超濾血清

① 抗血清純化都需要些什麼設備阿

給你提供一個馬血清制備過程，專利CN200510026317.3

1、一種馬抗血清的制備純化工藝，該工藝包括下述步驟： (1)消化步驟：用免疫血漿消化工藝將免疫血漿消化； (2)第一次沉澱過濾處理步驟：將上述處理的消化液中加入硫酸銨形成混懸液，並調節pH值為4.8-5.2，然後將混懸液加溫並保持，再降溫，過濾收集上清液，廢棄沉澱； (3)第二次沉澱過濾處理步驟：將上述(2)步的上述清液pH值調整為7.0-7.4，加入硫酸銨進行第二次沉澱，靜置後過濾取沉澱物，棄上清液； (4)明礬沉澱：即將上述(3)步的沉澱物稀釋至蛋白含量不超過2g/L，再調整稀釋液pH值為7.7-7.9，加明礬進行沉澱，靜置後過濾取上清液，沉澱物廢棄； (5)將上述上清液用硫酸銨沉澱法或超濾法濃縮製得抗血清原液； (6)離子交換劑吸附純化： 1)用陰離子交換劑裝柱，用pH值為7.0±0.2，0.15MNaCl，10mM磷酸鹽緩沖液進行平衡； 2)將用0.45μm的膜進行澄清過濾的抗血清原液通過上樣泵加入柱體上部，用 pH值為7.0±0.2，0.15MNaCl，10mM磷酸鹽緩沖液洗柱，流速為3ml/min，收集穿透液，酸性雜質被吸附在層析介質上，F(ab)2流穿； 3)用2MNaCl清洗柱體後，用20％乙醇洗柱，使介質浸泡其中保存； 4)將穿透液超濾濃縮調整抗血清濃度，調整蛋白含量不超過170g/L，按調整後製品總量，加氯化鈉使最終含量為750-950g/L，加三氯甲烷使最終含量不超過5g/L 或硫柳汞0.1g/L或間甲酚2.5g/L為防腐劑，調節pH至6.0-7.0，用0.22um濾膜除菌過濾。

② 超濾原理的超濾應用

超濾（Ultrafiltration）技術是一來種膜濾自法，也有錯流過濾（Cross Filtration）之稱。它能從周圍含有微粒的介質中分離出10~100A的微粒，這個尺寸范圍內的微粒，通常是指液體內的溶質。其基本原理是在常溫下以一定壓力和流量，利用不對稱微孔結構和半透膜介質，依靠膜兩側的壓力差作為推動力，以錯流方式進行過濾，使溶劑及小分子物質通過，大分子物質和微粒子如蛋白質、水溶性高聚物、細菌等被濾膜阻留，從而達到分離、分級、純化、濃縮目的的一種新型膜分離技術。

③ 單純超濾的注意事項

（一） 患者血細復胞比容（制Hct）水平越高，越容易在單純超濾過程中因血液濃縮、血液粘度上升而使血流阻力增加。因此對於Hct 較高的患者，應適當增加抗凝葯物的劑量。
（二） 患者血清白蛋白水平越高，單純超濾過程中血清蛋白成份越容易黏附於濾器膜上，而影響超濾效果；若血清白蛋白水平過低，血漿膠體滲透壓下降，可以導致單純超濾過程中患者組織間隙中的水分迴流入血減少，血管再充盈不足，容易發生低血壓而難以完成超濾目標，此類患者在單純超濾過程中是否補充血清白蛋白制劑，應依據臨床實際情況做出判斷。
（三） 溫度過低將增加血液粘度，影響超濾效果。因此，單純超濾過程中應注意給患者保溫。
（四） 單純超濾過程中，血液中電解質成份將隨水分等比例清除，因此超濾結束後患者體內各種電解質的總量、尤其是鈉離子總量將降低；而超濾引起的有效循環血容量的下降，將刺激交感神經興奮，促使鉀離子從細胞內移向細胞外，因此，超濾結束後患者血清鉀水平可能升高。
（五） 選擇高通量濾器，有助於完成目標超濾量；但超濾過程中氨基酸等營養物質的丟失也會因此而增多。

④ 超濾膜以什麼為截流指標

超濾膜的3項標准中，關於截留性能的測試，都採用標准HY/T050—1999的方法。在該標版准中，權規定用於超濾膜截留性能的測量的基準物質為以下幾種：聚乙二醇(分子質量為6000、10000、20000u)；細胞色素C(分子質量為13000u)；卵清蛋白(分子質量為45000u)；牛血清蛋白(分子質量為67000u)。

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⑤ 全血分離獲得血清的方法及步驟 謝謝

材料與方法

1.1 血清採集 MG患者全血來自～2005年就診於遼寧中醫學院附屬醫院的門診患者。根據典型臨床表現、新斯的明試驗、低頻重復電刺激及單纖維肌電圖等確診，無其他自身免疫性疾病，未經其他免疫抑制治療，並參照1994年版《中醫病證診斷療效標准》辨證為脾腎虛型。正常人血清取自同時期健康志願者。-70 ℃冰箱冷凍保存備用。

1.2 主要試劑 固相pH梯度干膠條IPG strip（Amersham公司產品， 非線性pH 3～10， 7 cm）。3-〔3-（膽醯胺基丙基）二甲氨基〕丙磺酸鹽｛3-〔（3-cholamidopropyl） dimethylamino〕-1-propanesul-fonate， CHAPS｝，二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol， DTT），三丁基膦（tributyl phosphine， TBP），尿素，硫脲，碘乙醯胺（iodoacetamide， IAA），丙烯醯胺（acrylamide）、甲雙丙烯醯胺（N， N'-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N， N， N， N-tetram-ethyl-ethylenediamine， TEMED），過硫醯胺（am-monium persulfate， APS），三羥甲基氨基甲烷〔tris （hydroxymethyl） aminomethane〕、甘氨酸（glycine， Gly）和十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）均為Bio-Rad公司產品。瓊脂糖為華美生物公司產品。其他試劑均使用國產分析純試劑。所有溶液均用MilliQ水配製。

1.3 主要儀器 高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司產品;EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司產品;P-2000分光光度儀，Hitachi公司產品;SE-600電泳儀，Amersham公司產品;純水裝置，Millipore公司產品;GS-710光密度掃描儀，Bio-Rad公司產品;冷卻水循環系統，Cole-Parmer公司產品;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美國Bruker-Daltonics公司產品;LCQ Deca XP Plus，美國Thermo Finnigan公司產品。

1.4 雙向電泳

1.4.1 血清總蛋白質的提取及定量 血清-70 ℃反復凍融4次後，用Agilent Multiple Affinity Re-moval Column處理去除高豐度蛋白。使用Agilent 5K超濾管進行濃縮除鹽，凍干回收的樣品，-70 ℃保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和cocktail酶抑制劑）進行復溶，並採用考馬斯亮藍法進行蛋白質定量。

1.4.2 等電聚焦 自-20 ℃取出的膠條，室溫下平衡10 min，以500 μg上樣量在每份樣本中加入上樣緩沖液（8 mol/L尿素、2% CHAPS、1% Bio-lyte和1% TBP）以及標准蛋白質分子，上樣於泡脹槽中，加入礦物油覆蓋。程序設置如下:30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h。恆溫20 ℃。等電聚焦電泳後IPG膠條在平衡液1（Tris-base 50 mol/L 、尿素 6 mol/L、甘油 30%、SDS 2%、溴酚藍0.002%和DTT 100 mg）中於振盪器上振盪 15 min; 然後置入平衡液2（成分同平衡液1，用 400 mg 碘乙醯胺代替100 mg DTT）同樣於振盪器上振盪15 min。

1.4.3 SDS-PAGE垂直電泳 採用12.5%的均勻SDS2聚丙烯醯胺凝膠（水23.2 ml，30%丙烯醯胺溶液32.46 ml，1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液pH 8.8 20 ml，10% SDS 0.8 ml，10% APS 0.4 ml，TEMED 3.76 μl，膠總體積80 ml）。將平衡後的IPG膠條移至凝膠的上方，膠條一端放入低分子量蛋白質標准，0.5%的瓊脂糖封膠。上下槽加入電極緩沖液（Tris 5 mmol/L，Gly 192 mmol/L和SDS 0.1%）。初始電流為每塊膠40 mA，電泳20 min，然後以每塊膠60 mA電流，直至溴酚藍前沿。

1.4.4 銀染色 電泳結束後，採用硝酸銀染色法，通過固定，硝酸銀染色，顯影，停顯及脫色，至背景清晰。

1.5 圖像分析 每個樣品常規進行3次二維電泳，用GS-710光密度掃描儀對電泳後的膠圖分別進行掃描，所得掃描圖像輸入計算機，採用Image-master軟體對圖像進行背景消減、蛋白質點檢測和校正，獲取蛋白質點的位置坐標和表達量等分析。選取 Ratio ≥1.5的蛋白質點認為有差異。所有數據的統計分析均採用SPSS 12.0軟體，統計學分析採用 t 檢驗。

1.6 基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜分析 用手術刀片切下膠上目標條帶，進行切膠、膠上胰蛋白酶酶解 20 h ，抽提酶解肽段，Zip Tip脫鹽後點樣，行基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）分析（飛行管長2.7 m，加速電壓 20 kV ，反射電壓23 kV）。將第1級質譜得到的肽片段質量指紋圖譜、肽質量指紋圖譜與第2級質譜得到的肽序列信息一起用來檢索蛋白質資料庫，找出匹配的蛋白質。

1.7 資料庫檢索 將質譜鑒定所得的肽質量指紋譜（peptide mass fingerprinting， PMF）數據於Bio-Works（Thermo Finnigan， San Jose， CA）軟體搜索相應的庫。搜索使用的資料庫為IPI human蛋白庫（SEQUEST結果過濾參數為:當Charge+1，Xcorr≥1.9;當Charge+2，Xcorr≥2.2;當Charge+3，Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1）以及NCBI上 Homo sapiens的非冗餘蛋白庫（rendant data-base）。檢索參數為胰蛋白酶解;氨基酸固定修飾方式為脲甲基半胱氨酸;模式為單同位素峰;肽片斷最大誤差控制在100 ppm;肽片斷最大分子量誤差為±0.5 Da;每個肽允許有1個不完全裂解位點。

2 結果

2.1 脾腎虛型重症肌無力患者血清雙向電泳圖譜 的建立及分析 經2-DE技術及銀染色後，得到了兩組血清的雙向凝膠電泳圖，並於相同的條件下重復實驗3次。在正常對照組細胞蛋白質組雙向電泳圖譜上可觀察到1 463±179個蛋白點，而脾腎虛型重症肌無力組可見到1 508±89個蛋白點

⑥ 哪些因素會影響超濾膜組件截留分子量

會影響超濾膜組件截留分子量的因素：

1、進水壓版力對納濾膜的影響

進水壓力本身並權不會影響鹽透過量，但是進水壓力升高使得驅動納濾膜的凈壓力升高，使得產水量加大，同時鹽透過量幾乎不變，增加的產水量稀釋了透過膜的鹽分，降低了透鹽率，提高脫鹽率。當進水壓力超過一定值時，由於過高的回收率，加大了濃差極化，又會導致透過量增加，抵消了增加的產水量，使得脫鹽率不再增加。

2、進水TDS含鹽量對納濾膜的影響

滲透壓是水中所含鹽粉或有機物濃度的函數，含鹽量越高滲透壓也增加，進水壓力不變的情況下，凈壓力將減小，產水量降低。透鹽率正比於膜正反兩側鹽濃度差，進水含鹽量越高，濃度差也越大，透鹽率上升，從而導致脫鹽率下降。

納濾膜的應用非常廣泛，在醫療、環保等等的行業都有所涉及，為了確保其應用性能的穩定性，應注意進水壓力及進水TDS含鹽量對納濾膜的影響。