超濾濃縮液用PBS吹打

❶ 想請教用過Trizol法提取RNA，且結果比較理想的詳細步驟及注意事項，是否可以共享一下，謝謝

我這邊剛好在做，給你說下：
貼壁細胞的話去培養液，PBS洗一遍，加Trizol吹打下來。組織的話，在液氮裡面搗碎，然後粉末放進Trizol,用超聲粉碎器粉碎（超聲每3秒，停10秒冷卻，直到看不見組織碎末）。
（此步驟可以-80oC凍存，下面可以以後再做）
每1毫升Trizol加200微升氯仿（氯仿需飽和，可以在氯仿加一兩公分高的水層，搖晃後靜置分層，用時到下層取氯仿）
使出吃奶的勁把Trizol氯仿混合液搖成渾濁的乳液，每個樣起碼狂搖30秒（用手拿著，不能用漩渦混勻器）
靜置3分鍾，分層，進4度離心機，14000轉15-30分鍾。
取上層無色清澈液體，進新管。槍尖絕對不能貼壁，絕對不能碰觸到極薄的乳白固態中間層，絕對不能吸到下層的紅色液體。假定是1毫升Trizol200微升氯仿的量，你這里取個400-500微升就可以偷笑了，千萬別貪心，造成污染。
加相等體積異丙醇，倒置數次混勻，不用太激烈。
（次步驟又可以-80oC凍存，下面可以以後再做）
進4度離心機，14000轉10分鍾，這個時候可以看見小沉澱物了，白色，看不見的話，產量就悲劇了。。。
棄上清，用1毫升75%酒精洗兩次（加酒精，手搖看到沉澱物游來游去就可以了，然後離心棄上清）酒精盡量吸干凈，但槍尖不要碰到沉澱物。
蓋子打開，在通風櫥裡面晾乾（一般5-10分鍾。看到沉澱物從白色變半透明就趕快停了，干過頭了等下難以溶解）
加干凈的水（沒有核酸酶的，你懂的）10-50微升依你產量而定啦。55oC水浴5-10分鍾充分溶解。
大功告成，可以測濃度和各項指標，分裝，凍存了。

如果需要用DNAse去DNA，加在異丙醇步驟前即可。

❷ 純化的單克隆抗體，超濾濃縮的時候會把磷酸鹽離心掉導致抗體的緩沖環境變成水嗎

不會的。。。
超濾濃縮對於緩沖液成分不會有任何改變的，因為PBS中的磷酸根離子回也好答，氯離子也好，鈉離子也好都是很小的離子，可以在溶液中自由擴散，不會因為超濾離心就被甩到下層濾液中去。
你可以做個簡單的實驗，取一定體積PBS溶液測一下pH值和電導率值，之後用超濾管去離心。取出上層未被濾完的溶液再測一下pH值和電導率值，會發現pH值和電導率值和之前測的是一樣的。即可證明未被濾完的溶液還是PBS溶液，而不是水。

❸ 求助動物組織的DNA提取試劑盒

動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒

操作步驟：

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入休積請參照瓶體上的標簽。所有離心步驟均為使用台式離心機
在室溫下離心。

1. 樣品的處理：
   a、細胞：取 1×10
   6-1×10
   7個懸浮培養細胞，12000rpm 離心 1min 收集細胞，貼壁細胞先用胰蛋白酶消化處
   理，再用預冷的 PBS 吹打成細胞懸液，然後 12000rpm 離心 1min 收集細胞，盡量除去上清，加 200ul 溶液 A，
   振盪至徹底混勻。
   b、組織：組織量不宜過大，一般不要超過 25mg，可以使用勻漿器勻漿，最好用液氮研磨成粉末狀，再用
   預冷的 PBS 或無菌水充分懸浮，然後 12000rpm 離心 1min 收集細胞，盡量除去上清，加 200ul 溶液 A，振盪至
   徹底混勻。

2. 向懸浮液中加入 20ul 的 RNase A (10mg/ml)，55℃放置 15min。

3. 加入 20ul 的蛋白酶 K( 10mg /ml )，充分顛倒混勻，55℃水浴消化，細胞消化時間較短，組織消化時間較長，
   一般需要 1-3 個小時才能完成（鼠尾需要消化過夜）。消化期間可顛倒離心管混勻數次，直至樣品消化完全為止。
   消化完全的指標是：液體清亮及粘稠。

4. 加入 200ul 體積溶液 B，充分顛倒混勻，如出現白色沉澱，可放置於 75℃ 15-30min，沉澱即會消失，不影響後續實驗。如溶液未變清亮，說明樣品消化不徹底，可能導致提取的 DNA 量少及不純，還有可能導致堵塞
   吸附柱。

5. 加入 200ul 無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現絮狀沉澱，不影響 DNA 的提取，可將溶液和絮狀沉澱都
   加入吸附柱中。

6. 12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

7. 向吸附柱中加入 600ul 漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)， 12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸
   附柱放入收集管中。

8. 向吸附柱中加入 600ul 漂洗液，12000rpm 離心 1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

9. 12000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置於室溫或 50℃溫箱放置數分鍾，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，
   否則漂洗液中的乙醇會影響後續的實驗如酶切、PCR 等。

10. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 50-200ul 經 65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置
    5min，12000rpm 離心 2min。

11. 可將離心所得洗脫液再加入吸附柱中，12000rpm 離心 2min，即可得到高質量的基因組 DNA。

注意事項:

1. 試劑盒拆封後，RNase A和蛋白酶K需放置-20℃保存。

2. 樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量也下降。

3. 如果試劑盒中的溶液出現沉澱，可在65℃水浴中重新溶解後再使用，不影響效果。

4. 洗脫緩沖液的體積最好不少於50ul，體積過小會影響回收效率：洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要
   用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍)，pH 值低於7.0會降低洗脫效率。

❹ 超濾離心管怎麼使用

蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）。膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉澱，導致堵管。若發生沉澱，要確定沉澱的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，後者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉澱為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續三次，最後一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多於500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然後吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最後一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最後加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。
8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉澱，可以先加入水，然後用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉澱懸起，然後倒掉，不可用自來水猛沖】然後加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈。
9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml
離心管，排出部分水，然後蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。

❺ 做MTT時用的三聯液配方是SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml，沒有異丁醇的話，用異丙醇行嗎急！！！

應該明確實驗前

1。選擇適當濃度的細胞接種。的內貼壁細胞的96孔培養板中，在正常情況下，包括約105個細胞。但由於該地區有很大的不同，在不同的細胞附著在MTT法，預實驗檢測其貼壁率，倍增時間以及種子細胞的生長曲線的條件下，確定測試孔接種細胞數和溫育時間，為了確保列車終止誘導的細胞過滿。因此，在為了保證MTT晶體形成的細胞數成比例呈線性關系。否則，細胞的數目的敏感性降低太多，太少沒有觀察到差異。
2。集合中的葯物濃度。請務必看到更多的文獻，參考其他人的結果，然後給出一個比較大的范圍內的第一次篩選。根據自己的篩選狹窄的濃度和時間范圍再細篩的結果。記住！否則，可能會使用的時間和濃度的葯物的有效濃度和時間。

3。設置的時間點。 OD值嗎？在不同的時間點，輸入Excel工作表中，並最終在不同時間點的抑制率變化的測量，繪制圖形的變化，當曲線變得平坦（高原）的時間點，應使用最好時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制最明顯的表現）。

4。孵化時間。 200UL 10 4-5電源增殖細胞的培養液中是難以維持68H，營養不足，細胞增殖階段逐漸趨向G0期往往仍影響的結果，我們在48小時介質中被改變了。

5.MTT法只能測定相對細胞數和相對活力，不能絕對數量測定細胞。做MTT，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值增加。

6。理論未必全是。要根據自己的實際情況進行調整。

實驗對照孔加葯孔孔應設置為零。零孔加培養基，MTT，二甲亞碸。控制井和計量孔必須加細胞培養基中，MTT法，二甲亞碸，和不同的是添??加到媒體控制井，而溶解該葯物中加入不同濃度的葯物的給葯組。

8。避免血清干涉。含15％FBS培養基中培養的細胞中時，高血清物質會影響試驗井的光吸收值。將測試的靈敏度測試增加背景。因此，它通常是優選的是小於10％胎牛血清的培養液中。著色後，盡量吸凈培養孔殘余的培養基。

實驗步驟

貼壁細胞：

1。上收集的細胞數，調整濃度的細胞懸浮液加入到每個孔100ul鋪板所測試的細胞調節至密度為1000-10000孔（邊緣？孔填充用無菌PBS中）。

2.5％CO2，37℃孵育，直到細胞單層覆蓋的底部的孔（96 - 孔平底板），添加葯物的濃度梯度，在原則上，細胞的粘附給葯或兩小時或半天的時間，但我們常在前一天下午鋪板第二天早上劑量。一般為5-7梯度，每孔品100μl，位於3-5井。建議設5，否則難以體現

3.5％的CO2，並在37°C孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察到的真實情況。

4。添加到每個的阱20ulMTT溶液（5mg/mL的，或0.5％的MTT），並培養4小時。用MTT反應的葯物可以先離心丟棄培養基，用PBS仔細洗滌2-3次，然後添加到培養基中含有的MTT。

5。終止的文化，並認真吸收孔培養基。

6每孔加入150ul二甲亞碸，設置振動篩在低速振盪10分鍾的晶體完全溶解。在OD490nm的酶聯免疫吸附檢測器測量的每個孔的吸光值。

7。同時置零孔（培養基，MTT，二甲亞碸），對照孔（細胞，相同濃度的葯物溶出介質，培養基，MTT法，二甲亞碸）

懸浮細胞：

1）收集對數生長期細胞，調節細胞懸液濃度為1×106互補序列①1640（無血清）介質40ul;②加放線菌素D（有毒）10UL稀釋培養基升的？克/毫升，需要預先測試，以找到最佳稀釋,1:10-1：20）;③需要檢測對象10UL;④細胞懸浮液50μl（即，5×104cell /孔）的100ul加入96 - 孔板（邊緣？孔填充用無菌水）。建立控制每塊板（加100（原液100 1640）。
2）在37℃，5％CO2孵育16-48小時，並在倒置顯微鏡下觀察。

3）每孔加入10微升MTT溶液（5毫克/毫升，或0.5％的MTT），並培養4 h。 （懸浮細胞推薦WST-1，培養4小時後可以直接跳到步驟4），直接酶聯免疫吸附測定的OD570nm 630nm的校準測量每孔的吸光度值）

4）離心（ 1000轉x10min）仔細吸掉上清液，每孔加入100微升二甲亞碸中，設置搖動器在低速振盪10分鍾，完全溶解的結晶。在酶聯免疫吸附測定OD570nm（630nm的校準）測量的吸光度值？為每個孔。

5）設置零孔（培養基，MTT，二甲基亞碸）對照孔（細胞，相同濃度的葯物溶出介質中，在培養基中，MTT法，二甲亞碸），每個設置的3個井。

MTT准備

MTT通常情況下，最好使用4℃避光過濾器後兩周內，或配製成20,10,5保存在 - 20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量包裝，用黑袋或黑紙，鋁箔及包裝暗，避免分解。我一般都把MTT粉包裝EP管，現有的服務直接添加到培養板，不需要一下子有這么多的，特別是當它絕對MTT變為灰綠色不能重復使用。

MTT致癌性，使用時要小心的那種透明薄膜手套的最佳條件。被稱為MTT需要無菌，MTT細菌，是非常敏感的;到96孔板一個PBS 黑暗中額外的時間並不重要，畢竟，時間是短暫的，你不用擔心時，你可以把關了燈手術台。

制備MTT;溶解，還配備用鹽水在60℃水浴中進行增溶。

PBS配方：

氯化鈉8克

KCL0.2克

磷酸氫二鈉1.44克

> KH2PO40.24克

調pH值7.4

給定容量1L

細胞接種（平台）

細胞30代不要使用，因為狀態並不好，培養板中使用一個很好的（最好是進口板），壞板或重復使用的板僅做預實驗。

最佳接種密度計算出來的按照預實驗接種後，細胞生長抑制率（或增值率），因為關於OD值嗎？細胞密度10000/ml的測量時間間隔呈直線關系最好的，最可靠的結果。如果店鋪是太稀細胞的殺傷不會很明顯，可能都過於密集的細胞凋亡，細胞生長速度過快的營養是不夠的，最後導致死亡。過密或過少的細胞，細胞增殖將是過快或過慢，差線性關系，其增值率。因此，MTT細胞的密度使用更10000/ml的，100ul /孔。

細胞密度的特點，不同的細胞，如果細胞刺激作用的葯物，那麼細胞濃度為小點，如果你這樣做對細胞有抑製作用的葯物，然後取更大一點細胞濃度，因此，與對照的差異，該數據是更好。懸浮細胞的各孔中的細胞數達到105，貼壁細胞103-104。

其他的聲音：

第一個單元格播種密度不能太一般每孔1000就足夠了，我想，寧少勿多。特別是對腫瘤細胞。 10000 /孔是太高，所以，即使葯物，MTT法不能表達的最佳點板濃度在4000-5000 /孔，太少的SD值。

2.MTT本身是一個相當厚的實驗約10％，增殖率的波動也就不足為奇了。特別是新手，有20％的波動也是常見的，因此它可能是由於技術原因，特別是種板技術必須過關的。

我MTT法檢測腫瘤細胞，這些細胞長一開始我100000/ML濃度的疫苗接種，結果細胞長的太滿，結果梯度也沒有線性關系。調整後的濃度使用了40000?80000/ML濃度MTT法，做的好點的是60000?70000/ML組的濃度。 40000 / M的基團的濃度，是因為這些細胞是以下，葯物作用或只是沒有一個有良好的線性關系的梯度，根據細胞生長速度，以及葯物的特性（的時間依賴關系，並的濃度依賴性的葯物），以確定培養的時間是48小時或72小時。

一定要注意避免細胞的細胞懸液混合沉澱下來，在每個孔中的細胞數的范圍，收到了一些必要再混合均勻。移液管操作要熟練，避免人為錯誤。雖然更准確比移液管移液管，但如果操作不熟悉，CV將在8％左右。此外，吹了太多的時間，也影響細胞活力。因此，熟練的鞋，盡快在黑板上。

讓我談談我的一點經驗：

1。狗新花樣不能太多懸掛的總的3-4倍，吸液管液量可能會比較容易混合。 10毫升優選地安裝的懸浮液中3?4毫升：該懸浮液的離心管太少容易吹氣泡，懸浮液的特定也是不容易被風吹到單細胞懸浮液。 。 。

移液管移液管最好在1毫升左右：吸入過量的液體，看起來液管餘下的數，如吹打容易起泡吸管吸了很多量過小，強度移液是不夠的，將移液不均勻。如果吸液量1毫升稻草，總液量，在約5ml的好處

吸氣時，懸掛在底部，然後抬起，但吹了下來，不留液體的表面，否則容易一拳砸的氣泡。

4。狗新花樣，你可以數100吹打均勻（前約30-50倍的吹打加細胞基本上差不多均勻。加細胞分別接種2孔反復移液管移液3次3次後，他們把他們的槍掛在5秒內的細胞懸液，然後劃出一定的速度懸浮液）。

用吸頭，每孔加入到細胞中不要太猛了，否則你會發現細胞在想要添加的移液管尖中的孔的底部的勢頭由於收集了一堆，一般在這種不均勻的分散液接觸抑制周圍的孔的底部的中心，影響細胞的生長。因此，速度不能太快，也不能太慢。我習慣了增加每塊板水平握手後，左一個右其次，移動的答復中，細胞可以均勻地分散這些。 （鋪板技術是MTT法的關鍵，也是基礎，我們必須練好，一旦學生振盪器和混合與旋渦細胞，最後一個單元格都死了，使用這種方法是不建議混合細胞
BR />加入MTT

個人認為MTT最關鍵的是你的手機號碼和MTT適當的比例補充說，真正起作用的，和具體的細胞數量之間的關系和真正的工作真的不好確定，我認為MTT支付超過最低量好一些

MTT各種報告的MTT，一般是過度10UL不夠的，如果你不使用96孔板， MTT按照10％的比例超過100ul培養基地。，加入MTT振盪讓MTT和媒介組合，但這個應該不大。

有個別的孔，如立即加入MTT變藍黑色，污染的可能性是很大的，另一個在前面的MTT攤薄細胞仍然需要適當的方法來過濾消毒。可以加MTT前顯微鏡下才能看到，如果有一個孔染菌，染菌孔附近往往是 />
血清白蛋白對大多數的葯物的組合的效果，它是可能的分開的葯物和MTT一起看到的將反應MTT法不能反應，不必除去水培的含有葯物的溶液，直接加。

上層清液

爭：

1加DMSO液體吸掉，但培養液，紫色晶體吸收之前，該第一的平板離心機，2000轉，5分鍾，然後吸掉上清液（如果是懸浮細胞，此方法建議在2500rpm 10分鍾離心分離的懸浮細胞，並做MTT的最好的圓底96孔板中的96 - 孔板，注意不要結晶顆粒吸掉上層清液後，建議每孔吸出150-160ul）

2。每次我都會MTT和孵育4小時，然後離心1000G 5分鍾槍小心吸去上清液，或將一小部分藍水晶吸出，所以還是建議翻轉顛倒了！

另外，我們可以直接在板翻轉顛倒（墊層濾紙）2-3倍的方式「吸」是不容易使細胞脫離出來。輕拍，或傾斜一點幫助吸液管，紫色晶體幾乎沒有可見的列，但你自己的細胞貼壁的前提下，比較監獄，半貼壁生長的細胞容易脫落。葯物作用時間長，陰性對照組的細胞可能是由於過多離開MTT加入後形成的結晶漂起來，所以不能直接排放

MTT，這一步必須小心，不要使用貼在牆上倒立的方式，因為是不強大的單元格將被倒掉，從而影響OD值嗎？懸浮細胞，不拍打上清液。 ，離心後，不拍打這種方法殺了人。

5。加入MTT反應完成後3-4h後，在96孔板的作用是從孵化器中刪除要輕柔，避免振盪結晶，它溜了。您可以嘗試在96孔板傾斜30度角，然後的槍口慢慢吸一些細胞排球吸，有些人會用移液器吸頭吸病人，槍口下的強度和方向，以確保每個孔是不要讓吸頭接觸到孔??底，一次後傾斜孔板，不反復傾斜的平直，這樣也會使晶體脫落。

6。移液與醫用注射器登上教訓針對角線的經驗教訓沿著培養基MTT的牆壁，好像我1毫升針小心地吸可靠的比其他的方法，一般不吸紫色晶體。

避免上層清液和改進的方法

一般容易發現，即使貼壁細胞在96孔板離心式離心機，的MTT溶解在DMSO，結果是沒有好，不能得到預期的結果重復性差。

解決方法1：以下文獻方法：周建軍等，評價抗癌物質活性的改良MTT法，中國期刊的葯品，1993,24（10）:455-457 BR />
具體方法如下：

三溶解液：10％SDS，溶於蒸餾水中，5％異0.012mol/LHCL的。

三聯溶解解決方案：SDS10g，異丁醇5毫升的10M鹽酸0.1毫升雙蒸水溶解配成100mL溶液

操作：細胞懸浮在培養板中，加一定密度的解決方案，90ul /孔;管理，然後（懸浮細胞）在同一時間或4h後（貼壁細胞）通過加入不同濃度的葯物10UL /空穴，位於三井。另外，每塊板另一個沒有零孔（僅添加到培養基中，無細胞和葯物）培養2d後加入MTT溶液20ul /孔，和文化繼續4小時，然後加入上述的三重液體品100μl/孔，在37℃靜置過夜，用酶測定的標准儀器孔A570值？

優點：簡化操作，提高了可靠性。

解決方法2：日本同事有一個新的試劑CCK-8試劑，CCK -8試劑可用於簡單和准確的細胞的增殖和毒性分析其基本原理是：含有的試劑WST-8 [化學名稱：2 - （2 - 甲氧基 - 4 - 硝基苯基） - 3 - （4 - 硝基苯基）-5 - （2,4 - 二磺酸苯基）-2H-四唑單鈉鹽]，這在電子載體1 - 甲氧基-5 - 甲基硫酸鹽吩嗪二甲基（1 - 甲氧基PMS）線粒體脫氫酶的作用降低的高度水溶性的黃色染料（甲臢染料）A的產生與活細胞的數目的數目成正比，所以此功能可以用於直接的細胞增殖和毒性分析CCK-8試劑已預先裝入的細胞增殖和毒性分析所需的組件，未經稀釋，然後緩沖區或中等，沒有任何放射性同位素和有機溶劑的CCK-8試劑。因此，沒有特別的技能，你可以讓每一個用戶准確，可重復的實驗結果。

★優勢 / a>
1，簡單的一個步驟的結果

2，節省時間，不需要預制開放

3，安全沒有必要放射性同位素，有機溶劑
>
4，迅速消除溶解除沉操作

5，高靈敏度，靈敏度比MTT

6，重復性幾個不錯的步驟，無損，准確

是比較昂貴的，如果充分的資金，這是件好事。

★細胞增殖實驗使用：

1，接種細胞懸液100μL96孔板，預先放置在37℃，在5％CO 2培養箱培養。

2在每個孔中引入CCK-8試劑10μl的。

培養板在孵化器1-4個小時。

4，測定吸光度在450nm波長為600nm或600nm的波長參考。

解決方法3：使用MTS / a>
解決方案4：

加入DMSO

放棄孔內液體，最好不要更換相同數量的實驗DMSO加入DMSO清潔，直接加入到DMSO首先，除去上清液，沉澱將難溶於培養基顏色檢測測量時，將影響最終的結果，但前提是不能使細胞與吸掉，因為錯誤是遠大於培養基中沒有放棄一個干凈的錯誤，所以，以確保細胞的前提下，盡可能不虹??吸的培養液虹吸如果培養溶液不是一次性清潔空白孔應留下的培養液相同量的，所以檢測時的培養液的影響，可以除去盡可能多的DMSO的量為100ul或150ul

1。添加的DMSO後使用振盪器輕輕振搖5 - 10分鍾時間控制密切越好，放置時間長了會影響結果，該值將過大，其結果是不可靠的。
2。後加入DMSO排球反復抽吸溶，盡快解散後檢測。實驗孔是小的，它建議，這種方法，因為其更好的效果比振盪溶解。

3，或者在37度把培養箱中培養15分鍾，溶解結晶

振盪，讓甲溶解，以便更好地測量的吸光度振盪96孔板具體地說，振盪器，目的：鑿孔泡沫。氣泡的存在下，由於其光的反射和折射效果（原則讀者是通過特定波長的測量樣品中的特定物質樣品的吸光度推測）的濃度，會導致結果抵消了測定OD值嗎？

至於測定給出的波長是不同的顏色溶液，DMSO，溶解紫（紅）色，490nm處的最大吸收值，而在ATCC的MTT試劑盒使用的是不DMSO，它的測定波長為570（在ELISA實驗，OPD為底物測得的波長為492，選擇的TMB底物溶液是450）; SDS和酸化異丙醇選擇570nm的，並建議作為參照波長等於655nm。

DMSO溶解經過10分鍾內測，越放顏色越深，SDS溶解液測定吸光值，其值在三天內保持不變。

細胞密度太大測定吸光度細胞密度過大，吸光率也小;另一個細胞狀態的關系，細胞狀態不好的吸光度值低;少量的細胞，或短的時間內培養的OD值會比較低。每個洞之間的差異尤為明顯說明可能存在的污染，空白孔的OD值過高，很可能是細菌的污染。

井直接OD值差別一般應在0.1-0.15不同的考慮：1。種子細胞不統一或疫苗接種時，應保證每一個孔一般為1000-10000元以及細胞細胞計數，加入細胞懸液培養基中定容，輕輕吹打幾次，使細胞均勻分布的，因此，這是更好的不是直接加入預定體積的細胞懸浮液，接種疫苗應加入含有血清的介質2。粘附時間:18-24小時，如果沒有，而不是懸浮細胞可虹吸
/>一般，為了實驗的精度，和各濃度可提供5-6井可以最終的統計，可以除去的最大值和最小值，或荒謬的值？其特徵在於，所述數據被除去，這些離譜數字細胞污染，是否在培養過程中細胞的死亡，文化，蒸發過度的附加組件的MTT溶液是不準確的，在5％二氧化碳培養箱中培養，在37°C，無論是時間常數（1-4小時）有密切的關系，當然的OD值的測定儀器狀態是正常的，是非常重要的！（一般熱身20分鍾）。

MTT吸光度誤差在0.2至0.8之間。分析化學相關的蘭伯特Beer定律，朗伯 - 比爾定律骨密度分析偏差，通常在標准曲線的情況下是不是線性的，尤其是吸光物質的濃度較高時，可以清楚地看出通過原點到濃度軸彎曲的現象（吸光度軸彎曲）情況稱為朗伯 - 比爾定律的偏離定量的曲線的彎曲部，將產生較大的誤差。骨密度分析儀測量不準確的誤差的主要來源。光度計具有一定程度的測量誤差。這些錯誤可以是來自於光源不穩定，變化的實驗條件下偶然不準確的讀數。

光度計透射的標尺刻度是均勻的。吸光度標尺刻度不均勻。波動對傳動比一定值時，讀出的相同的工具;吸光度讀數波動不再是一個固定的值。吸收更大的錯誤讀數波動而引起的透光率或大或小，濃度測量誤差大，更大的吸光度，最好的光度當選的吸光度讀數不下降在中間規模的要被測量的透射率T在15％至65％的范圍內的溶液，或在兩端時的吸光度，A是在0.2?0.8之間，為了確保較小的相對誤差的甲= 0.434（或透射比T = 36.8％），最小相對誤差的測量。

其他的聲音：

最好的570nm波長過濾器，MTT吸光度測量。在此波長的峰值，在其他詞語具有大致490nm處與其他波長的高靈敏度，但我的經驗的靈敏度降低了一半。
2 BIO-TEK，我們使用ELx800，一般值2是可靠的，如果該值是要考慮它是否是一個錯誤在實驗過程中，我已經看到了花園的一些職位OD值可能與活細胞數在0.2-1.2范圍內具有良好的線性關系，復孔太大的區別，但OD值在0.3-0.9范圍內的好，如果你的OD值？此范圍之外的，做實驗，細胞計數可能不適合，你應該調整細胞的數量。邊緣效應
/>

孔一般只有空白，非培養細胞，或這四條線中的數據將是高或低的由圓圈包圍的96孔板，96孔板的培養箱中因為缺乏濕度，和孵化器具有一定的溫度，由於溫度梯度，使得邊緣的孔蒸發更快，導致的各個組成部分中的培養基中的濃度增加，導致這種現象的不同的細胞狀態，它是必要的，以保證濕度的培養箱中，並以降低的頻率和持續時間的開關培養箱。方法：所有周圍的圓形孔的孔板，「否」，的影響是非常大的，最外面的圓必須添加水，PBS或培養液中，只要你能防止水分蒸發。

如何計算的IC50後的寇方法：

（1）lgIC50 = XM-I（P- （3-PM-PN）/ 4）

XM：LG的最大劑量

I：LG（最大劑量/相鄰劑量）

P ：正反應速率和

PM：最大的陽性率

PN：最小陽性率

例如：各組濃度0.1,0.01， 0.001,0.0001,0.00001,0.000001，稀釋10倍，與最大濃度為0.1的抑制率分別為0.95，0.80，0.65,0.43,0.21,0.06到

計算公式：
PM =在
Pn的0.95
= 0.06

P = 0.95 +0.80 +0.65 +0.43 +0.21 +0.06 = 3.1

XM = lg0.1 = -1

LGI = lg0.1/0.01 = 1

lgIC50 = -1-1 *（3.1-（3-0.95- 0.06）/ 4）= -3.6025

IC50 = 0.00025

（2）Bliss法：自己的檢查書

（3）IC50計算軟體，請參閱下文附件

（4），使用EXCEL趨勢線尋求IC50約LD50的方法與此類似！

（5）網上尋求IC50或EC50： HREF =「htt??p://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm」目標=「_blank」> http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat / JavaStat-j.htm

結果統計

數值應用SPSS軟體進行方差分析，P <0.05顯著差異（P <0.01）的差異是非常顯著的時間為橫軸，吸光度值上的垂直軸繪制以x±s行細胞生物學，具體評價式IC50的細胞死亡的抑制率％= OD控制基團-OD實驗組/ OD控制組

可以做excel表格兩兩比較，T-測試，你可以參考你的數據應該是指多個樣本T檢驗，方差分析軟體SPSS或SAS。
/>口復用：

板使用一個很好的（最好是進口板），壞板或重用板僅做預實驗。一般貼壁細胞生長的重用培養板效果不是很好，因為培養板表面塗了一層的貼壁細胞的物質，在生產，可能會失去清潔後懸掛或半懸浮培養細胞的生長也建議不要使用太多次，甚至進口的板子，次數不超過3次，最終測量值的1/3，什麼最好的價值。

板塊強烈建議不要重復使用：泡沫酸，但泡完酸板是非常有利於細胞的生長，會有不良帖子壁，細胞生長緩慢，等.2，非常徹底的消毒有關的董事會，如果存在的話，那麼運行的風險.3重復使用洗板。不幹凈，在訓練過程中容易出現雜質

再利用的做法：

洗滌2％的NaOH浸泡4小時，然後浸泡4小時1％鹽酸，水為15倍，用蒸餾水洗滌三次，乾燥，UV照射過夜（UV多於兩個小時消毒罐）

實踐：

氣泡酸2-4小時，老師讓我們做了四個多小時（普通玻璃儀器過夜）。撈出，沖洗，乾燥，紫外線照射過夜。估計收集在一起與其他鈷60輻照滅菌。
/>做法：

做MTT用水和清潔劑的水沖洗板，然後用洗衣粉水（注意最好讓清潔劑的第一打開）幾個小時。，沖洗

❻ 請教細胞培養用的PBS濃度

好養貼壁細胞的，請問應該用什麼濃度的膠原
解決方案如下：
1.如果你手上這支細胞已經傳代次數很多的話,建議復甦一支新的細胞,這是最直接的方法
2.檢查培養基、胰酶、pbs中是否有污染
3.如果只有手頭上的細胞,那麼檢測一下是否有支原體或者病毒感染,黑膠蟲實際是一種細胞殘留的膠質成分並不是一種污染源但是視野中會有黑色點狀物好像懸浮細胞但略小,注意區別
4.貼壁不佳可以在傳代或復甦前選用包被液包被培養瓶,增加細胞貼壁性,一般用多聚賴氨酸包被,效果很好,可以一試
5.有時候細胞分裂是貼壁-懸浮-分裂-再貼壁的一個過程,懸浮細胞不一定都是死細胞,可能是正在分裂的細胞,一般來說貼壁好的細胞換液一次總會有大概5-15%再次懸浮,少量的話不必過分擔心
補充你的問題：觀察消化時間是以你的細胞在加入胰酶後變圓開始到細胞間連接消失細胞脫落為消化完成,消化時間過短鏡下觀察可能會有貼壁殘留,消化過久會損傷細胞導致狀態不佳,建議兩步法消化,效率比較高,吹打以吹散細胞為目的不必太過用力,其實吹打對細胞的損傷相比胰酶是很小的,稍加註意即可

❼ 293T人胚腎細胞能用1640培養基培養嗎

293T細胞的培養 ： 293T細胞是由293 細胞派生, 表達SV40 大T抗原的人腎上皮細胞系, 被廣泛應用於瞬時轉染以過表達各種目標蛋白, 或是用以包裝病毒。 293T 為貼壁細胞, 這種細胞對培養基的營養成分要求並不高。 培養條件為: 完全培養基: 高糖 DMEM, 10% 胎牛血清; 凍存液: 胎牛血清或完全培養基, 10% DMSO。 傳代方法為: 1．吸掉293T 細胞培養瓶內的培養液; 2．吸取適量的無Ca2+ 和Mg2+ 的PBS, 輕輕把貼壁的細胞洗兩遍; 3．加少量的0.05% 胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2 的培養瓶加1 ml, 75 cm2 的培養瓶加2~3 ml), 放到培養箱溫育20 s; 4．細胞消化完畢, 加適量培養液終止消化, 並吹打細胞, 製成均勻的細胞懸液; 5．加足量的培養液, 分裝到新的培養瓶中。值得注意的是, 293T細胞的貼壁性不強, 輕微的干擾就可能使它們脫落。所以, 在更換新鮮培養液或者用PBS沖洗的時候應該小心地添加新的培液進去, 以液體不沖打到貼壁的細胞為好。 6、傳代的時候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可輕松把細胞消化下來, 不需要消化很長時間。有些同學反映293T 細胞容易結團不易被吹打開來。如果遇到這樣的情況可以在加了胰蛋白酶溫育一段時間後即拿1 ml 移液槍反復輕輕吹打, 直至肉眼看不到大的細胞塊為止, 7、加適量的培養液混勻, 這時候在顯微鏡下觀察, 可見大多數細胞都是單個的, 只有少量的2~3個細胞聚在一起。一般293T 細胞可以長在塑料的培養瓶底面上直到90% 融合, 再以1∶4~1∶8 的比率傳代。合適的傳代周期為2~3 天。 8、傳代過程中, 消化的時間越短越好, 顯微鏡下觀察到80%細胞脫落即可加培養液中止。 完成傳代後放入培養箱前： 應該把培養瓶或培養皿沿X、Y軸方向水平移動幾下, 防止細胞都聚在中間或者四周。冷凍293T 細胞的凍存液可以用95% 小牛血清加5% 二甲基亞碸, 復甦率很高。 293T細胞的生長狀態直接關繫到包裝病毒和轉染的效率, 應盡量選擇傳代次數少, 培養總時間短的細胞。從細胞形態上看, 相差顯微鏡下觀察立體感強並且形態良好的細胞產病毒率或者轉染效率都很高。 雖然293T細胞的應用非常廣泛, 幾乎每個實驗室都有一株自己的293T 細胞株, 但是經常有同學提出: 為什麼在正常的培養條件下, 細胞卻很難傳代下去, 包裝病毒效率很低, 對轉染效率也不滿意呢？ 事實上, 引起類似問題的元兇是一種生物界最小的原核細胞生物－支原體。支原體污染後, 它們不會使細胞死亡而是與細胞長期共存, 培養基不發生渾濁, 細胞無明顯變化, 外觀上給人以正常感覺, 但事實上細胞正在受到到多方面影響, 如引起細胞變形, 影響DNA 合成, 抑制細胞生長等。我們曾經收集到四株分別來自四個不同實驗室的293T 細胞, 經檢測均為支原體陽性, 令人驚訝的是這四株細胞都已經不是典型的293T 細胞形態, 每兩株之間比較竟然形狀各不相同, 很難相信這是同一種細胞！這些支原體陽性細胞普遍傳代周期長, 顯微鏡下觀察細胞碎片多, 長期支原體感染已經使這些細胞羸弱不堪, 胞內DNA 和蛋白質合成受到嚴重的影響。 因此, 有效地防治支原體污染, 杜絕交叉感染對提高實驗效率, 穩定實驗結果至關重要。我們的經驗是把防治支原體污染作為細胞培養的一項日常工作, 除了對細胞培養設備環境的清潔外, 還需在器材消毒, 操作員培訓, 嚴格把關新引入細胞株的質量等方面做大量細致的工作

❽ 抗體透析時夾透析袋的夾子開了，抗體進入了5mM PBS透析液中怎麼辦如何從透析液中提取抗體呢

這個基本沒有辦來法。
你透析源液多在體積？如果體積小一點的話。你先把透析液分裝一下。－20凍起來.留下一小部分用於你的實驗看一看。如果行的話就這樣用。如果濃度太低，那就沒辦法。
當然，你也可以試著用A蛋白純化柱或者G蛋白純化柱試著回收，但一個這種柱子太貴，另一個，能否回收得到還是個問題。

❾ 牛血清白蛋白的提取和鑒定方法(設計性實驗報告)

牛血清白蛋白的提取操作步驟：

1、鹽析取離心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血清，搖勻後，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液2mL，邊加邊搖，充分混勻，然後靜止放臵10分鍾，再離心（2000r/min）10min，將上清液傾入試管中。

2、取干凈的比色板，在各孔內滴加一滴納氏試劑 

3、取玻璃紙一張，折成袋形，將離心後的上清液倒入袋內，用線扎緊上口（注意要留有空隙），用玻璃棒懸在盛有半杯蒸餾水的100mL燒杯內，使透析袋下半部侵入水中，對蛋白液進行透析，常用玻璃棒攪拌袋外（燒杯中）液體，以縮短透析時間。

4、每隔2分鍾檢查一次，更換蒸餾水多次，用納氏試劑檢查袋外液體的NH4+，觀察顏色變化並記錄，直至袋內鹽分透析完畢。

5、將袋內液體傾入試管，即得牛血清白蛋白溶液。

牛血清白蛋白的鑒定方法：

1、點樣取一張膜條，將薄膜無光澤面向下，放入培養皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多餘的緩沖液，以薄膜的無光澤面距一端1.5㎝處做點樣線，將牛血清樣品與待測的牛血清白蛋白溶液分別用點樣器在同一張薄膜的點樣線處不同位置點樣。標准液點一次，待測液點三次。

2、電泳將點樣後的膜條致於電泳槽架上，放置時膜條無光澤面向下，點樣端致於陰極，待平衡5min後，打開電源，調節電源，調節電泳儀的電壓為160伏，通電60min，關閉電源後用鑷子將模條取出。

3、 染色將膜條直接浸於盛有氨基黑10B的染色液中，染2分鍾後取出，立即浸於漂洗液中，分別在漂洗液1、2、3中各漂洗5min，直至背景漂洗干凈為止，用濾紙吸干薄膜。

4、鑒定比較樣品和待測液中白蛋白在薄膜上的電泳結果，看位置是否一致。

(9)超濾濃縮液用PBS吹打擴展閱讀：

牛血清白蛋白

牛血清中的簡單蛋白，是血液的主要成分（38g/1000ml），分子量68kD。等電點4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。僅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581個氨基酸殘基組成，其中35個半胱氨酸組成17個二硫鍵，在肽鏈的第34位有一自由巰基。白蛋白可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質結合。

血液中的白蛋白主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營養作用。在動物細胞無血清培養中，添加白蛋白可起到生理和機械保護作用和載體作用。牛血清白蛋白（BSA），又稱第五組分，是牛血清中的一種球蛋白，包含583個氨基酸殘基，分子量為66.430 Da，等電點為4.7。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用，例如在western blot中作為Blocking agent。

❿ 超濾離心管怎麼使用

蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）。膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉澱，導致堵管。若發生沉澱，要確定沉澱的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，後者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉澱為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續三次，最後一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多於500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然後吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最後一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最後加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。
8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉澱，可以先加入水，然後用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉澱懸起，然後倒掉，不可用自來水猛沖】然後加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈。
9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml
離心管，排出部分水，然後蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。