硝酸纖維素膜用之前要用水處理嗎

① 電轉移後的硝酸纖維素膜如果不能及時進行檢測,應如何保存

硝酸纖維素膜的保存方法，可以參考一下以下做法：
儲存膜一般要求是避光,密封.過干或過濕都不利.在這種保存條件下,一般可以放置兩年. 但是如果膜上做了封閉處理,就要根據具體試驗情況來判斷了.
有些膜由於生產工藝的問題,使用後靈敏度會在一段時間內發生變化,遇到這種問題,就需要在點膜後放置一段時間,待穩定後方可進入調試生產.

② Western 硝酸纖維素膜有正反面嗎如何判斷

轉發了一個很全的回復：

1. 國外的硝酸纖維素膜一般正反面不明顯，均比較光滑，不易區分

2. 國產的硝酸纖維素膜可以看出一面光潔一點，一面毛燥一點。

3. 轉膜時無正反面之分，根據有些人的經驗，毛燥的一面有時對蛋白的吸附能力更強一點，蛋白載量更大一點。

4. 硝酸纖維素膜轉膜之前大多的正規操作方法是使用前要泡一下甲醇，以活化表面的基團，但個人經驗是，可以不用泡，有些硝酸纖維素膜很易在甲醇中被消化掉，如果泡的話應該是浸一下就取出，或者在轉膜緩沖液中多泡一會。

③ 請問做Western時 硝酸纖維素膜使用前需要用水浸泡嗎浸泡多長時間不泡會怎麼樣

泡一下，濕了就行。 不是用水泡，用轉移buffer泡。

④ 硝酸纖維素膜的生產原理

這個雖然看上去屬於生產廠商的事情,但是GMP有個觀點是強調對過程的控制才會有好的結果.那麼只有了解NC膜的大致生產過程和基本原理才能更好的掌握這種材料的特性,最終製作出滿意的試紙.你了解嗎?
NC膜的過程和普通的造紙過程是非常類似的,我們可以借鑒對造紙的認識來理解.
首先,勻漿配比
購買回的原料硝酸纖維素粒子是一種非常普遍的有機化學物,溶解形成混漿,在該漿體內,會加入一定比例的試劑來調整最後形成的膜的性質,一般是一個試劑配方,主要包含表面活性劑/高分子聚合物/鹽離子/成型劑等溶解在一個緩沖體系內. 不同的廠家加入的溶液配方不一樣,直接導致了在產品的差異.
其次,滾筒鋪膜
配好的勻漿通過滾筒,形成了一張薄膜,平攤在十分光滑的平面載體上.這個和造紙的過程是非常相似的.
最後,成型
在勻漿內的成型劑開始揮發,膜逐步乾燥成型.同時在這個過程中由於溫度比較高,有些廠家在這個過程採取了在密閉腔體內成型,同時補充配方溶液的形式,來避免一些有效成分的蒸發.
切割出產品
通過以上步驟生產出來的膜是呈一個寬度極大的產品,寬度的大小直接和滾筒的大小相關,滾筒越大生產越方便,但設備的成本也越高.寬膜要經過切割才能成為我們購買到的25mm或18mm(或20mm)寬,而長度上,成品卷膜和寬膜的長度是相同的.理論上可以讓廠家切成你需要的任意寬度,但這樣會造成原料的浪費和人力成本的增加,後來廠商在和試紙生產廠家的協調過程中,綜合用料成本和生產便利性基本確定了上面說的寬度,以次為標准.關於不同寬度的用途差異,稍後詳述.
從生產的過程,我們可以得知, NC膜本身是已經添加了表面活性劑來改善親水能力,而且已經存在有一定的緩沖系統(雖然對紙條測試影響不會很大).對後面談到的一些問題就比較容易理解.

⑤ 硝酸纖維素膜的質控方式

本節適合用膜量較大的公司用戶參考.對於一卷膜可以用上幾個月的用戶來說, 廠家的質控標准已經完全能滿足你的要求,而不需要自己再做相關的質控.
膜的質控雖屬於原輔料QC職能, 但由於其專業性強, 一般都由小樣調試人員來執行. 膜入原料庫後需要進行如下檢驗工作:
1. 查收COA
在購買時, 供應商會隨產品為每個lot的膜提供一張紙質的出廠質量證書, 該證書被稱為COA. 如果你已經購買某一批次的膜, 而沒有索取相應的證書, 如果有需要可提供批號向廠家要求補發. 其實在很多行業都有廠商為自己的產品附上COA的習慣.
COA一般只提供給大客戶, 對小客戶是沒有意義的.
其內容主要是廠家在產品出廠時做過一些測試的羅列. 作用可以理解為質量憑證和測試數據參考.
2. 檢查物理性能
膜的物理性能主要是2個參數, 膜厚度和寬度. 長度不需要檢測. 使用中可以關注長度上是否有斷面重接現象, 斷面多費料則多, 少數發生.
厚度, 由螺旋測微尺,選擇幾個測量點檢測後算平均. 膜生產的必測參數. 主要表現為厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴散性能, 點出來的C/T線寬窄不一. 另外也影響爬速.
寬度, 普通直尺測量.
物理性能一般都不會有什麼大問題. 畢竟檢測標准客觀, 易把握. 沒有條件執行的廠家可省略.
3. 跑水性能
樣本採用含有有色食用色素的水溶液, 目的是容易觀測. 需製作一個簡易支架.
操作: 注入足夠溶液到下部槽內, 將不同批次膜每隔1cm做一次標記(總長大於4cm)並放到傾斜支架, 整個支架下端放入溶液槽, 膜開始吸液, 計時. 記錄每個標記處的通過時刻, 並與對照組比較.
跑板時, 理論上溶液呈水平線形式上吸, 觀測是否有波浪傾斜或包圍潤濕等反常現象.
4. 點樣測試
C/T線出線時間, 其他試驗條件相同情況下, 記錄和比較C/T線出現時間是否與對照有差異.
靈敏度, 比較不同樣本濃度情況下, T線的變化是否和對照組同. 一般每批次膜取前端一段用來測試即可. 由於製造過程的不均一性, 不同批號的靈敏度會有一定差異, 當大批量使用時, 這種差異影響是非常大的, 那麼就要按照靈敏度表現將不同批號的膜進行分類. 在膜的STOCK中要能夠輕易的分辨出來. 當進入後期生產調用時, 就能根據這些分類, 按照訂單要求取用不同批號的膜, 或者用強靈敏度的原料和差靈敏度的膜來搭配.
關於膜的批內差. 批內差是肯定存在的,只是差距大小的問題,依據一般的測試條件是很困難獲得詳細的數值,因為你不可能對每一卷膜的每一段都做詳細的測試. 減小膜批內差的最有效方法是不購入邊緣膜帶. 前面說過膜的生產方式,生產出的半成品是寬幅很大的一個膜面,要通過截面裁切才能獲得25mm或者20mm的寬度.那麼就有中間部分,和邊緣部分之分.越靠近中間部分,膜的均勻性越好,邊緣部分則相對要差,就造成了批內差. 一般可以通過COA獲得具體位置信息,例如MILLIPORE就在切割後用字母A,B,C……來表示切出的窄膜在寬幅膜中的位置.
如果是試用某個型號的膜小樣, 還需要在以上檢測後加入膜加速老化試驗. 包括膜單獨的老化試驗和點好膜後產品的老化試驗, 具體試驗方法請參看我以前寫的研發思路一文.

⑥ 硝酸纖維素膜的應用技巧

從本節開始,我們開始對膜進行深入討論和談一些應用技巧.
1. 蛋白與膜的結合原理
蛋白與膜的結合原理, 已知的結合力包括疏水作用力H鍵靜電作用力等,確切的結合原理並不明確,主要靠假說來支撐.主要有兩種假說:
1) 首先兩者靠靜電作用力結合, 然後靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合.
2) 首先兩者靠疏水作用結合, 然後靠靜電作用來維持長時間結合.
兩條假說, 都表明其結合過程分為兩步, 首先結合和後面長時間結合.由於結合原理的不明確性, 導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗.
2. 膜對結合的影響
1)膜孔徑
有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜,但是請注意這只僅僅限於同一廠家的產品,如果是不同廠家的產品,這種比較是無意義的. 膜孔徑與層析速度的關系,已在上文描述.
隨著膜孔徑減小,膜的實際可用表面積遞增,膜結合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數為表面積比率(實際可用表面積與所用膜平面積的比率).
另外, 膜孔徑越小,層析速度也越小,那麼金標復合物通過T線的時間也就越長,反應也就越充分.
綜合以上兩點,結論為膜孔徑越小靈敏度越高.但是同時也減慢了跑板速度,增加了非特異性結合的機會,也就是假陽性越高.所以要按照試驗結果挑選適合實際項目的膜,找到合適的平衡點.
2)不同廠家的膜差異
這個差異主要來源於兩點:
1> 生產膜時,使用的聚合物和表面活性劑的來源,類型,數量不同.同理,在膜處理中這兩類物質一般會對性能產生較大影響.
2> 處理過程不同.
3. 生物原料,緩沖溶液的試劑和配方
1) 生物原料, 作為CT線的生物原料使用情況各異,所以這里只做略述.
首先,單克隆抗體與膜的結合優於多克隆抗體, 主要時由於多克隆抗體有很多不同的表面位點, 而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別, 毫無疑問就增加了優化難度.
其次,分子量越大,蛋白越難結合到固相材料上.
2)緩沖液
大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方,包括緩沖液,封閉液等等處理溶液配方.
其實我也無法提供給你一個萬用配方清單. 因為不同的反應體系需要不同的配方來支持, 而不同機構的反應體系又有差異. 想獲」魚」先學」漁」. 為了不誤導大家,我在下面涉及到配方的問題上,僅提供思路,具體配方請自己摸索.
緩沖液的構成一般是: PBS(或其他緩沖體系)+作用物質(針對某一特定問題)+PH調整. 我在參考過以前的各種資料後,個人意見為配方原則為宜簡不宜繁,根據自己的需要添加作用物質,原來的很多需要添加的作用物質,由於膜製造技術的改進已經不再需要.
推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2, 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應性.
作用物質的情況大致羅列如下:
少量NACL,減少信號強度,消假陽.
有機醇(甲醇,異丙醇等),潤濕膜,減少膜帶有的靜電,利於結合包被.個人不推薦,因制膜工藝改進.
表面活性劑(TW20,TX100),增加親水力,可避免線條中空現象,也可增色.
糖,保護劑,減緩老化速度,也可以增加親水力同上.
調PH到某個位置,可以消假陽.
4. 點樣環境
環境濕度對點膜過程非常重要.最佳濕度一般在45-65%.
濕度過低,膜上容易聚集靜電荷,點膜容易出現散點,導致測試會出現疏水斑.
濕度過高,膜上毛細作用加強,點膜容易引起CT線變寬甚至擴散.
為了保證點樣時膜濕度的均一性,一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間.
5. 點樣儀器與膜面情況的關系
目前有兩種點樣方式,劃膜式和非接觸點膜式.非接觸點膜式優於劃膜式,進口劃膜式優於國產劃膜式.
因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面,而膜本身的物理性質為軟脆,劃管會在其表面留下印痕.進口的劃膜機由於使用的材料和控制系統較好,所以留下的劃痕較輕,而國產儀器較差,留下的劃痕也就比較嚴重. 劃痕容易對層析的金標復合物形成阻力,導致假陽性. 同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線(鬼線),而跑板結束後鬼線消失的奇怪現象.
6. 膜的寬度與點樣位置
膜的寬度一般有18mm(or 20mm)和25mm兩種, 分別使用在做測試條和做測試板上.
然而,不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度. 點樣位置上移,金標復合物通過T線位置時速度變慢,反應時間增加,靈敏度升高. 反之靈敏度降低. 這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性.
7. 溶液在膜上的擴散
溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ul/cm.
溶液在膜上的擴散是趨向兩端的,噴點上去的是均勻的抗體溶液,但當乾燥時線條邊緣的乾燥速度高於中間,中間的抗體會不斷向兩邊擴散,所以乾燥後抗體是向線條的兩端聚集的.一般情況下不影響你的試驗.如果你發現線條出現兩端紅,中間淡的現象,就要考慮這個問題了.可以加如上面說的作用物質來解決.
8. 點膜前後的封閉作用
從供應商處購買回的膜基本上都是已經優化處理好的,直接點膜就可使用.然而我們還是經常會遇到關於封閉的討論.
其實封閉不象大家認為的那樣,一封閉什麼問題都解決了. 老問題走了新問題又來了,而且更麻煩,我要說的是慎用封閉.
我極其反對點膜前封閉的做法. 原因為廠家在生產膜時候,各種配方是混合加入原漿的.而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內,必然擾亂了膜內正常的物質分布.由此引發了許多問題,也降低了工作效率. 也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題,其實可以通過其他辦法來解決,封閉必然是下測.
我經常使用的封閉手法有兩種.
流動封閉,將作用物質處理在樣品墊上.
膜上定點封閉,將作用物質配成溶液噴點在膜的特定位置上. 該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭.可以將不合格的半成品大板重新復活.
只要是將封閉做在了膜上,就必然會對產品的穩定性造成影響.具體的影響程度要通過穩定性測試來評判.
9. 膜的儲存
剛生產出的膜一般含有5-10%的水分. 關於膜的老化機理,有個理論支持,不過爭議比較大. 理論認為:膜的老化是因為膜上的水分蒸發,使膜變得疏水,帶電荷並變脆. 儲存膜一般要求是避光,密封.過干或過濕都不利.在這種保存條件下,一般可以放置兩年. 但是如果膜上做了封閉處理,就要根據具體試驗情況來判斷了.
有些膜由於生產工藝的問題,使用後靈敏度會在一段時間內發生變化,遇到這種問題,就需要在點膜後放置一段時間,待穩定後方可進入調試生產.

⑦ 硝酸纖維素膜NC膜的應用技巧

從本節開始，我們開始對膜進行深入討論和談一些應用技巧。
1. 蛋白與膜的結合原理
蛋白與膜的結合原理， 已知的結合力包括疏水作用力H鍵靜電作用力等，確切的結合原理並不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說：
1）首先兩者靠靜電作用力結合，然後靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合。
2）首先兩者靠疏水作用結合，然後靠靜電作用來維持長時間結合。
兩條假說，都表明其結合過程分為兩步，首先結合和後面長時間結合。由於結合原理的不明確性，導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗。
2. 膜對結合的影響
1）膜孔徑
有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜，但是請注意這只僅僅限於同一廠家的產品，如果是不同廠家的產品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關系，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數為表面積比率（實際可用表面積與所用膜平面積的比率）。
另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那麼金標復合物通過T線的時間也就越長，反應也就越充分。
綜合以上兩點，結論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結合的機會，也就是假陽性越高.所以要按照試驗結果挑選適合實際項目的膜，找到合適的平衡點。
2）不同廠家的膜差異
這個差異主要來源於兩點：
1> 生產膜時，使用的聚合物和表面活性劑的來源，類型，數量不同。同理，在膜處理中這兩類物質一般會對性能產生較大影響。 2> 處理過程不同。
3. 生物原料，緩沖溶液的試劑和配方
1）生物原料， 作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這里只做略述。
首先，單克隆抗體與膜的結合優於多克隆抗體，主要時由於多克隆抗體有很多不同的表面位點，而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別，毫無疑問就增加了優化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結合到固相材料上。
2）緩沖液
大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方，包括緩沖液，封閉液等等處理溶液配方。
其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應體系需要不同的配方來支持， 而不同機構的反應體系又有差異。想獲」魚」先學」漁」.。為了不誤導大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。
緩沖液的構成一般是：PBS（或其他緩沖體系）+作用物質（針對某一特定問題）+PH調整. 我在參考過以前的各種資料後，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據自己的需要添加作用物質，原來的很多需要添加的作用物質，由於膜製造技術的改進已經不再需要。
推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2， 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應性。
作用物質的情況大致羅列如下：
少量NACL，減少信號強度，消假陽。
有機醇（甲醇，異丙醇等），潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利於結合包被。個人不推薦，因制膜工藝改進。
表面活性劑（TW20，TX100），增加親水力，可避免線條中空現象，也可增色。
糖，保護劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。
調PH到某個位置，可以消假陽。
4. 點樣環境
環境濕度對點膜過程非常重要。最佳濕度一般在45-65%。濕度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現散點，導致測試會出現疏水斑。濕度過高，膜上毛細作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴散。為了保證點樣時膜濕度的均一性，一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。
5. 點樣儀器與膜面情況的關系
目前有兩種點樣方式，劃膜式和非接觸點膜式.非接觸點膜式優於劃膜式，進口劃膜式優於國產劃膜式。
因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質為軟脆，劃管會在其表面留下印痕.進口的劃膜機由於使用的材料和控制系統較好，所以留下的劃痕較輕，而國產儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴重。 劃痕容易對層析的金標復合物形成阻力，導致假陽性。 同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線（鬼線），而跑板結束後鬼線消失的奇怪現象。
6. 膜的寬度與點樣位置
膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種， 分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標復合物通過T線位置時速度變慢，反應時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。
7. 溶液在膜上的擴散
溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當乾燥時線條邊緣的乾燥速度高於中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴散，所以乾燥後抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發現線條出現兩端紅，中間淡的現象，就要考慮這個問題了。可以加如上面說的作用物質來解決。
8. 點膜前後的封閉作用
從供應商處購買回的膜基本上都是已經優化處理好的，直接點膜就可使用.然而我們還是經常會遇到關於封閉的討論。其實封閉不象大家認為的那樣，一封閉什麼問題都解決了. 老問題走了新問題又來了，而且更麻煩，我要說的是慎用封閉。我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產膜時候，各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內，必然擾亂了膜內正常的物質分布。由此引發了許多問題，也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題，其實可以通過其他辦法來解決，封閉必然是下測。
我經常使用的封閉手法有兩種：流動封閉，將作用物質處理在樣品墊上。膜上定點封閉，將作用物質配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭，可以將不合格的半成品大板重新復活。只要是將封閉做在了膜上，就必然會對產品的穩定性造成影響，具體的影響程度要通過穩定性測試來評判。
9. 膜的儲存
剛生產出的膜一般含有5-10%的水分。關於膜的老化機理，有個理論支持，不過爭議比較大。理論認為：膜的老化是因為膜上的水分蒸發，使膜變得疏水，帶電荷並變脆。儲存膜一般要求是避光，密封，過干或過濕都不利。在這種保存條件下，一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理，就要根據具體試驗情況來判斷了。有些膜由於生產工藝的問題，使用後靈敏度會在一段時間內發生變化，遇到這種問題，就需要在點膜後放置一段時間，待穩定後方可進入調試生產。
硝酸纖維素膜NC膜
規格: 15X20cm
孔徑: 0.45μm
保存: 5-15℃密封保存,保質期一年
產品簡介: 本品外觀潔白，膜正面呈光澤，與水接觸應立即浸潤，不能立即浸潤老者視為失活，不能點樣，膜面有花斑或有粉性結構皆視為次品。用於轉移電泳，宜選孔經0.22或0.45，以保證膜的強度，並減少穿透損失，硝纖膜過份乾燥時脆,濕時有彈性，操作時室內應保持中常溫度，避免過份乾燥，防止發脆，本品靜電吸附膜的親水性好，滲濾時間適中，蛋白吸附力強，轉膜的蛋白集中而不擴散，顯色的靈敏度和特異性高，背景低。

⑧ 硝酸纖維素膜的介紹

硝酸纖維素膜又稱為NC膜， 在膠體金試紙中用做C/T線的承載體，同時也是免疫反應的發生處。所以NC膜成為該試驗中最重要的耗材。

⑨ 硝酸纖維素膜的作用

硝酸纖維素膜又稱為NC膜, 在膠體金試紙中用做C/T線的承載體,同時也是免疫反應的發生處.

⑩ 為什麼western blot 中的硝酸纖維素薄膜用前要用甲醇浸泡

為了活化膜上的正電基團，使之更容易跟帶負電的蛋白質結合