保藏技術進行保存,以保證試驗菌株的生物學特性. 大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕黑麴黴（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中,培養18～24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中,培養24～48 小時.上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含菌數為50～100cfu 的菌懸液.接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中,培養5～7 天,加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫.然後,採用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含孢子數50～100cfu 的孢子懸液. 菌懸液在室溫下放置應在2 小時內使用,若保存在2～8℃可在24 小時內使用.黑麴黴孢子懸液可保存在2～8℃,在驗證過的貯存期內使用. 適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50～100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注營養瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2 個平皿,混勻,凝固,置30～35℃培養48 小時,計數；取白色念珠菌、黑麴黴各50～100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,混勻,凝固,置23～28℃培養72 小時,計數；取白色念珠菌50～100cfu,注入無菌平皿中,立即傾注酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基,平行制備2 個平皿,混勻,凝固,置23～28℃培養72 小時,計數.同時,用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗. 結果判定 被檢培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值大於70%,且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致,判該培養基的適用性檢查符合規定. 計數方法的驗證當建立產品的微生物限度檢查法時,應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證,以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定.若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,計數方法應重新驗證. 驗證時,按供試液的制備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行.對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證. 菌種及菌液制備 同計數培養基的適用性檢查. 驗證方法 驗證試驗至少應進行3 次獨立的平行試驗,並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率. （1）試驗組 平皿法計數時,取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml 和50～100 cfu 試驗菌,分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌數.薄膜過濾法計數時,取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液,過濾,沖洗,在最後一次的沖洗液中加入50～100cfu 試驗菌,過濾,按薄膜過濾法測定其菌數. （2）菌液組 測定所加的試驗菌數. （3）供試品對照組 取規定量供試液,按菌落計數方法測定供試品本底菌數. （4）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時,應增加稀釋劑對照組,以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度.試驗時,可用相應的稀釋液替代供試品,加入試驗菌,使最終菌濃度為每1ml 供試液含50～100cfu,按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數. 結果判斷 在3 次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70%.若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%,照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低於70%,應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法（表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,並重新進行方法驗證. 表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛 亞硫酸氫鈉 酚類、乙醇、吸附物 稀釋法 醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯 卵磷脂、聚山梨酯 汞類制劑 亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽 雙胍類化合物 卵磷脂 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA） 鎂或鈣離子 磺胺類 對氨基苯甲酸 ?-內醯胺類抗生素 ?-內醯胺酶 若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用,那麼驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的,同時表明該供試品不能被試驗菌污染.但是,供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑製作用,而對其他菌株沒有抑製作用.因此,根據供試品須符合的微生物限度標准和菌數報告規則,在不影響檢驗結果判斷的前提 下,應採用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗.若驗證試驗符合要求,應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗. 計數方法驗證時,採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求,那麼選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗. 驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行. 供試品檢查計數方法包括平皿法和薄膜過濾法.檢查時,按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、黴菌及酵母菌菌數的測定. 按計數方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備.用稀釋液稀釋成1∶10、1∶102、1∶103等稀釋級的供試液. 1.平皿法根據菌數報告規則取相應稀釋級的供試液1ml,置直徑90mm 的無菌平皿中,注入15～20ml 溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基,混勻,凝固,倒置培養.每稀釋級每種培養基至少制備2 個平板. 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml,置無菌平皿中,注入培養基,凝固,倒置培養.每種計數用的培養基各制備2 個平板,均不得有菌生長. 培養和計數 除另有規定外,細菌培養3 天,黴菌、酵母菌培養5 天.逐日觀察菌落生長情況；點計菌落數.必要時,可適當延長培養時間至7 天進行菌落計數並報告.菌落蔓延生長成片的平板不宜計數.點計菌落數後,計算各稀釋級供試液的平均菌落數,按菌數報告規則報告菌數.若同稀釋級兩個平板的菌落平均數不小於15,則兩個平板的菌落數不能相差1 倍或以上. 一般營養瓊脂培養基用於細菌計數；玫瑰紅鈉瓊脂培養基用於黴菌及酵母菌計數；酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基用於酵母菌計數.在特殊情況下,若營養瓊脂培養基上長有黴菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌,則應分別點計黴菌和酵母菌、細菌菌落數.然後將營養瓊脂培養基上的黴菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數,與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的黴菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較,以菌落數高的培養基中的菌數為計數結果. 含蜂蜜、王漿的液體制劑,用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定黴菌數,用酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數,合並計數. 菌數報告規則 細菌、酵母菌宜選取平均菌落數小於300cfu、黴菌宜選取平均菌落數小於100cfu 的稀釋級,作為菌數報告（取兩位有效數字）的依據.以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、1mL 或10cm2 供試品中所含的菌數. 如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落數小於1 時,以＜1 乘以最低稀釋倍數的值報告菌數. 2.薄膜過濾法採用薄膜過濾法,濾膜孔徑應不大於0.45μm,直徑一般為50mm,若採用其它直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整.選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留.濾器及濾膜使用前應採用適宜的方法滅菌.使用時,應保證濾膜在過濾前後的完整性.水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜.油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應充分乾燥.為發揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面.供試液經薄膜過濾後,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量不超過100ml,總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷. 取相當於每張濾膜含1g、1ml 或10cm2 供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾；若供試品每1g、1ml 或10cm2 所含的菌數較多時,可取適宜稀釋級的供試液1ml 進行試驗.用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法和沖洗量同「計數方法的驗證」.沖洗後取出濾膜,菌面朝上貼於營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基平板上培養.每種培養基至少制備一張濾膜. 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml 照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對照.陰性對照不得有菌生長. 培養和計數 培養條件和計數方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數應不超過100 個. 菌數報告規則 以相當於1g、1ml 或10cm2 供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌落生長,以

D. 純化水檢測需要哪些儀器.設備

基本都是顏色反復應不需制要太多的儀器設備，硝酸鹽、不揮發物、重金屬檢查：水浴鍋；微生物限度檢查：潔凈操作台、薄膜過濾器（抽濾泵）、恆溫培養箱2個。凈得瑞純化水設備系統採用RO及EDI純化水工藝，產水水質滿足客戶的生產用水要求，符合GMP、FDA等認證要求。
水浴鍋主要用於實驗室中蒸餾，乾燥，濃縮，及溫漬化學葯品或生物製品，也可用於恆溫加熱和其它溫度試驗，是生物、遺傳、病毒、水產、環保、醫葯、衛生、化驗室、分析室、教育科研的必備工具。
薄膜過濾器，放式兩用無菌檢查薄膜濾器。該產品具有兩種培養方法通用性的特點。設計合理，濾器過濾部分採用玻璃材質，化學性能穩定，密封度強，有效防止外源性污染，確保菌檢成功率。
恆溫培養箱又稱隔水式電熱細胞（黴菌）培養箱，供醫療衛生、醫葯工業、生物化學、工業生產及農業科學等科研部門作細菌培養、育種、發酵及其他恆溫試驗用。

E. 中國葯典無菌檢查法的供試品的無菌檢查

檢驗數量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量。除另有規定外，出廠產品按表1規定；上市產品監督檢驗按表2、表3規定。表1、表2、表3中最少檢驗數量不包括陽性對照試驗的供試品用量。一般情況下，供試品無菌檢查若採用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數量作陽性對照用；若採用直接接種法，應增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「抽驗數量 系指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量（支或瓶），成品每亞批均應進行無菌檢查。除另有規定外，原液、半成品和成品按表1規定，上市產品監督檢驗按表2規定。 」） 是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。除另有規定外，每份培養基接種的供試品量按表2、表3規定。若每支（瓶）供試品的裝量按規定足夠接種兩份培養基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基。採用薄膜過濾法時，檢驗量應不少於直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「接種量 系指每個最小包裝的最少取樣量（ml或g），接種供試品量按表3規定。若採用直接接種法，按接種量要求等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基中(兩種培養基的接種支（瓶）數之比為2:1);若採用薄膜過濾法，應採用三聯薄膜過濾器，其中兩聯假如硫乙醇酸鹽流體培養基，一聯加入改良馬丁培養基。只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。」） 應根據供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小於100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照管培養48～72小時應生長良好。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照的菌液制備同培養基靈敏度檢查項下金黃色葡萄球菌菌液制備方法，加菌量小於100cfu。陽性對照也可在供試品無菌檢查14天後，取其中一份硫乙醇酸鹽流體培養基，加入小於100cfu陽性對照菌，作為陽性對照。陽性對照置30℃～35℃培養48～72小時應生長良好。」） 供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。
無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應採用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所採用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。
操作時，用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒，如果供試品容器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內容物。

F. 生物製品的無菌檢查法的實驗原理，准備工作及操作步驟

1. 目的：建立無菌檢查的標准操作規程，確保檢驗結果的准確性。 2. 范圍：適用於本廠質監科化驗室對本廠生產的注射劑進行無菌檢查。3. 責任：化驗員有責任按本操作規程操作，並對檢驗結果負責。4. 定義：無菌檢查法系指檢查葯品是否無菌的一種方法。5.內容：5. 1無菌操作設備：無菌操作室或超凈工作台，無菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精燈等。5.1.1無菌室分無菌操作室和緩沖間。在緩沖間內應有洗手盆、干手器、無菌衣放置架及掛鉤、拖鞋等。無菌操作室應具有空氣除菌過濾的層流裝置，局部潔凈度100級超凈工作台。緩沖間及操作室內均設置能達到空氣消毒的紫外光燈和照明燈，操作室或工作台應保持空氣正壓。5.1.2無菌室應每周和每次操作前用0.1％新潔爾滅或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，開動無菌空氣過濾器及紫外光燈殺菌1小時。在每次操作完畢，同樣用2％甲酚或0.1％新潔爾滅溶液擦拭工作檯面，用紫外光燈殺菌半小 時。5.1.3無菌室的無菌程度檢查：無菌室在消毒處理後，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數。取直徑90mm雙碟，在接種室內點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將雙碟半開注入溶化的營養瓊脂培養基約20ml，製成平板：在35-37℃預培養48小時，證明無菌後將3個平板以無菌方式帶入無菌操作間的潔凈區域左、中、右各放1個；打開碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鍾後將蓋蓋好，置35-37℃培養48小時，取出檢查，3個平板上生長的菌落數相加總數不得超過10個。 無菌操作檯面或超凈工作台應定期請有關部門檢測其潔凈度，應達到100級（一般用塵埃粒子計數儀），檢測塵埃粒徑≤5μm的粒數不得超過3.5個／升；空氣流量應控制在0.75-1.0m3/s；細菌菌落數平均<1個，可根據無菌狀況定期置換過濾器。5.1.4無菌室內應准備好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精燈、火柴、鑷子、75％酒精棉及拖鞋等。5.2儀器、用具：5.2.1真空泵、恆溫培養箱、生物顯微鏡、托盤天平（精度0.1g）、抽濾瓶（500ml）、 三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求規格）、試管、雙碟（9cm）、注射針、鑷子、剪刀、白金耳、橡皮管、紗布、棉花（原棉）、不銹鋼吸管筒、接種環、微孔濾膜（直徑約5cm），孔徑應在0.45±0.02μm )載玻片、灑精燈、取樣勺、吸耳球、噴霧瓶。5.2.2用具的包紮：5.2.2.1移液管在移液管上端管內,鬆鬆地塞進少許原棉,然後放入不銹鋼滅菌筒內。5.2.2.2試管在管口塞上紗布棉塞。5.2.2.3無菌衣、褲、帽、口罩將洗凈的衣褲、帽子、口罩配套後裝入布袋，扎緊袋口，再用牛皮紙包好。5.2.2.4注射器洗滌干凈的注射器及注射針頭裝配好後，放入墊有紗布的帶蓋容器內（飯 第3頁/共7頁盒）一層層放好，上面蓋上紗布，然後蓋上容器的蓋子，用牛皮紙包好。5.2.2.5濾器 將檢驗合格後微孔濾膜先有水中浸泡濕潤，取出後固定在細菌過濾器的濾板上，濾板下、濾膜上均用耐高溫墊圈墊好，上好濾器。在滅菌前濾器的螺勿擰太緊，濾器上口用8層紗布及牛皮紙包紮，裝妥後放入容器內，再將盛濾器的容器蓋好蓋子，用牛皮紙包紮。5.2.3用具的滅菌：將包紮好的用具，在121±0.5℃蒸汽滅菌櫃中滅菌30分鍾，物品取出時切勿立即置冷處，以免急速冷卻滅菌物品內蒸汽冷凝造成負壓，易致染菌，應置溫箱或或加溫烘乾。5.3培養基、試劑：5.3.1一般採用商品乾燥培養基，臨用時按照使用說明書進行配製，需注意培養基的pH值應符合規定，否則必須校正後，滅菌使用。使用前，按要求分裝滅菌好的細菌培養基須經30-35℃培養48小時，真菌培養基須經20-25℃培養72小時，證明無菌生長後方可使用。 制備的需氣菌、厭氣菌培養基應半個月內用完，在供試品接種前，培養基指示劑氧化層的顏色不得超過培養基深度約1/5，否則須經水浴煮沸加熱，只限加熱一次。5.3.2革蘭氏碘液：先用3-5ml蒸餾水溶解2.0g碘化鉀，再加入1.0g碘片，攪拌溶解後，加蒸餾水稀釋至300ml，搖勻。置密閉棕色瓶中備用。5.3.3結晶紫染色液：將結紫1.0g溶解於20ml95%乙醇中後，與80ml1%草酸銨溶液相混合，靜置48小時使用。此液穩定，置密閉的棕色瓶中可儲存數月。5.3.4沙黃染色液：將0.2g沙黃溶解於10ml95%乙醇中，待完全溶解後再加蒸餾水至100ml。5.3.5生理鹽水：稱取9g氯化鈉，加水1000ml溶解，分裝後於121±0.5℃濕熱滅菌30分鍾。供作稀釋劑用。 第4頁/共7頁5.3.6 75%乙醇量取無水乙醇75ml,加水稀釋至100ml，搖勻，即得。5.3.7 0.1%新潔爾滅：量取5%新潔爾滅20ml，加水稀釋至約1000ml，搖勻，即得。5.4培養基靈敏度檢查：5.4.1新購的乾燥培養基或採用不同牌號原材料的新鮮培養基，其質量均應符合靈敏度檢查要求。 (1)取藤黃微球菌[Micrococcus luteus CMCC（B） 28001］的營養瓊脂斜面和白色念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001］的真菌培養基瓊脂斜面的新鮮培養物，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液製成均勻的菌懸液；取生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]不含瓊脂的需氣、厭氣培養基新鮮培養物，用滅菌毛細管將其吸至滅菌離心管內，離心，棄去上清液，沉澱菌體用0.9%無菌氯化鈉溶液製成均勻菌懸液。然後以10倍系列稀釋後，製成1ml中含10-100個菌並計數。 (2)取藤黃微球菌、生孢梭菌的需氣、厭氣培養基新鮮培養物，白色念珠菌的真菌培養基瓊脂斜面的新鮮培養物，取接種至黴菌培養基內，20-25℃用0.9%無菌氯化鈉溶液作10倍稀釋，製成1ml中含10-100個菌並計數。 將藤黃微球菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，分別接種至每管裝量為9ml的需氣、厭氣菌培養基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，分別接種至每管裝量為12ml的需氣、厭氣菌培養基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，接種至每管裝量為9ml的真菌培養基3管，以未接種的培養基作對照，按規定的溫度培養5天並逐日記錄結果。結果判定：以每株菌接種後的培養基不得少於2管呈現生長，即該培養基的靈敏度檢查符合要求。5.4.2配製的培養基應在涼暗處保存，一般不得超過2周，臨用前細菌和黴菌培養基分別經30-35℃和20-25℃培養不少於48小時和72小時，證明無菌生長後方可使用。5.4.3需氣菌、厭氣菌培養基在試管中裝量高度不得少於7Cm，其指示劑氧化層不得超過培養基深度的1／5，否則須經水浴煮沸10分鍾，但只限加熱一次。 第5頁/共7頁無菌試驗培養時間結束時，指示劑氧化層應不超過培養基深度的1／2。5.5對照用菌液的制備：5.5.1試驗用菌種、菌種的復甦、菌種的接種與保存等均應按照「抗生素微生物檢定法」標准操作規程項下操作。5.5.2金黃色葡萄球菌菌液用接種環取金黃色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus CMCC（B）26003]的營養瓊脂斜面新鮮培養物少許，接種至營養肉湯培養基內，在30-35℃培養16-18小時後，用滅菌生理鹽水稀釋成1:1065.5.3生孢梭菌菌液用接種環取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需氣菌、厭氣菌培養基新鮮培養物1白金耳，接種至相同培養基內，在30-35℃培養18-24小時後，用滅菌生理鹽水稀釋成1:106。5.5.4白色念珠菌菌液用接種環取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳，接種至真菌培養基內，在20-25℃培養24小時後，用滅菌生理鹽水稀釋成1:105。5.5.5上述制備的菌液，一般當日使用。5.6進入無菌室的操作要點：5.6.1根據試驗程序,將用具物品搬入緩沖間,打開紫外光燈和空氣過濾裝置並使其工作1小時以上。5.6.2操作人員用肥皂水刷洗雙手,關閉緩沖間紫外光燈,進入緩沖間內,關閉第一層門,用2%來蘇爾或0.1%新潔爾滅溶液洗雙手,用消毒毛巾擦乾,換上無菌衣、帽、口罩及消毒鞋。5.6.3關閉無菌室內紫外光燈，進入第二層門並將用具搬至無菌室內，關閉無菌室門。5.6.4凡進入無菌室後不應再外出取物品，因此，在每次試驗中所用物品必須計劃好，並准備好備用物品。從進入第一層門直至無菌室內，隨操作人員的進入應噴霧2%來蘇爾或0.1 %新潔爾滅溶液。5.7檢查法：5.7.1無菌檢查法包括：直接接種法和薄膜過濾法。前者適用於非抗菌作用的供試品；後者適用於有抗菌作用的或大容量的供試品。5.7.2操作時，應先用0.1%新潔爾滅浸泡或擦拭容器表面後，以無菌的方法取 第6頁/共7頁內容物。5.7.3凡無菌檢查中，均應取相應溶劑和稀釋劑同法操作，作陰性對照。5.7.4供試品制備： 用滅菌鑷取出注射器，在火焰旁將針芯插入針管並安上針頭，蓋為橡皮塞時，用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取葯液。按規定須稀釋或滅活的供試品，可直接或將瓶內供試液抽出至滅菌玻璃容器內進行滅活處理並稀釋至規定的體積和濃度；抽取瓶中內容液體時，應將供試品倒置並使針頭在液面下。5.7.5直接接種法：按規定量取供試品，以無菌操作將該供試品分別接種於需氣菌、厭氣菌培養基6管，其中1管接種金黃色葡萄球菌液1ml，作陽性對照，另接種於真菌培養基5管。輕輕搖動，使供試品與培養基混合。需氣菌、厭氣菌培養基管置30-35℃、真菌培養基管置20-25℃培養7日。在培養期間應逐日觀察並記錄是否有菌生長。陽性對照管在24小時內應有菌生長，如在加入供試品後，培養基出現渾濁，培養7天後，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中或斜面培養基上繼續培養，細菌培養2日，真菌培養3日，觀察是否再出現渾濁或斜面有無菌生長，或用接種環取培養液塗片，染色，用顯微鏡觀察是否有菌。5.7.6薄膜過濾法： 將微孔濾膜過濾裝置、抽濾瓶、排氣管與真空泵相連，真空泵可置無菌室外。取規定量供試品，按規定的方法處理後，加入0.9%無菌氯化鈉溶液100ml中，混合後，通過裝有孔徑不大於0.45μm 的薄膜過濾器，減壓抽干後，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次，每次至少100ml，取出濾膜分成3等份，分別加入上述二種培養基中，按規定溫度和時間培養。陽性對照管應根據供試品特性加入相應對照菌液1ml（抗細菌葯物，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗厭氧菌葯物，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌葯物，以白色念珠菌為對照菌）。陽性對照管細菌應在培養24-48小時，真菌應在培養24-72小時有菌生長。5.8結果判斷： 第7頁/共7頁當陽性對照管顯渾濁並確有菌生長，陰性對照管呈陰性時，可根據觀察所得的結果判定：如需氣菌、厭氣菌及真菌培養基管均為澄清或雖渾濁但經證明並非有菌生長，均應判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及真菌培養基管中任何1管顯渾濁並確證有菌生長，應重新取2倍量供試品，分別依法復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應判為供試品不合格。6 培訓6.1 培訓對象：化驗員。6.2 培訓時間：二小時。7 記錄 記錄名稱 保存部門 保存時間 無菌檢驗記錄 質監科 葯品有效期後一年 QF-01-007-00無 菌 檢 驗 記 錄品 名： 批 號： 規 格： 檢驗日期： 年 月 日培養基名稱需氣、厭氣菌培養基真菌培養基培養培養溫度30—35℃20—25℃培養時間管 號1234512345培養天數及結果1234567結 論備 注 復核人： 檢驗人：

G. 無菌檢查薄膜過濾器需要用0.22um濾膜嗎

1、滅菌方法
培養基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22um微孔濾膜過濾除菌。與過濾相比，高壓滅菌的工作強度小，成本較低，但易造成營養成分的流失，而且在多次加樣（無菌谷氨醯胺溶液，無菌碳酸氫鈉溶液等）過程中容易造成二次污染。大多數培養基採用0.1～0.2μm孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌，並且已成為培養基除菌的發展方向，它可低限度地減少培養基的營養損失。
1.1 高壓滅菌

某些培養基（如MEM）可進行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養基中的MD605、MD609等。這類培養基一般不含有L-谷氨醯胺和碳酸氫鈉，一般是在培養基高壓滅菌後加入L-谷氨醯胺和碳酸氫鈉的無菌的液體。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨醯-L-谷氨醯胺）可代替L-谷氨醯胺。
可高壓滅菌的培養基在121℃、15psi，15分鍾的條件下完全可達到滅菌效果及營養成分的最小損失，不需將滅菌時間延長。為保證高壓滅菌的效果，滅菌設備的驗證很關鍵。
1.2 過濾滅菌
可供過濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone（PES）、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。一般情況下採取正壓過濾，正壓過濾較之負壓過濾具有流速高、過濾快、不易污染，可避免蛋白質產生大量氣泡等優點。一般使用過濾器可參照各供應商的產品說明書。
目前大多數實驗室和制採用微孔濾膜濾器（如Zeiss濾器）或立式微孔濾器（Millipore、Pall）除菌。微孔濾膜濾器為不銹鋼，中間可夾放0.22um濾膜。使用這種濾器最重要步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。如在使用Zeiss濾器時，先要用培養用水將濾膜充分潤濕，在安裝濾膜時可在其上放置一層定性濾紙再固定。消毒時旋鈕不要扭太緊，凡與空氣接觸部位都要包好（可用牛皮紙、紗布、無紡布等）；高壓滅菌後，在無菌環境中立即將旋鈕扭緊。過濾除菌結束後，要打開濾器，檢查濾膜是否完整，如果濾膜破裂，需重新進行過濾除菌過程。立式微孔濾器可以選用不同的微孔濾柱體積，因為濾膜的折疊，膜面積顯著增大，液體處理量大，而且不容易發生堵塞現象。

H. 生物製品的無菌檢查法的實驗原理，准備工作及操作步驟

文獻資料 - 醫學書籍 - 中國生物製品規程
生物製品無菌試驗規程

生物製品不得含有雜菌（有專門規定者除外），滅活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。在製造過程中應由製造部門按各製品製造及檢定規程規定進行無菌試驗，分裝後的製品須經質量檢定部門做最後檢定。各種生物製品的無菌試驗除有專門規定者外，均應按照本規程的規定進行。

1抽樣

1.1原液及半成品

原液及半成品應每瓶分別進行無菌試驗，其抽樣量應至少為0.1%，但不得少於1.0ml。

1.1.1大罐稀釋的製品抽樣數量不得少於10ml。

1.1.2原液及半成品每開瓶一次，應如上法抽驗。

1.2成品

每亞批均應進行無菌試驗，樣品應隨機抽取，應具有代表性（包括分裝過程的前、中、後樣品）。

1.2.1分裝量在100支（瓶）或以下者抽檢不少於5支，101～500支（瓶）者抽檢不少於10支（瓶），501～10000支（瓶）者抽檢不少於20支（瓶，10001支（瓶）以上者抽檢40支（瓶）。

1.2.2每瓶裝量20ml以上的凍干血液製品，每櫃凍干200瓶以下者抽檢2瓶，200瓶及以上者抽檢4瓶。6～20ml抽檢量加倍。5ml和5ml以下者按1.2.1項抽檢。

1.3凡規定需作支原體檢查的製品，均應在半成品時按亞批進行檢查，成品可不再做。

2無菌試驗用培養基（培養基處方可附錄1）

2.1檢查製品中本菌是否存活應採用適於本菌發育生長的培養基（在半成品時檢查，有專門規定者除外）。

2.2檢查需氧性和厭氧性雜菌應採用硫乙醇酸鹽培養基。檢查不含汞類防腐劑製品中的需氧性和厭氧性雜菌時，該培養基中可不加硫乙醇酸鹽。

檢查黴菌和腐生菌應採用改良馬丁培養基。

檢查混濁製品可採用不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基。檢查活菌苗時可加大瓊脂含量，做成斜面。

2.3檢查支原體應採用豬胃消化液半固體或牛心消化液半固體培養基。

2.4生物製品無菌試驗用培養基亦可用經檢定合格的乾燥培養基配製。

2.5無菌試驗培養基的靈敏度，乙型溶血性鏈球菌（32210株）應達到10-8，短芽胞桿菌（7316株）和生孢子梭狀芽胞桿菌（64941株）應達到10-7，白色念珠菌（ATCc 10231）和臘葉芽枝霉應達到10-6。

2.6生物製品無菌試驗培養基由質量檢定部門與培養基製造部門會同進行靈敏度試驗。每當更換主要原材料時，應進行靈敏度試驗，合格後方可應用（靈敏度試驗法見附錄2、3）。

2.7各生產單位的質量檢定部門應定期抽檢無菌試驗培養基的靈敏度，檢定所應定期抽檢各所的無菌試驗培養基。

3無菌試驗方法

3.1無菌試驗取樣、移種等全部操作，應在無菌操作室內或無菌條件下進行，無菌操作室應經常保持清潔，在每次操作前，應徹底消毒。

3.2菌苗、疫苗、類毒素、抗毒素類製品及粘稠不易過濾的血液製品應用直接接種法進行無菌試驗。人白蛋白及人丙種球蛋白（包括各種劑型及應用途徑的製品）應用薄膜過濾法進行無菌試驗，其他血液製品亦可用薄膜過濾法或直接接種法進行。

3.3直接接種法

3.3.1菌苗、疫苗、類毒素、抗毒素類製品

3.3.1.1每安瓿裝量5.0ml以上者（不含5.0ml）取樣不應少於1.0ml，裝量在5.0ml以下者（含5.0ml）取樣不得少於0.5ml，裝量不足0.5ml者，全部吸取。

3.3.1.2含防腐劑的製品，接種量與培養基的比例：用苯酚或氯仿作防腐劑者至少為1:20，用汞作防腐劑者或製品內含有甲醛、抗生素者至少為1:50。先按此比例接種於硫乙醇酸鹽培養基內增菌，於20～25℃培育3～4天後移種至硫乙醇酸鹽培養基、適宜的瓊脂斜面、改良馬丁培養基各2管，每管0.5ml。將硫乙醇酸鹽培養基、適宜的瓊脂斜面各1管置30～35℃培育，其餘各管置20～25℃培育，培育時間除有專門規定者外共為8天。

3.3.1.3不含防腐劑製品，裝量在5.0ml以下者（包括5.0ml）每10支安瓿混合，裝量在5.0ml以上者每7支安瓿混合，將混合後的樣品直接接種一組培養基，分別置20～25℃、30～35℃培育，培育時間共為8天。

作者：天使也美麗 2006-2-24 16:39 回復此發言

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2 生物製品無菌試驗規程

3.3.1.4支原體培養基臨用時將半固體煮沸10～15分鍾後，冷卻到56℃左右，加入未滅能馬血清或滅能小牛血清和酵母浸液（培養基、血清、酵母浸液之比為7:2:1），並可酌情加入適量青黴素或醋酸鉈，充分搖勻，等冷至35～37℃時種入待檢樣品0.5～1.0ml，共接種2支培養基，置35～37℃培育14天。

3.3.1.5 混濁和接種後不能判定結果的製品，可取規定量的樣品接種於不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基（200ml）內進行增菌培養，3～4天後移種。培養基種類和支數、培育溫度同3.3.1.2項，共培育8天後判定結果。

3.3.2血液製品

3.3.2.1取規定抽樣數，按下列規定，從每瓶抽取樣品，並全部接種完。

樣品每瓶裝量不足1.0ml者，抽取全量，1～20ml以下者（不含20ml），抽取1.0ml以上，每支裝量為15ml的培養基，接種1.0ml。

樣品每瓶裝量以下者（不含）抽取5.0ml以上,100ml及以上者按15%抽樣，每支裝量為40ml的培養基，接種5.0ml。

應接種的培養基支數依取樣的總量而定。接種硫乙醇酸鹽培養基與改良馬丁培養基支數之比為2:1。

接種後將硫乙醇酸鹽培養基總支數的1/2置30～35℃培育，其餘置20～25℃培育，改良馬丁培養基置20～25℃培育，培育時間不少於14天。

3.4薄膜過濾法

濾膜孔徑為0.22～0.3μm。

取規定抽檢樣品數，每瓶裝量100ml及100ml以下者取全量，100ml以上者取半量加入滅菌薄膜過濾器內，加壓或減壓過濾。如為含汞防腐劑者，在樣品過濾後，應用滅菌生理鹽水或其他適宜溶劑沖洗濾膜3次，每次100ml。過濾後，無菌取出濾膜，分別放入硫乙醇酸鹽培養基2支及改良馬丁培養基1支（每支裝量不少於40ml，高度不得低於7cm）。如果使用一個過濾裝置，則將該膜剪成三等分，分別放入規定培養基中。將濾膜放入培養基後，一支硫乙醇酸鹽培養基置30～35℃培育，其餘各支培養基置20～25℃培育。培育時間不少於7天。

最好採用全封閉式一次性微孔過濾集菌器，要求每支培養器培養裝量為100ml。

3.5檢查厭氧性雜菌用培養基需加熱驅氧者，必須冷卻到45℃以下再行接種。

3.6凍干製品按使用說明書或瓶簽規定的稀釋量稀釋後進行無菌試驗。

4判定

4.1無雜菌生長判為合格（有專門規定者除外）。

4.2無菌試驗發現雜菌生長，可復試。該製品量應加倍。若復試仍有同樣雜菌生長，該製品判為不合格。如為不同雜菌生長，可第二次復試，復試樣品為第一次復試量的2倍，若仍有雜菌生長該製品判為不合格。支原體陽性者不復試，該批製品判為不合格。

4.3成品無菌試驗不合格的亞批數占整批的30%以上時，由質量檢定部門會同有關部門根據具體情況，全部或部分廢棄。

附錄 1無菌試驗培養基處方

1硫乙醇酸鹽培養基

胰酪蛋白腖（或酪素胰酶消化液，以總氮計2000mg） 15g
酵母浸出粉（或酵母透析液200ml） 5g
葡萄糖
5g

氯化鈉
2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸鹽酸鹽）
0.5g

硫乙醇酸鈉（或硫乙醇酸0.6ml）
0.5g

瓊脂
0.65～0.75g

新鮮配製的0.1%刃天青溶液（或0.2%美藍溶液0.5ml）
1.0ml

去離子水（或蒸餾水）
加至1000ml

最後pH7.1±0.2

2硫乙醇酸鹽培養基（不含瓊脂）

胰酪蛋白腖（或酪素胰酶消化液，以總氮計2000mg）
15g

酵母浸出粉（或酵母透析液200ml）
5g

葡萄糖
5g

氯化鈉
2.5g

L-胱氨酸（或半胱氨酸鹽酸鹽）
0.5g

硫乙醇酸鈉（或硫乙醇酸0.6ml）
0.5g

去離子水（或蒸餾水）
加至1000ml

最後pH7.1±0.2

3 改良馬丁培養基

葡萄糖
20g

蛋白腖
5g

酵母浸出粉（或酵母透析液100ml） 2g

磷酸氫二鉀
1g

硫酸鎂（含7分子結晶水）
0.5g

去離子水（或蒸餾水）

I. 純化水取樣後多長時間內檢驗微生物

您的意思應該是說在純化水微生物限度測試的取樣中，是不是必須在潔凈區的取樣口進行。其實這種說法是錯誤的，主要是你取樣的合法性，一般我們都按檢驗檢測取樣規程來操作，無菌瓶取樣就可以了。
薄膜過濾法,計數,每1ml純化水不得過100個,具體方法：
1、大腸菌群的檢查：取含培養基10
ml的乳糖膽鹽發酵管若干支,分別加入供試水樣1 ml.另取乳糖膽鹽發酵培養基管1支加1ml洗液為陰性對照組,於36±1℃培養18～24
h.陰性對照應無菌生長.供試品乳糖膽鹽發酵管若無菌生長,或有菌生長但不產酸產氣或產酸不產氣,判該管未檢出大腸菌群.
2、黴菌及酵母菌計數：純化水取水樣1ml,均做平行,並做陰性對照,經直徑為50 mm、孔徑0.45μm 的薄膜過濾器過濾,小心取出濾膜,菌面向上貼於玫瑰紅鈉培養基平板上,將培養皿倒置於培養箱中,於23～28℃培養5天（可延長到7天）,菌落計數；
細菌計數：純化水取水樣1 ml,並做陰性對照,經直徑為50 mm、孔徑0.45μm 的薄膜過濾器過濾,小心取出濾膜,菌面向上貼於營養瓊脂培養基平板上,將培養皿倒置於培養箱中,於30～35℃培養72 h,菌落計數
3、判定標准：純化水每片濾膜上微生物菌落總數不超過100 cfu,不得檢出大腸菌群

J. 微生物薄膜過濾法，夾膜技巧

（1）驗證試驗方法：試驗原理同前述薄膜過濾法。驗證供試品對薄膜過濾法有抑細菌和抑真菌特性時，與實際的無菌檢查相同，在同一型號的每個過濾器或過濾筒內過濾規定定量的供試品（容器數及每容器的過濾體積），用淋洗液淋洗濾膜至少3次，每次淋洗液體積為100ml，在最後一次淋洗液中，接入驗證用菌種（接種量為10—100CFU）；另取一過濾器或濾筒，不過濾供試品，重復以上淋洗操作，作為陽性對照。根據具體情況，可將整張濾膜或半張濾膜轉移至100ml的指定驗證用培養基內，或將培養基加入到裝有濾膜的濾筒內。分別對表中所列菌種及相應的培養基逐一進行驗證，並將容器置於適當的溫度下培養，培養時間不超過14d。如果使用新的濾膜或濾過器（包括不同廠家或批號、型號），則要按上述薄膜過濾法的要求做 , 組試驗，即樣品試驗組、蛋白腖對照組和陽性對照組重新進行驗證確認。
（2）驗證結果評價：如果供試品培養基容器內的培養基內明顯可見微生物生長（混濁），並且與陽性對照容器內的培養結果相似，則在無菌檢查試驗中必須要過濾與驗證試驗相等量的供試品、淋洗液，淋洗相同次數及使用同量的培養基。如果與陽性對照容器內的培養結果相比，供試品容器內微生物生長現象不明顯，則說明該檢驗量在此檢驗條件下有抑菌作用。應增加淋洗次數，重復以上實驗。也可通過更換過濾膜並使用中和劑來消除產品的抑菌作用。USP規定，如果已淋洗了5次，並且每次淋洗液體積達到500ml，仍無法中和膜上的殘余抑菌性物質，那麼在無菌檢查試驗中就採用此淋洗次數與淋洗量作為最終淋洗方法。