『壹』 如何進行蛋白超濾設備選型
如何進行蛋白超濾設備選型？在分離分析特別是蛋白質分離分析中，層析是相當重要、且相當常見的一種技術，其原理較為復雜，對人員的要求相對較高，這里只能做一個相對簡單的介紹。
一、 吸附層析
1、 吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、 薄層層析
薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。
3、 聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。
二、 離子交換層析
離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。`
三、 凝膠過濾
凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
四、 親和層析
親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的廢物(S')才能和一定的酶(E)結合，產生復合物(E－S')一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，並產生復合物。而親和層析與酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體(類似底物)是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L(對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等)以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M(如活化瓊脂糖等)上，製成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把圍相載體裝人小層析柱(幾毫升到幾十毫升床體積)後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，並形成了第一個層析峰。然後，恰當地改變起始緩沖 液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個層析峰(見圖6－2)。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力(其大小有差異)時，採用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後，可以重復使用。
上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質(如抗體、受體和酶的類似底物等)，它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質(如金屬、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度。
五、 聚焦層析
聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為 多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。
聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子 劑進行層析時，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室(這層析柱者)中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然後打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94(作固定相)時，先用起始緩沖液(配方見表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多緩沖劑物質(作流動相)的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內每點的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，PH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降至6，並最後恆定於此值，這時層析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白質的行為
蛋白質所帶電荷取決於它的等電點(PI)和層析柱中的PH值。當柱中的PH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH 再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。
供靜脈注射的25%人胎盤血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸銨鹽析法、透析脫鹽、真空濃縮等工藝制備的，該工藝流程硫酸銨耗量大，能源消耗多，操作時間長，透析過程易產生污染。改用超濾工藝後，平均回收率可達97.18%；吸附損失為1.69%；透過損失為1.23%；截留率為98.77%。大幅度提高了白蛋白的產量和質量，每年可節省硫酸銨6.2噸，自來水16000噸。目前國外生產超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國的Milipore公司和德國的Sartorius公司。
隨著現代生物技術的發展, 通過基因工程生產蛋白質葯物在治療人類面臨的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潛力. 為滿足生物技術產品工業化生產的需要, 開發高通量、低成本、高效的分離純化方法已引起人們的高度關注. 超濾技術由於具有通量高, 操作條件溫和, 易於放大等特點, 特別適合生物活性大分子的分離. 在生物技術領域, 超濾技術目前已廣泛應用於細胞收集分離、除菌消毒、緩沖液置換、分級( fract ionatio n) 、脫鹽及濃縮[ 1] . 近年來越來越多的研究表明, 通過選擇適當的膜或膜表面改性,以及對分離過程進行優化, 充分利用和調控膜—蛋白質以及蛋白質—蛋白質之間的靜電相互作用, 可以實現分子量相近的兩種蛋白質的高選擇性超濾分離[2- 7] .
為克服常規蛋白質超濾分離過程優化中存在的實驗蛋白質消耗多、工作量大、費時以及費用高等缺點, 我們相繼開發了脈沖進樣技術( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和參數連續變化超濾技術( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 並以此為基礎, 結合載體相超濾技術( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]進一步提出了一種蛋白質超濾分離快速優化新方法[11], 實現了人血漿白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化單克隆抗體( A lemtuzumab) 單體— 二聚體[13]的超濾分離過程快速優化和高選擇性分離,並在膜的篩選及其適用性快速評估方面展現出巨大的潛力. 該方法的主要特徵是與AKTA Prime 系統聯用, 採用脈動進樣技術顯著減少了蛋白質的用量;而利用雙緩沖體系( 類似梯度洗脫) 的參數連續變化超濾技術, 在pH 或離子強度連續變化的情況下考查pH 或離子強度對蛋白質透過率或截留率的影響, 進一步縮短了實驗時間, 降低了蛋白質的用量,極大地減少了實驗量, 加快了過程優化進程; 另外,載體相超濾技術的應用則可保證超濾分離自始至終在設定的條件下進行, 從而最大限度地保證超濾過程的穩定性.
2012-02-25
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『貳』 蛋白用超濾管濃縮容易沉澱怎麼辦
可能是抄這個蛋白的水溶性較差，也就是只能保持在一定濃度不能太高
另外就和這個蛋白的穩定性有關了，超濾時保持低溫，體積縮小一點後就把濾液混勻避免局部濃度過高，選擇更合適的緩沖液，添加一點甘油等小分子物質等都可以增加蛋白的穩定性。
『叄』 色譜純化蛋白質之前為什麼要進行緩沖液置換
蛋白酶是有活性的特殊蛋白質，我們對它進行透析是為了獲得更純的蛋白酶。做實驗時考慮到酶的特殊性質——容易變性，所以要用酸鹼度和溫度甚至離子濃度都比較適應的透析液。以免蛋白酶變性，透析後的酶喪失活性。
『肆』 tca 沉澱蛋白 最後蛋白沉澱加上樣緩沖液不溶解怎麼辦
將蛋白樣品稀釋之後再加上樣緩沖液就能溶解了。
『伍』 提純的蛋白出現沉澱影響做western blot嗎
不影響，因為你加了上樣緩沖液後一般在煮沸後離心的
『陸』 用萬金油緩沖液純化蛋白要不要復性
問錯地方了.這么專業的生物知識,最好去搜索文獻.關於包涵體的文獻太多了.基本上做蛋白的都有涉及.不要在這問,自己多下載一些文獻,比這里的回答強的多.簡單找了點.1.對於尿素和鹽酸胍該怎麼選擇?尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑,易經透析和超濾除去.它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用,所需濃度尿素8-10M,鹽酸胍6-8M.尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱,溶解度為70-90%,尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽,對重組蛋白質的氨基進行共價修飾,但用尿素溶解具有不電離,呈中性,成本低,蛋白質復性後除去不會造成大量蛋白質沉澱以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優點,故目前已被廣泛採用.鹽酸胍溶解能力達95%以上,且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾.但它也有成本高、在酸性條件下易產生沉澱、復性後除去可能造成大量蛋白質沉澱和對蛋白質離子交換色譜有干擾等缺點.2.怎樣洗滌包涵體?通常的洗滌方法一般是洗不幹凈的,可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分,過濾除去未溶解的物質,注意留樣跑電泳,然後用水稀釋到4M,離心把沉澱和上清分別跑電泳,如此類推可以一直稀釋到合適的濃度,可以找到一個合適去除雜質的法,其實這就是梯度沉澱的方法,比通常的直接洗脫效果好.3.8M尿素溶解的包涵體溶液應如何保存?在4度放置半個月,都沒什麼問題.在室溫放置超過48小時,可能會對目的蛋白有影響,因為尿素在鹼性條件下可使一些氨基酸醯基化,所以早些處理BI溶液比較好.4.包涵體復性有什麼原則?低濃度,平緩梯度,低溫.5.復性時的蛋白濃度是?一般使用濃度為0.1-1mg/ml,太高的濃度容易形成聚體沉澱,太低的濃度不經濟,而且很多蛋白在低濃度時不穩定,很容易變性.6.復性中蛋白析出是怎麼回事?該怎麼處理?出現蛋白析出,肯定是條件變化太劇烈了.復性應該採取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法,例如根據包涵體的溶液成分,每隔1個PH或濃度值配置一種溶液,逐步透析到正常.此外透析時必須濃度極低,條件溫和,使蛋白質能夠正確折疊.但是復性的比率應該很低.若加變性劑尿素可加到2M,鹽酸胍可加到1-1.5M；另外可將甘油濃度增加,范圍可在≤30%,且在復性樣品中也可加適量甘油.
『柒』 蛋白提純時拿緩沖液洗雜蛋白總也洗不完，有很長的拖尾是怎麼回事
拖尾"現象是電泳中最常見的現象.這常常是由於樣品溶解不佳引起的,克服的辦法是在加樣前離心,選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液,加增溶輔助試劑.另一方法是降低凝膠濃度。
『捌』 怎樣把溶解蛋白質的緩沖液換成另一種蛋白緩沖液
不可以通用。
蛋白質上樣緩沖液中的SDS和DTT分別可以屏蔽蛋白質電荷以及破壞二硫鍵，避免形成多聚體。
DNA上樣緩沖液主要是起沉降和指示作用，不可用於蛋白，否則會影響蛋白相對分子量定量。
同樣蛋白上樣緩沖液中的tris-HCl濃度過高也會使溴酚藍條帶扭曲。
『玖』 細胞破碎後，，用緩沖液提取蛋白質，用什麼方法能得到蛋白質溶液而不含那些沉澱物！（離心後有雜質！）
不知道你指的是動物細胞還是植物細胞，進行植物蛋白提取時，通常用的方法是TCA/丙酮法，即液氮破碎細胞---將粉末溶於TCA\丙酮緩沖液---然後加入蛋白酶抑制劑---離心後，得到的沉澱中包含蛋白還有細胞壁碎片等雜質，----然後加入丙酮溶液反復洗滌-----再加入蛋白裂解液（成分是尿素，硫脲，還要蛋白酶抑制劑等），該裂解液作用是將蛋白溶解----再次離心---此時沉澱中含有的蛋白已經很少，而上清中含有的多是蛋白，核酸及多糖---再加入適當體積的核酸酶除去核酸--最後上清中得到的多是蛋白。
至於樓主說的離心後沉澱不穩，是不是因為離心g和時間還不夠,可以嘗試一下改變條件，我們用的是20000g以上離心半小時。
『拾』 什麼叫透析法純化蛋白質為什麼要用緩沖液
透析是利用半透性膜將待純化蛋白質包裹，沉浸在緩沖液中；
由於緩沖液濃度低於膜內部的濃度，因此在半透膜上會發生物質交換；
但蛋白質不能通過半透膜，只有鹽離子等小分子物質可以通過；
因此，待純化蛋白質中的鹽雜質就通過半透膜交換到外面了。
使用緩沖液有兩個原因，一是不用緩沖液蛋白質可能會變性；二是因為在以後的使用過程中都會使用緩沖液，因此緩沖液對於蛋白質本身來說不是雜質。