『壹』 在石蠟切片HE染色過程中，切片標本為什麼要經過固定，脫水，包埋和染色等過程
首先，固定使標抄本中蛋白襲質等物質變性，在後期處理中，不會改變形態及性質；脫水：在用石蠟包埋使，如果標本中含有水，石蠟就不能浸入標本中，所以，脫水一方面是使下一步包埋石蠟浸入標本，另一方面是為了染色，水會使染色劑稀釋或失色；包埋：在切片時，之所以標本能夠切成薄薄的一片，就是標本中浸入了石蠟，有了與石蠟相似的性質，能夠切成很薄的一片；染色是為了用顯微鏡觀察標本，如不進行染色，在標本切成很薄的片後，在顯微鏡下是透明的，不能觀察。
『貳』 石蠟切片免疫組化組織脫水透明可以用氯仿嗎
光學顯微標本的製作技術【實驗目的】了解光學顯微鏡切片製作技術的基本方法步驟。【實驗原理】採用光學顯微鏡研究一般生物體的內部結構，在自然狀態下是無法觀察清楚的，多數動、植物材料都必須經過某種處理，將組織分離成單個細胞或薄片，光線才能通過細胞。為了適應這個需要，就產生了光學顯微鏡製片技術。光學顯微鏡的製片技術方法可分為兩大類：一類是非切片法，另一類是切片法。非切片法，是用物理或化學的方法，使細胞彼此分離，如有分離法、塗布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡單，能保侍細胞的完整，但是細胞之間的正常位置往往被更動，無法反映細胞之間的正常聯系。它可以與切片法配合使用，各取其長處。切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁復。在製作過程中，還要經過一系列的物理和化學的處理，這些處理方法可根據各種不同材料的性質要求進行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術復雜，但是，它最能保持細胞間的正常的相互關系，能較好和較長時間地保留細胞的原貌，所以仍然是光學顯微鏡的主要製片方法。【實驗儀器、材料和試劑】（一）儀器：石蠟切片機、恆溫蠟箱、載玻片、蓋玻片（二）材料：洋蔥根或小鼠肝（三）試劑：乙醚、無水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、正丁醇、二甲苯、石蠟、甘油、雞蛋、紗布、加拿大樹膠、麝香草酚【方法與步驟】光學顯微鏡切片製作技術最簡單的切片法是徒手切片，但是由於組織塊往往十分柔軟，18切削很困難，而且無法得到十分菲薄的切片，因此必須先用某些特殊物質滲入組織塊的內部起支持作用，並將整個組織塊包住，然後再用精密的切片機製作切片，才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法，包埋的物質稱為包埋劑。常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等，水和塑料也可作為包埋劑。根據包埋劑的不同，分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長處，可以根據需要選用，但是使用得最多的還是石蠟切片技術。石蠟作為包埋劑，有其獨特的優點，例如：石蠟能切出極薄的蠟片（2～10μm）；切片時能連成蠟帶，便於製作連續切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長期保存。然而石蠟切片的製作過程較長，步驟很多，一步不慎往往導致前功盡棄，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時受濕度影響比較大，這些不足之處必須在製片過程中認真對待，盡量減小它的不良影響。石蠟切片的製作過程主要包括：取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。1．取材材料的好壞直接影響到切片的質量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。（1）植物材料選擇時須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或將動物殺死後迅速取出所需要的組織。（2）取材必須新鮮，這一點對於從事細胞生物學研究尤為重要，應該盡可能割取生活著的組織塊，並隨即投入固定液。（3）切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷。（4）切取的材料應該小而薄，便於固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。2．固定組織和細胞離開機體後，在一定時間內仍然延續著生命活動，會引起病理變化直至歸於死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態，必須盡早地用某些化學葯品迅速地殺死組織和細胞，阻抑上述變化，並將結構成分轉化為不溶性物質，防止某些結構的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會使組織適當硬化以便於隨後的處理，還會改變細胞內部的折射系數並使某些部分易於染色。固定劑的作用對象主要是蛋白質，至於其他成分如脂肪和糖，在一般製作時不加考慮，如要觀察這些物質，可用特殊的方法將其固定下來。固定劑的作用表現在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質而定，同樣一種固定液對某一材料來說是良好的，但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特徵是：穿透組織的速度快。，能將細胞中的內含物凝固成不溶解物質，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細胞內含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存劑作用。固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。簡單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質都不凝固。簡單固定劑的局限性較大，如將其適當混合，製成復合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固定劑的種類甚多，我們必須依據各種固定劑的性能及製片的不同要求來加以選擇。19固定時，須注意以下幾點：（1）固定劑應有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鍾，再移入水溶性的固定液。（3）材料固定後如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。（4）固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強，作用時間應嚴加控制，不能過長。（5）一般固定劑都以新配製的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合並者，一定要在使用前才混合。（6）固定完畢，根據所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉澱，影響以後組織塊的染色。3．脫水生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時石蠟無法滲入組織內部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水後必須再經過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水後即可直接透蠟。常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易於得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮，脫水步驟應從低到高以一定的濃度梯度來進行，一般組織從30％乙醇開始，經過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對於一些柔軟的組織應從15％開始。脫水時間依據組織的類型和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應使材料停留在70％乙醇中，因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時間不能過長，另外，脫水必須在有蓋瓶中進行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可加入等量的甘油。丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇相同，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。甘油常用於藻類、菌類及柔弱材料的脫水。二氧六環為無色的石蠟溶劑，對組織沒有收縮及硬化等不良後果，但其蒸氣有毒，使用時須小心。正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優點是很少引起組織塊的收縮與變脆。叔丁醇的性質、作用和用法同於正丁醇，但因其價格昂貴而很少使用。4．透明組織塊用非石蠟溶劑脫水後必須經過透明。透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑後，石蠟便能順利地滲入組織。透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲苯作用較快，透明力強，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時若脫水不凈，就會引起不良後果，在應用時必須特別小心。通常將組織塊先經純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進入純二甲苯，這樣可減少上述的缺點。透明時間應由組織大小而定，—般各級停留時間在30min至2h，在純二甲苯中應更換2次，總時間則以不超過3h為宜。材料經過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現透明狀態，如組織中有白色雲霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時，應避免其揮發和吸收空氣中的水分，並保持其無水狀態。20甲苯的一般性質與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點較低，透明較慢，但不會使組織變脆。苯的用法同於二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適於大塊組織的透明。5．透蠟和包埋包埋用的石蠟，熔點在50～60℃之間，應根據材料本身的硬度、切片的厚薄和當時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。石蠟的優劣與切片的成敗密切相關。鑒別石蠟質量的方法是：將石蠟熔化後倒入紙盒使其凝結且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點出現，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細粒。這種石蠟即為品質優良。含有雜質的新蠟或用過的廢蠟可清潔後再用，方法是將石蠟放入鍋內，加熱到開始冒白煙，然後用小火繼續加熱30min（注意別超過發火點），使其去除水分和揮發性雜質，並在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。透蠟須在恆溫箱中進行，恆溫箱的溫度調節至高於石蠟熔點3度，使經過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應處理2～3次，透蠟的時間依材料性質而定，一般每次需15～30min。透明的關鍵是控制溫度的恆定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟凝固無法滲透，溫度過高使組織收縮發脆。包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先准備好紙盒（具體折法見圖1-3及說明），將熔蠟倒入盒內，迅速用預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟凝固後立即將紙盒按入水中，使其迅速冷卻凝固，30min後取出。包埋用蠟的溫度應略高於透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會產生結晶。以後切片時引起碎裂。6．切片（1）石蠟塊的固著與整修在包埋以後，就可進行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機進行切片前還須進行固著和整修。固著：一般旋轉式切片機上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤，這也可用同樣大小的台木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼於固著物上，並使組織塊朝外，便於以後迅速切出所需的片子。整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便於在蠟帶上識別切片。（2）切片機和切片刀切片機是用來作各種組織切片的一種專門設計的精密機械，常用的是旋轉式切片機，它的夾物部分是上下移動前後推進的，而夾刀部分則固定不動。主要部件是安裝切片刀的刀台、安裝包埋塊的標本台和控制切片厚度的微動裝置。切片時切片刀固定不動，轉動轉輪，標本台上下運動並按調好的切片厚度向前推進一定的距離，組織塊上下運動一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。切片刀與切片的質量直接相關。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢後應及時用二甲苯將石蠟油擦凈。（3）切片方法切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削。將所要切的包埋塊固定在標本台上，使包埋塊外切面與標本夾截面平行，並讓包埋塊稍露出一截。將刀台推至外緣後松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調節切片要求的厚度，調節時應注意指針不可在兩個刻度之間，否則容易損傷切片機，將刀台移至近標本台處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時就可以開始切片了。方法是：右手轉動轉輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，並托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度後，右手停止轉動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放於襯有黑紙的紙盒內，注意切片速度不宜太快，搖動轉輪用力應均勻，防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻，還應注意轉動的方向，以防標本台後移而切不到片子。切片完畢，應及時用氯仿將切片機的有關部分擦凈。（4）切片中存在的問題及補救方法石蠟切片是很不容易掌握的，有時很容易成功，有時則由於某種因素而造成切片的質量低劣，甚至完全失敗。現將切片時經常遇到的一些缺點、可能的原因以及補救法列於表1-3。表1-3石蠟切片可能產生的問題和解決方法缺點：石蠟帶彎曲不直原因：1．石蠟塊上下兩邊不平行2．石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行3．刀口鋒利不一，局部產生差異4．蠟塊的一邊較另一邊為軟，或兩邊的硬度不一致5．材料未居蠟塊正中央6．材料大而形不正補救法：1．取下台木，將兩邊修干2．調節標本台，使兩者平行3．移動刀片，改用新的刀口4．待蠟塊冷卻後再切，或重新包埋5．用刀片切去部分石蠟，使材料居中6．在大的一邊切去少許石蠟缺點：切片分離、不能連成帶狀原因：1．室溫過低2．石蠟過硬3．材料邊緣留蠟太少4．刀的角度不適合補救法：1．在切片機上方開一電燈或提高室溫2．在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指蠟摩擦塊面3．重新包埋4．矯正刀的角度缺點：切片捲起呈圓筒狀原因：1．室溫過低2．石蠟過硬3．刀口太鈍4．刀的傾角太大補救法：1．提高室溫2．加軟蠟3用毛筆將蠟片攤開壓住，切2—3片即成帶4．減小傾角缺點：切片粘附於切片刀，皺摺在一起原因：1．室溫過高2．石蠟過軟3．刀口上留有一層石蠟4．刀口鈍補救法：1．降低室溫2．將蠟塊投入涼水中稍浸耒—增加3．切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟4．磨刀或移動刀口缺點：切片縱裂原因：1．刀有缺口2．石蠟塊中含有顆粒、雜質3．刀口留有碎屑或細絲4．組織太硬補救法：1．可移動刀口2．將顆粒拽去3．清潔刀口4．讓包埋塊在水中浸泡缺點：切片有橫紋原因：1．刀和台木的固定螺絲太松2．刀口傾斜度太大3．刀口有石蠟屑補救法：1．旋緊螺旋2．可放平1—2。後再切3．用氯仿拭去缺點：切片厚薄不勻原因：1．切片機有毛病2．夾刀不當3，未旋緊標本台螺旋4。石蠟塊過硬補救法：1．矯正切片機裝置2．對症治療3．旋緊螺旋4．將石蠟塊在水中浸泡缺點：每張切片厚薄不勻原因：1．刀口震動，是由於材料過硬2．刀的傾角太大補救法：1。在蠟塊表面塗一層火棉膠2．減小傾角缺點：材料發生裂隙破碎或脫落原因：1．脫水不幹凈2．有透明劑殘留3．石蠟透入時，溫度過高或時間過長4．由於脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發脆5．材料太硬或太粗補救法：1．無法彌補2．增加浸蠟時間，重新包埋3．無法補救4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六環等進行脫水和透明5．在蠟塊表面塗一薄層火棉膠溶液缺點：切片時發生沙沙聲原因：1．組織塊過硬2．包埋溫度過高3，材料內留有結晶體補救法：1．浸泡水中軟化2．無法補救3．無法補救缺點：石蠟塊將蠟帶抬起原因：1．由於摩擦而產生靜電荷所致2．石蠟塊上面附有石蠟碎屑3．刀口上附有石蠟碎屑補救法：1．提高室溫2．用刀片將碎屑清除3．用二甲苯或氧仿清除7．貼片切好的切片必須貼附於載玻片上才能作進一步處理，但是切片常有細小的橫紋，必須經展平後才能貼附，否則影響染色和觀察。貼片一般有撈片法和燙板法。撈片法比較簡單，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時切片都浮在水面上，由於表面張力的作用使切片自然展平，然後用塗有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個打破入杯中，去除蛋黃留下蛋白，用筷子充分調打成雪花狀泡沫，然後用雙層紗布過濾至容器中，加入等量的甘油，混合，最後加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存幾個月到一年。）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，於室溫下放置一晝夜後使其徹底乾燥。燙板法，是將塗有粘片劑的載玻片上塗上水，把已分割好的切片貼上去，再置載玻片於35℃恆定的燙板上讓切片攤干，並傾斜或用吸水紙吸去水分，最後將載玻片再度放燙板上晾乾。要注意，不管是使用撈片法還是燙板法，所用的載玻片必須潔凈，不能有油污（檢驗法：已塗有粘片劑的載玻片上滴加數滴蒸餾水，若發現水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應朝下，否則染色過程中切片容易脫落。8．染色組織切片是無色透明的，必須進行染色後才能觀察到各種微細結構。染色方法很多，但是染色劑往往是水溶液，因此切片必須經過脫蠟而再度復水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由於切片十分菲薄，處理的時間大大減少，一般每級停留約2～5min。染色是一個復雜的過程，兼有物理和化學作用，對其中的機制目前了解得不很清楚。研究細胞器和細胞內的重要組分都有很多現成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應，顯示RNA的Brachet反應，顯示多糖的PAS反應，顯示蛋白質的Millon反應和顯示某些酶的鈣—鈷法等，可以根據不同的要求來選用。9．透明染色後的切片須再次經過脫水、透明。標本經二甲苯透明後，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。10．封藏封藏的目的是使製成的切片能夠永久保存，封藏劑必須能與透明劑互溶，對染色無影響，折射率近似玻璃和具有粘性的物質，常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。封片的方法是：將載玻片從二甲苯中吸出後，吸去多餘的二甲苯，在標本上的二甲苯尚未乾透之前加一滴樹膠，仔細覆蓋上蓋玻片，避免產生氣泡，也不得拖動蓋玻片，以免將標本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定，勿使過多過少。貼上標簽，註明材料、染色法，待封藏劑凝固後便成為一張成功的石蠟切片。
『叄』 我在做石蠟切片，把胚胎包埋在1.5%瓊脂里，然後脫水，分別是10%，30%，50%，70%，80%
說明
石蠟切片法包括取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與貼片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟。一般的組織從取材固定到封片製成玻片標本需要數日，但標本可以長期保存使用，為永久性顯微玻片標本。
取材
應根據要求選取材料來源及部位。例如植物細胞有絲分裂多選取洋蔥根尖，細胞分裂快又便於切取；豬的肝小葉邊界清晰明確；耳蝸以豚鼠的內耳易於定位和剝離。材料必須新鮮，擱置時間過久則產生蛋白質分解變性，導致細胞自溶及細菌的滋生，而不能反映組織活體時的形態結構。
固定
用適當的化學葯液——固定液浸漬切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉澱細胞和組織中的物質成分、終止細胞的一切代謝過程、防止細胞自溶或組織變化，盡可能保持其活體時的結構。固定能使組織硬化，有利於切片的進行，而且也有媒浸作用，有利於組織著色。固定液的種類很多，其對組織的硬化收縮程度以及組織內蛋白質、脂肪、糖類等物質的作用各不相同。例如純酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般組織，但溶解肝糖和色素。固定液可分為單一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蟻醛、福爾馬林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、鋨酸（四氧化鋨）、重鉻酸鉀及苦味酸等，單一固定液不能固定細胞中的所有成分；混合固定液可以互補不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方見有關技術書籍）。因此，應根據所要顯示的內容來選擇適宜的固定液。10%福爾馬林（4%甲醛）或10%磷酸緩沖福爾馬林是病理切片常規使用的固定液，不僅適用於常規H精-伊紅）染色，還可以用於組織學有關的其他技術的切片染色。固定液的用量通常為材料塊的20倍左右，固定時間則根據材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以從1小時至數天，通常為1小時至24小時。
洗滌與脫水
固定後的組織材料需除去留在組織內的固定液及其結晶沉澱，否則會影響後期的染色效果。該步驟稱作洗滌多數用流水沖洗；使用含有苦味酸的固定液固定的則需用酒精多次浸洗；使用酒精或酒精混合液固定的組織，則不必洗滌，可直接進行脫水。固定後或洗滌後的組織內充滿水分，若不除去水分則無法進行以後的透明、浸蠟與包埋處理，原因在於透明劑多數是苯類，苯類和石蠟均不能與水相融合，水分不能脫盡，苯類無法浸入。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混。為了減少組織材料的急劇收縮，應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行，通常從30%或50%酒精開始，經70%、85%、95%直至純酒精（無水乙醇），每次時間為1～數小時，如不能及時進行各級脫水，材料可以放在70%酒精中保存，因高濃度酒精易使組織收縮硬化，不宜處理過久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環等也可做脫水劑。
透明
純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現透明狀態，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。通常組織先經純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1～2小時，再轉入純透明劑中浸漬。透明劑的浸漬時間則要根據組織材料塊大小及屬於囊腔抑或實質器官而定。如果透明時間過短，則透明不徹底，石蠟難於浸入組織；透明時間過長，則組織硬化變脆，就不易切出完整切片，最長為數小時。
浸蠟與包埋
用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時，再先後移入2個熔化的石蠟液中浸漬3小時左右，浸蠟應在高於石蠟熔點3℃左右的溫箱中進行，以利石蠟浸入組織內。浸蠟後的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中（擺好在蠟中的位置），待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷卻，即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框盒。如果包埋的組織塊數量多，應進行編號，以免差錯。石蠟熔化後應在蠟箱內過濾後使用，以免因含雜質而影響切片質量，且可能損傷切片刀。通常石蠟採用熔點為56～58℃或60～62℃兩種，可根據季節及操作環境溫度來選用。
切片
包埋好的蠟塊用刀片修成規整的四稜台，以少許熱蠟液將其底部迅速貼附於小木塊上，夾在輪轉式切片機的蠟塊鉗內，使蠟塊切面與切片刀刃平行，旋緊。切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當都直接影響切片質量，可用熱水或冷水等方法適當改變蠟塊硬度。通常切片厚度為4～7微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。
貼片與烤片
用粘附劑將展平的蠟片牢附於載玻片上，以免在以後的脫蠟、水化及染色等步驟中二者滑脫開。粘附劑是蛋白甘油。首先在潔凈的載玻片上塗抹薄層蛋白甘油，再將一定長度蠟帶（連續切片）或用刀片斷開成單個蠟片於溫水（45℃左右）中展平後，撈至玻片上鋪正，或直接滴兩滴蒸餾水於載玻片上，再把蠟片放於水滴上，略加溫使蠟片鋪展，最後用濾紙吸除
『肆』 小鼠肝組織石蠟切片具體怎麼做
一般來說是要的，但也要根據具體實驗要求決定（比如你要觀察一些什麼東西啦，對結構的完整性要求有多高啦）甲醛能固定一般組織，但溶解肝糖和色素。
注意：1.材料必須新鮮，擱置時間過久則產生蛋白質分解變性，導致細胞自溶及細菌的滋生，而不能反映組織活體時的形態結構。
2.固定液的種類很多，其對組織的硬化收縮程度以及組織內蛋白質、脂肪、糖類等物質的作用各不相同。例如純酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般組織，但溶解肝糖和色素。固定液可分為單一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蟻醛、福爾馬林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、鋨酸（四氧化鋨）、重鉻酸鉀及苦味酸等，單一固定液不能固定細胞中的所有成分；混合固定液可以互補不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方見有關技術書籍）。
過程：
1.取材
2.固定
3.洗滌與脫水
4.透明
5.浸蠟與包埋
6.切片
7.貼片與烤片
8.切片脫蠟及水化
9.染色
10.切片脫水、透明和封片
切片刀的銳利與否、蠟塊硬度適當都直接影響切片質量，可用熱水或冷水等方法適當改變蠟塊硬度。通常切片厚度為4～7微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。
『伍』 跪求，真的很感謝 ，石蠟切片製作中 ，封片前制好的切片需要再次脫水嗎。為什麼
需要。
切片一系列工作完成後，就要進行染色和封片了。由於要染色的切片尚包在石蠟中，而所用的染色液都為水溶液，因此在染色之前，必須再度復水。與固定的組織塊脫水、透明的步驟相反，石蠟切片先在二甲苯中溶去石蠟，再經過各級酒精，下行至水。
染色後，如果組織片中有水分，則光不宜通透，在顯微鏡下觀察不清組織的結構，所以必須經過脫水。
給你我們學校的實驗講義看看吧～希望對你有幫助～有不懂的地方問我～
實驗一 石蠟包埋切片技術
實驗目的：1、學習石蠟包埋切片技術的基本原理和基本步驟；
2、掌握石蠟包埋切片技術。
實驗原理：
大家在生物學實驗時，曾經觀察過動物組織和植物組織的切片。通過光學顯微鏡，我們可以觀察到細胞內部的結構（例如細胞核、細胞質、肌肉組織的橫紋等）、細胞相互間的聯系以及組織的構成等。那麼，如何來製作這種切片呢？其過程是比較復雜的，我們利用3—4次實驗來學習組織切片的製作。
大家知道，我們要在顯微鏡下研究生物體的內部結構，在自然狀態下是無法觀察的，因為整個動、植物體大部分都是不透明的，不能直接在顯微鏡下觀察，一定要經過特殊的處理，使要觀察的材料先減少它的厚度和體積，使光線能透過才能用顯微鏡觀察。通常應用的有兩種方法：一種是非切片法，即用物理或化學的方法將生物體組織分離成為單個細胞或薄片，例如我們在生物學實驗曾做過口腔上皮的觀察、洋蔥鱗莖表皮的觀察。這種方法的不足之處在於細胞彼此間相互的聯系不一定觀察到。另外一種為切片法，即用刀將標本切成薄片。
非切片法比較簡單，一學就會，我們這里不作介紹。
切片法也分徒手切片法和切片機切片法。最簡單的切片法是將新鮮植物材料直接用刀切成薄片，稱之為徒手切片法。切片機切片法是用特殊的切片機來切片，切片的厚度可薄到幾個微米。因此，切片機的發明與應用也是細胞學誕生的重要因素。
切片機切組織用的也是刀（切片刀），所要切的組織要有一定的軟硬度，如刀切肉（新鮮、冷凍）。但大部分生物材料比較柔軟，所以為了能切出薄片，必須先使所切材料有一定的軟硬度。一些包埋劑可以達到這個目的，如石蠟，它融化時可滲入到組織內部；凝固時，使整個組織有一定的軟硬度，正好能切出很薄的切片，故稱為石蠟包埋切片法。另外還有火棉膠包埋切片法（火棉膠做包埋劑）、冰凍切片法（使組織冷凍到一定的硬度）等。其中最常用的切片方法還是石蠟包埋切片法，我們這里重點學習石蠟包埋切片技術。
實驗器材：
（一）小鼠、小廣口瓶、標簽、量筒、燒杯、95%酒精、無水酒精、蒸餾水、手術刀、剪刀、鑷子、平皿、石蠟塊、濾紙、甲醛液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。
（二）恆溫箱、融蠟、紙盒、燙板、支架、酒精燈、火柴、小鑷子、濾紙。（擦載玻片、磨刀、液體石蠟）。
（三）手術刀、木板、酒精燈、火柴、鋸條、木塊、塑料板、切片刀、切片機、毛筆、小鑷子、載玻片、蛋白甘油、恆溫水浴箱、溫度計、大白盤。
實驗步驟：
製作小鼠肝、脾、腎、小腸等切片。
1、取材：取材是指從動物或植物體上割取所要觀察的組織材料，比如植物的莖、葉，動物的肝臟、小腸等。
取材時應注意以下幾點：
（1）新鮮：在割取材料時應愈快愈好，否則動植物體的細胞成分、結構及分布等就會發生改變。
（2）防止人為損傷：如生拉硬拽、擠壓等，以免出現人為損傷。
（3）大小：0.5 cm × 0.5 cm × 0.2cm。
2、固定：機體死亡或組織離體後，組織細胞由於血液供應停止，即可發生缺氧，導致生物氧化過程停止。相反，細胞內的無氧酵解酶類活躍，使組織內蛋白質、糖、脂肪降解，導致組織發生自溶。另外，組織也可因污染細菌而發生腐敗。因此，為了使細胞和組織結構保持生活時的狀態，必須進行適當的固定。固定的目的在於保存組織內細胞的形態、結構及其組成，使其與生活時相似。
固定組織的物質——固定劑——具有凝固或沉澱組織蛋白的作用，因此能抑制酵解酶類的活動和細菌的繁殖，從而呈現對組織的固定作用。
固定劑的種類很多，最常見的有乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀、氯化汞和鋨酸等8種。各種固定劑對蛋白質、脂肪、糖等作用不同，因此，單一的固定劑不能保存所有的成分，故多用混合固定劑。
各種書籍對固定劑的介紹特別多，如化學性質、固定的原理、固定組織的優缺點等，由於時間的所限，我們這里不作詳細介紹，僅介紹幾種常見的固定液及其配方和用途。
（1）10%福爾馬林液：1份甲醛液 + 9份蒸餾水
市場上出售的甲醛液約含37-40%的甲醛，10%福爾馬林液實際上僅含3.7-4.0%的甲醛。
適用范圍：各種組織。但是經10%福爾馬林液固定的組織，細胞核染色較好，而細胞質染色較差。
處理：組織塊一般固定16-24h，長時間亦可，甚至可用來長期保存組織塊。短時間固定的組織塊不需水洗，可直接轉入70%酒精脫水。
（2）Bouin氏液：苦味酸飽和水溶液（1.22%） 75ml （15）
甲醛液 25ml （5）
冰醋酸 5ml （1）
適用范圍：各種動物組織及植物組織的根尖，是動物組織良好的固定液。
處理：固定24h，也可在此液長期保存。流水沖洗或不經水洗直接入70%酒精脫水。
（3）Zenker氏液： 甲液：氯化汞（升汞） 5g
重鉻酸鉀 2.5g
硫酸鈉 1g
蒸餾水 100ml
乙液：冰醋酸 5ml
使用前將甲、乙兩液混合。
適用范圍:為一般動物組織的優良固定液，經其固定的組織，細胞核及細胞質染色頗為清晰。
處理：固定時間為16-24h，然後流水沖洗一夜以洗去氯化汞，再入70%酒精脫水。切片染色前要用碘液除去汞沉澱。
（4）Gendre氏液： 苦味酸飽和酒精液（8.96g/100ml95%酒精） 85ml
甲醛液 10ml
冰醋酸 5ml
適用范圍：用於檢查動物組織中的糖原（因為糖原溶於水）。
處理：固定3-6h，直接轉入95%酒精脫水。
（5）Carnoy氏液： 無水乙醇 60ml
三氯甲烷 30ml
冰醋酸 10ml
適用范圍：用於檢查動物組織的核酸、糖原等。
處理：固定2-6h，直接轉入95%酒精脫水。
還有多種多樣的其它固定液。固定液的選擇應根據所要固定的材料以及檢查的目的而定。
3、沖洗：材料自固定液中取出後，需立即沖洗，使其中所有的固定液全部除去，以妨礙染色。
有些固定液，如10%福爾馬林液、Bouin氏液固定的材料，若時間較短的話可不必沖洗。但時間過長亦需沖洗。
沖洗的方法：組織塊放在瓶內，膠管插入瓶內接通自來水，瓶口用紗布包住。流水沖洗一夜，即能達到沖洗的目的。
4、脫水：脫水的目的在於使組織中的水分完全除去。因為組織塊將來要在石蠟
中包埋，而水和石蠟是不相溶的。必須經過脫水後，才能進入包埋階段。
常用的脫水劑有乙醇、丙酮、正丁醇等，最常用的還是乙醇。利用脫水劑吸水的特性，在各級濃度脫水劑中逐漸吸取組織中的水分。乙醇脫水的過程一般從70%乙醇開始，經80%、90%、95%、100%（二次）而完成脫水過程。每向後轉移前，須先將組織塊上的液體用吸水紙吸干，以免影響後續乙醇的濃度。
脫水時應注意：（1）在高濃度或無水乙醇中，每級停留的時間不宜太長，否則可使組織收縮變脆，影響切片；（2）如需過夜，應停留在70%乙醇中，也可長期保存，可防止因時間倒不開而影響後續步驟。
5、透明：脫水後是否可以進入包埋呢？但因脫水劑與石蠟也不相溶，因此在包
埋前，需要一種既能溶於脫水劑又能溶於石蠟的物質——透明劑——來起中間置
換作用。
所以，透明的目的在於使組織中的乙醇或丙酮被透明劑所代替，以使石蠟能很順利地進入組織中。另外，還能增強組織的折光系數，故稱透明劑。
透明劑的種類很多，常用的有二甲苯、甲苯、苯等。二甲苯為最常用的透明劑，二甲苯能溶於醇及醚，亦為石蠟溶劑，但不溶於水，它的透明力很強。
透明過程：一般經過1/2二甲苯-1/2無水乙醇，兩次二甲苯。
透明徹底的標准：胃、腸、結締組織等比較透明；肝、腎、心、肌肉等組織呈暗紅色浸油狀態，則說明脫水、透明良好。如果組織進入二甲苯30min以後還不變色，或中心有白色，說明水分未脫凈，應返回無水乙醇繼續脫水。透明這一步至關重要，若透明時間不足，則石蠟進不去，不能切片；若透明時間過長，則使組織收縮變脆、變硬，切片易碎。這一步要靠經驗。
6、浸蠟：浸蠟就是將石蠟透入整個組織的過程。
所謂石蠟包埋切片法，是用石蠟來浸透、包埋組織塊，再進行切片和染色的
製片方法。
石蠟為最常用的包埋劑，有幾種不同熔點的石蠟，通常所用的石蠟的熔點為54-58℃。
浸蠟過程：在60℃的溫箱內已融化的石蠟中經兩次各1h，使石蠟浸透組織。
浸蠟時注意溫度不宜過高，浸蠟時間亦不宜過長，否則會引起組織變硬、變脆，影響切片。
7、包埋：包埋就是被石蠟浸透的組織連同溶化的石蠟，一起倒入一定形狀的器皿（如紙盒、平皿）中，然後使其凝固成蠟塊的過程。
包埋的過程：（1）折疊紙盒；
（2）用酒精燈加熱溫台及紙盒；
（3）往紙盒中倒入溶化的石蠟；
（4）放入組織塊，切面向下，並撥正位置；
（5）蠟塊凝固。
從取材到包埋是一個連續的過程，往往連續幾天，如果沒有計劃、沒有完善的安排，就有可能和其他上課時間發生沖突，或造成半夜出勤。有時單憑記憶，把前後順序顛倒或超過了規定時間，會造成實驗失敗。因此需預先編制一個日程表。
【建議時間】
乙醇脫水：70%：16：30
80%：第二天7：20
90%：9：20
95%：11：00
100%(Ⅰ):12:00
100%(Ⅱ):13:00
透明：1/2二甲苯-1/2無水乙醇：14：00
二甲苯（Ⅰ）：14：20
二甲苯（Ⅱ）：14：40
浸蠟：石蠟（Ⅰ）：15：00
石蠟（Ⅱ）：16：00
包埋：17：00
注意事項：（1）動作要迅速；（2）融蠟別滴到桌面、地上。
8、切片：在包埋後，就可以進行切片。在切片之前，還需對包埋好的組織塊進行修整，並貼附於木塊上，才能進行切片。
修塊：以每一組織塊為單位，用小刀將組織塊大體修成長方形或梯形，組織的周圍須留1-2mm寬的蠟邊。
固著：用酒精燈燒熱金屬片，將組織塊切面的對立面稍燙熔一下，並立即貼於木塊上。
切片機的構造：
切片機是用來做各種組織切片的一種儀器，其樣式很多，性能也不一樣，一般可分為兩大類型，即滑行式切片機與旋轉式切片機。我們使用的是旋轉式切片機。其主要結構分為3部分：（1）控制切片厚度的微動裝置；（2）供裝置切片刀的夾刀部分；（3）供裝置組織塊的夾物部分。旋轉輪每旋轉一次，微動裝置就按所調節好的切片厚度以水平方向將組織塊向前推進一片的厚度。
切片操作：
（1）固定切片刀：刀刃向上，保持水平。調好角度，一般在4-6度。
（2）固定組織塊。
（3）調整所需要的切片厚度：一般在6-10微米。
（4）移動持刀器，或拔開齒輪上的牽引鉤，前後轉動齒輪以移動組織塊固定器，調節組織塊表面和刀刃的距離，以剛要接近時為止。
（5）調整組織塊與刀刃之間的角度和位置：組織塊的切面及上下邊須與刀刃平行。
（6）粗切：右手搖輪，左手轉動齒輪，慢慢將組織塊切到組織本身。
（7）切片：右手轉動搖輪，轉一圈可切下一片，切第二片與第一片連在一起，即成連續切片。左手用鑷子或毛筆提起切片的下端，輕輕向自身方向拽，使切片成連續的帶狀。
（8）展片：停止切片，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶跳起，靠刀刃的一面向下，慢慢接觸40-45℃的水面，藉助水的表面張力使其在水面展開。如有小的皺褶，用小鑷子輕輕分開。應注意：水溫過高，易使切片全部融化；水溫過低，切片不宜伸展。
（9）貼片：即將切片貼在載玻片上。先將連續切片分成一片或小段。將載玻片1/2處均勻塗一層薄薄的蛋白甘油（等量的雞蛋清和甘油混合而成，防止脫片。切勿塗得過多！），將載玻片垂直插入水中，以塗有蛋白甘油的面貼近組織片，提起載玻片使組織片貼附在載玻片上。用小鑷子將切片擺在載玻片1/3和2/3的交界處，並擺正位置。然後在52-60℃恆溫箱烤乾。
整個石蠟包埋切片技術至此全部結束。
實驗二 蘇木精-伊紅染色
實驗目的：1、了解染色的基本原理和基本方法；
2、掌握蘇木精-伊紅染色方法。
實驗原理：
一、染料的一般知識
1、染料的染色原理：（1）化學作用：染料的性質有酸、鹼、中性之別，那麼組織中的鹼性部分（如細胞質）易和酸性染料親和而發生作用，組織中的酸性部分（如染色質）易和鹼性染料親和而發生作用。（2）物理作用：指吸附或溶解作用。組織蛋白和某些染料有相互吸附的作用。
2、媒染劑、促染劑和分化劑
媒染劑：某些天然染料（如蘇木精），本身無著色性，要與其他物質結合後才具有著色性，這些被結合的物質稱為媒染劑，如許多鐵鹽、鉻鹽及鉀鹽等。
促染劑：是促進染料著色性的物質，如冰醋酸是伊紅的促染劑。
分化劑：能使切片上需要顯示的結構清晰，而使不需要顯示的結構脫去顏色的物質。如1%鹽酸酒精。
一、蘇木精-伊紅染色（H.E染色）
所做出的石蠟包埋切片可應用的染色方法很多，應根據不同的檢查目的而選用不同的染色方法。而最為常用的染色法為H.E染色。
1、蘇木精(蘇木素、蘇木紫)（hematoxylin）：為從蘇木中提取。蘇木精本身不是染料，不能直接染色，必須經氧化才能染色。可以在空氣中自然氧化，但需時很長，所以一般都是加氧化劑（如碘酸鈉）氧化。同時，被染材料又須經媒染劑作用後才有著色能力，所以在配製蘇木精染液時，都加有媒染劑。蘇木精液主要著染細胞核。
有數種不同配方的蘇木精液。
Mayer(梅耶)氏蘇木精液：
蘇木素 1g
硫酸鋁鉀 50g （媒染劑)
碘酸鈉 0.2g
水合氯醛 50g
檸檬酸 1g
蒸餾水 1000ml
2、伊紅（曙紅）(eosin)：又分幾種，如伊紅Y、伊紅B等。
伊紅對細胞質、肌纖維、膠原纖維具有著色性。
一般用0.5%伊紅/70%乙醇液或1%伊紅水溶液。
由於蘇木精著染細胞核，伊紅著染細胞質，所以這種方法稱為雙重對比染色法。
實驗材料：石蠟切片、蓋玻片、小鑷子、大鑷子、樹膠、濾紙、紗布、染色缸、二甲苯、乙醇系列、Mayer氏蘇木精液、0.5%伊紅酒精液（或1%伊紅水溶液）、1%鹽酸酒精、蒸餾水、顯微鏡。
實驗步驟：
1、切片脫蠟、復水：
由於要染色的切片尚包在石蠟之中，而所用的染色液都為水溶液，因此在染色之前，必須再度復水。與固定的組織塊脫水、透明的步驟相反，石蠟切片先在二甲苯中溶去石蠟，再經過各級酒精，下行至水。
把玻片放入盛有二甲苯的染色缸中以溶去石蠟（20min），再經第二缸二甲苯（10min）。經100%、95%、90%、80%、70%各級酒精、蒸餾水入水，每級3-5min。
2、入蘇木精液染5-7min。
3、流水洗去附著染液，（在1%鹽酸酒精中蘸3-4下），然後流水沖洗20min使切片由淡紅色變為灰蘭色。
4、入伊紅染液5-7min。
5、脫水、透明：
如果組織片中有水分，則光不宜通透，在顯微鏡下觀察不清組織的結構，所以必須經過脫水。透明劑能增強組織的折光系數。這樣，才能在顯微鏡下觀察。
在70%、80%、90%的酒精中每級各蘸3—4下，再經95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ梯度酒精，每級各5min。在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中分別透明10min。
6、封片：
從二甲苯中取出載玻片，未等二甲苯揮發，在組織切片上滴加適量樹膠，上面再加蓋玻片（傾斜放下）封固。
封片目的：（1）便於保存；（2）應用合適折光率的封藏劑使組織結構能在鏡下很清晰地顯示出來。
結果：細胞核呈藍色至深藍色，細胞質呈淡紅色或紅色。
作業：1、為什麼生物體的組織要經過如此繁瑣的步驟才能觀察其組織結構？
2、查閱文獻，有哪些文章採用石蠟包埋切片和H.E.染色？
3、通過查閱文獻，談一下石蠟包埋切片和H.E.染色的用途。
『陸』 石蠟切片固定後50%脫水,時間不合適,再回去固定可以么
脫水時間不合適就脫到70-75%的酒精濃度，在酒精中保存就行了
『柒』 製作石蠟切片之前忘記脫水了有沒有什麼補救的辦法，實驗效果會有什麼影響
應該會有影響吧，為了實驗結果，還是重新做一次吧。那樣的結果會好一些的。
『捌』 石蠟切片最常用的脫水劑
該步驟稱作洗抄滌多數用流水沖洗；使用含有苦味酸的固定液固定的則需用酒精多次浸洗；使用酒精或酒精混合液固定的組織，則不必洗滌，可直接進行脫水。固定後或洗滌後的組織內充滿水分，若不除去水分則無法進行以後的透明、浸蠟與包埋處理，原因在於透明劑多數是苯類，苯類和石蠟均不能與水相溶合，水分不能脫盡，苯類無法浸入。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混。為了減少組織材料的急劇收縮，應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行，通常從30%或50%酒精開始，經70%、85%、95%直至純酒精（無水乙醇），每次時間為1～數小時，如不能及時進行各級脫水，材料可以放在70%酒精中保存，因高濃度酒精易使組織收縮硬化，不宜處理過久。
『玖』 為什麼用酒精進行石蠟切片脫水,而不是選用其他試劑
便宜，無毒，並且效果好
『拾』 肝臟組織存放太久補救方法
一定會的,組織裡面有水分,結冰會破壞裡面的細胞,HE染色一般是要進行石蠟切片吧,得先固定