滴定鹽酸蒸餾蛋白

A. 測蛋白質的含量

食品中蛋白質含量測定（凱氏定氮法）
（5009．5-2003食品中蛋白質含量測定）
一、目的與要求
1、學習凱氏定氮法測定蛋白質的原理。
2、掌握凱氏定氮法的操作技術，包括樣品的消化處理、蒸餾、滴定及蛋白質含量計算等。
二、實驗原理
蛋白質是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，留在消化液中，然後加鹼蒸餾使氨游離，用硼酸吸收後，再用鹽酸標准溶液滴定，根據酸的消耗量來乘以蛋白質換算系數，即得蛋白質含量。
因為食品中除蛋白質外，還含有其它含氮物質，所以此蛋白質稱為粗蛋白。
三、儀器與試劑
（一）試劑
1、硫酸銅（CuSO4•5H20）
2、硫酸鉀
3、硫酸（密度為1.8419g/L）
4、硼酸溶液（20g/L）
5、氫氧化鈉溶液（400g/L）
6、0.01mol/L鹽酸標准滴定溶液。
7、混合指示試劑：0.1%甲基紅乙溶液液1份，與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液5份臨用時混合。
8、黃豆粉。
（二）儀器
微量定氮蒸餾裝置：如圖3- 所示。

圖3- 微量凱氏定氮裝置
1、電爐； 2、水蒸氣發生器（2L平底燒瓶）；3、螺旋夾a；
4、小漏斗及棒狀玻璃塞（樣品入口處）；5、反應室；6、反應室外層；
7、橡皮管及螺旋夾b；8、冷凝管；9、蒸餾液接收瓶。
四、實驗步驟
1、樣品消化
稱取黃豆粉約0.3g（±0.001g），移入乾燥的100mL凱氏燒瓶中，加入0.2g硫酸銅和6g硫酸鉀，稍搖勻後瓶口放一小漏斗，加入20mL濃硫酸，將瓶以450角斜支於有小孔的石棉網上，使用萬用電爐，在通風櫥中加熱消化，開始時用低溫加熱，待內容物全部炭化，泡沫停止後，再升高溫度保持微沸，消化至液體呈藍綠色澄清透明後，繼續加熱0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷後，無損地轉移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻備用，即為消化液。
試劑空白實驗：取與樣品消化相同的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸，按以上同樣方法進行消化，冷卻，加水定容至100mL，得試劑空白消化液。
2、定氮裝置的檢查與洗滌
檢查微量定氮裝置是否裝好。在蒸氣發生瓶內裝水約三分之二，加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。
測定前定氮裝置如下法洗滌2~3次：從樣品進口入加水適量（約占反應管三分之一體積）通入蒸汽煮沸，產生的蒸汽沖洗冷凝管，數分鍾後關閉夾子a，使反應管中的廢液倒吸流到反應室外層，打開夾子b由橡皮管排出，如此數次，即可使用。
3、鹼化蒸餾
量取硼酸試劑20mL於三角瓶中，加入混合指示劑2~3滴，並使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夾a關閉，螺旋夾b開啟的狀態下，准確吸取10.0mL樣品消化液，由小漏斗流入反應室，並以10mL蒸餾水洗滌進樣口流入反應室，棒狀玻塞塞緊。使10mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應室，用少量水沖洗立即將玻塞蓋堅，並加水於小玻杯以防漏氣，開啟螺旋夾a，關閉首歷螺旋夾b，開始蒸餾。通入蒸汽蒸騰10min後，移動接收瓶，液櫻芹盯面離開凝管下端，再蒸餾2min。然後用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准備滴定。
同時吸取10.0mL試劑空白消化液按上法蒸餾操作。
4、樣品滴定
以0.01mol/L鹽酸標准溶液滴定至灰色為終點。
5、數據記錄
項 目 第一次 第二次 第三次
樣品消化液（mL）
滴定消耗鹽酸標准溶液（mL）
消耗鹽酸標准溶液平均值（mL）
五、結果計算

式中 X——樣品蛋白質含量（g/100g）；
V1——樣品滴定消耗鹽酸標准溶液體積（mL）；
V2——空白滴定消耗鹽酸標准溶液體積（mL）；
c——鹽酸標准滴定溶液濃度（mol/L）；
0.0140 ——1.0mL鹽酸 標准滴定溶液相當的氮的質量（g）；
m——樣品的質量（g）；
F——氮換算為蛋白質的系數，一般食物為6.25；乳製品為6.38；麵粉為5.70；
高梁為6.24；花生為5.46；米為5.95；大豆及其製品為5.71；肉與肉製品為
6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵5.30。
計算結果保留三位有效數字。
六、注意事項及說明
1、本法也適用於半固體試樣以及液體樣品檢測。半固體試樣一般取樣范脊和圍為2.00g~5.00g；液體樣品取樣10.0mL~25.0mL（約相當氮30mg~40mg）。若檢測液體樣品，結果以g/100mL表示。
2、消化時，若樣品含糖高或含脂及較多時，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產生。
3、消化時應注意旋轉凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數滴過氧化氫後，再繼續加熱消化至完全。
4、硼酸吸收液的溫度不應超過40℃，否則氨吸收減弱，造成檢測結果偏低。可把接收瓶置於冷水浴中。
5、在重復性條件下獲得兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%
七、思考題
1、預習凱氏定氮法測定蛋白質的原理及操作。
2、蒸餾時為什麼要加入氫氧化鈉溶液？加入量對測定結果有何影響？
3、在蒸汽發生瓶水中、加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸的作用是什麼？若在蒸餾過程中才發現蒸汽發生瓶中的水變為黃色，馬上補加硫酸行嗎？
4、實驗操作過程中，影響測定準確性的因素有哪些？

B. 試述蛋白質測定中，樣品消化過程中內容物顏色發生什麼變化為什麼

蛋白質測定是生物化學和分子生物學研究中最常告備用、最基本的分析方法之一。人體正常值一般是 60～80 g/L。消化前加硫酸是應將附著在瓶壁上的粉末仔細沖洗至瓶中，消化 過程中應注意轉動燒瓶，利用冷凝的酸液將附著在瓶壁上的炭粒沖下，以促_消化；

消化必須在通風櫥中_行，消化開始時文火加熱，以克液體竄出。消化時如果採用 直接火加熱，火焰丌能超過液面以上，否則可能引起燒瓶爆裂；

樣品消化液丌易 澄清透明時，可將燒瓶完全冷卻後加入30%過氧化氫2~3mol 後繼續消化，直至消化 液澄清透明呈藍綠色為止。

(2)滴定鹽酸蒸餾蛋白擴展閱讀：

准備4個50mL凱氏燒瓶並標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在帆坦每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物。

再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化，之後進行蒸餾，全部蒸餾完畢後用標准鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不幹擾顯色， Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。首先利用標准蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標准曲線。

將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，並用只加入硫酸鈉不含血清的試管作為對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑。

充分混合後於37℃環境態友桐中放置10分鍾，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，由標准曲線上直接查出蛋白質含量。雙縮脲法常用於0.5g/L～10g/L含量的蛋白質溶液測定。

C. 蛋白質含量測定

應該是問蛋白質含量測定的方法吧。方法有以下幾種：
1、直接測定UV法。
2、凱氏定氮法。
3、雙縮脲法。
4、酚試劑法。
5、紫外吸收法。
6、BCA法。
7、Lowry法。御團
8、考馬斯亮藍法。
9、Bradford法測定試劑盒。
蛋白質含量增高，常見於多發性骨髓瘤患者，主要是異常球鎮大橘蛋白增加；血漿濃縮也可使蛋白質含量增加仿滾，如急性脫水、外傷性休克、腎病等。

D. 蛋白質的測定方法

測定蛋白質含量的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、考馬斯亮藍法等。

2、雙縮脲法：是一種用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑呈藍色，是一種鹼性含銅測試溶液，它由幾滴1%硫酸銅，1%氫氧化鉀和燃握敬酒石酸鉀鈉製成。

3、考馬斯亮藍法：基本原理是基於蛋白質可以與考馬斯亮藍G-250定量結合。

E. 國家標准檢測蛋白質含量測定方法

蛋白質含量測定方法就是檢測元素的含量，像三聚氰胺的問題，就是通過增加N的含量使「蛋白質」含量提高的。

國家標准檢測蛋白質含量的方法叫做凱氏定氮法，食物中的蛋白質在催化加熱條件下分解，導致氨和硫酸結合產生硫酸銨。 鹼蒸餾採用無硫，硼酸吸收，用硫酸或鹽酸標准滴定溶液滴定，根據酸耗計算氮含量，再乘以轉化系數，即蛋白質含量。

具體操作步驟如下：

1.樣品處理

精確稱量0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸收10-20ml液體樣品（約30-40mg氮當量）。將其轉移至乾燥的100毫升或500毫升氮氣固定瓶中，加入0.2克硫酸銅，6克硫酸鉀和20毫升硫酸，輕輕搖動，在瓶口放置一個小漏斗，將瓶子傾斜石棉網上有45度角，有小孔。

加熱小火後，內容物碳化，泡沫完全停止，加強火力，保持瓶內液體稍微沸騰，直至液體呈藍綠色澄清透明，然後繼續加熱0.5小時。取出並冷卻，小心加入20毫升水，冷卻，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗凈氮氣瓶，洗凈液放入容量瓶中，然後用水沖洗至刻度，混勻備用。

取相同量的硫酸銅，硫酸鉀和濃硫酸作為試劑進行空白試驗。然而，這種方法很危險，很難在實驗室中證明。大多數實驗室都有一個消化器，可以一次處理16個以上的樣品和一個可以自行設定溫度的呼吸機。它更安全，更可操作。

(5)滴定鹽酸蒸餾蛋白擴展閱讀

除了凱氏定氮法以外，標準的測量方法還有：

• 分光光度法

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，分解產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙醯丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙醯-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm 下測定吸光度值，與標准系列比較定量,結果乘以換算系數，即為蛋白質含量。

• 燃燒法

樣品在900~1200℃下燃燒。在燃燒過程中，產生混合氣體。 諸如碳，硫和鹽的干擾氣體被吸收管吸收，氮氧化物被還原成氮。 形成的氮氣流由熱導檢測器（TCD）檢測。

F. 蛋白質中的含氮量是如何測定的

這是最經典的方法了——微量凱氏法
一、原理

植物組織中的有機氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和醯胺，以及少量無機氮化物，是可溶於三氯乙酸溶液的小分子。可加入三氯乙酸，使其最終濃度為5％，將蛋白質沉澱出來，分別測定總氮、蛋白氮或非蛋白氮；通常只測定總氮或蛋白氮。將植物材料與濃硫酸共熱，硫酸分解為二氧化硫、水和原子態氧，並將有機物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮轉變成氨，並進一步生成硫酸銨。為了加速有機物質的分解，在消化時通常加入多種催化劑，如硫酸銅、硫酸鉀和硒粉等。消化完成後，加入過量NaOH，將NH4+轉變成NH3，通過蒸餾把NH3導入過量的硼酸溶液中，再用標准鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復原來的氫離子濃度。滴定消耗的標准鹽酸摩爾數即為NH3的摩爾數，通過計算，可得出含氮量。
蛋白質是一類復雜的含氮化合物，每種蛋白質都有其恆定的含氮量，（約在14％～18％，平均約含氮16％）所以，可用蛋白氮的量乘以6.25（100／16＝6.25），算出蛋白質的含量。若以總氮含量乘以6.25，就是樣品的粗蛋白含量。試樣中若含有硝態氮時，首先要使硝態氮還原為銨態氮，可加入水楊酸和硫代硫酸鈉，使硝態氮與水楊酸數模在室溫下作用生成硝基水楊酸，再用硫代硫酸鈉粉使硝基水楊酸轉化為銨鹽。由於水楊酸與硫代硫酸鈉會消耗一部分硫酸，所以消化時的硫酸用量要酌情增加。

二、材料、儀器設備及試劑

（一）材料：各種乾燥、過篩（60～80目）的植物樣品

（二）儀器設備：1. 消化管；2. 微量凱氏定氮蒸餾裝置一套（圖17）；3. 三角燒瓶；4.微量滴定管；5. 量筒；6. 容量瓶；7. 燒杯；8. 移液管等。

三、實驗步驟

（一）樣品提取分離：准確稱取烘至恆重的樣品0.1000g～0.5000g（依樣品含氮量而定，含氮1～3mg宜），置10ml離心管中，加入5ml5％三氯乙酸，90℃水浴中浸提15min，不時攪拌，取出後用少量蒸餾水沖洗玻棒，待溶液冷卻後，4000rpm離心15min，上清液棄去。並用5％三氯乙酸洗沉澱2～3次，離心，棄去上清液，最後用蒸餾水將沉澱無損地洗入鋪有濾紙的漏鬥上，去掉濾液後，將沉澱和濾紙在50℃下烘乾，用於蛋白氮的測定。

（二）樣品的消化：取4支消化管編號。1號管直接放入稱好的材料用於測定總氮，2號管放入上述烘乾的濾紙和沉澱，用於蛋白氮的測定，3號管放入同樣濾紙一張、4號管不加任何樣品作為空白對照，注意將樣品放入消化管底部。向各消化管加濃硫酸5ml，混合催化劑0.3g～0.5g，將樣品浸泡數h或放置過夜後，在管口蓋一小漏斗，放在遠紅外消煮爐上加熱消化。開始時溫度可稍低，以防止內容物上升至管口。泡沫多時，可從小漏斗加入2～3滴無水乙醇。到管口出現白色霧狀物時，泡沫已不再產生；此時可逐漸升溫，使內容物達到微沸。直到消化液變為清澈透明為止。消化過程中，若在消化管上部發現有黑色顆粒時，應小心地轉動消化管，用消化液將它沖洗下來，以保證樣品消化完全。消化過程約需2～3h。

（三）定容消化完畢薯昌緩待溶液冷卻後，沿管壁仔細加入10ml左右無氨蒸餾水，以沖洗管壁，再將消化液小心轉入100ml容量瓶中。以無氨水少量多次沖洗消化管，洗滌液並入容量瓶。冷卻後用無氨水定容至刻度，混勻備用。

（四）蒸餾及滴定 以下幾步進行：
1.儀器的洗滌：先經一般洗滌後，還要用水蒸氣洗滌。可按下列方法進行蒸氣洗滌。先在蒸氣發生器中加入2／3體積的蒸餾水（事先加入幾滴濃硫酸，使其酸化，加入甲基紅指示劑，並加入少許沸石或毛細玻璃管以防止爆沸）。打開漏斗下的夾子，用電爐或酒精迅棗爐加熱至沸騰，使水蒸氣通入儀器的各個部分，以達到清洗的目的。在冷凝管下端放置一個三角瓶接收冷凝水。然後關緊漏斗下的夾子，繼續用蒸氣洗滌5min。沖洗完畢，夾緊蒸氣發生器與收集器之間的連接橡膠管，蒸餾瓶中的廢液由於減壓而倒吸進入收集器，打開收集器下端的活塞排除廢液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下端換放一個盛有硼酸－指示劑混合液的三角瓶，使冷凝管下口完全浸沒在液面以下0.5cm處，蒸餾1～2min，觀察三瓶內的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內部已洗干凈。移去三角瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水沖洗冷凝管下口，關閉電爐，儀器即可供測定樣品使用。

2.標准硫酸銨測定為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術，並檢驗實驗的准確性，找出系統誤差，常用已知濃度的標准硫酸銨測試三次。在三角瓶中加入20ml硼酸－指示劑混合液，將此三角瓶承接在冷凝管下端，並使冷凝管的出口浸入溶液中。注意在加樣前務必打開收集器活塞，以免三角瓶內液體倒吸。准確吸取2ml硫酸銨標准溶液，加到漏斗中。

四、結果計算
樣品中總氮量（％）＝0.010×（V3—V0）×100×14/（W×1000×10）×100×氮的回收率
樣品中蛋白氮含量（％）＝0.0100×（V1－V2－V0）×100×14/（W×5×1000）×100×氮的回收率
回收率（％）＝0.0100×（V－V0）×14/（2.0×0.6×100）×100

G. 酸鹼滴定法牛奶中的蛋白質原理步驟

凱氏定氮法
1.原理
樣品與硫酸和催化劑一同加熱後消化，使蛋白質分解，其中的碳和氫分別被氧化成二氧化碳和水蒸氣逸出，而有機氮轉化成氨後與硫酸結合生成硫酸銨，然後在鹼性條件下蒸餾使氨游離，旅悉用硼酸吸收後再用硫酸或鹽酸標准溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即得蛋白質含量。
（1）消化 將樣品與硫酸混合催化劑混合加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨，溶解在消化液中。
（2）蒸餾與吸收 在消化液中加入過量的氫氧化鈉，並用水蒸氣蒸餾，使硫酸銨釋放出氨，再用硼酸吸收，使氨轉化為四硼酸氫銨。
向消化液中加入氫氧化鈉時，會產生藍色溶液或褐色沉澱，這是由於消化液的銅離子與氨生成銅氨配離子或與鹼生成氫氧敗鏈化銅的緣故，這是正常現象。否則，若顏色不變，則說明加入的鹼量不足，應補加，不然會造成氨的殘留損失。
（3）滴定 用標准鹽酸溶液滴定硼酸吸收液（即四硼酸氫銨），測得氮的拆枯乎含量，再乘以相應的蛋白質系數，推算出樣品的蛋白質含量。

乳及乳製品：6.38

H. 說明常用蛋白質測定方法的原理,並對各種方法加以比較

1、凱氏定氮法

准備4個50mL凱氏燒瓶並標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化。

消化完畢後進行蒸餾，全部蒸餾完畢後用標准鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法宴簡，硫銨不幹擾顯色，Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。

利用標准蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標准曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，並只加入硫酸鈉不含血清的試管作對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，混合後於37℃環境中放置10分鍾，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，標准曲線上直接查出蛋白質含量。

3、酚試劑法

取6支試管標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量加入蒸餾水補足而保持一致，混合均勻，在室溫下放置30分鍾，以未晌歷褲加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的爛御蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

5、考馬斯亮藍法

Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，測定抗體，可用純化的抗體作為標准。待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，出現沉澱，過濾除去。

每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min。根據標准曲線計算待測樣本的濃度。

I. 凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量的原理和基本操作方法是什麼

原理：有機含氮化合物與濃硫酸共熱消化,氮轉化為氨,再與硫酸結合成硫酸銨.硫酸銨與強鹼反應,放出氨.將氨蒸餾到過量的標准無機溶液中,再用標准鹼溶液進行滴定.根據測得的氨量,計算樣品的總氮尺數量.
、試劑與材料：
濃硫酸、硫酸鉀-硫酸銅粉末(稱取80g硫酸鉀和20g硫酸銅(五水),0.3g二氧化硒研細混合)、30%氫氧化鈉溶液、2%硼酸溶液、0.01M標准鹽酸、混合指示劑(田氏指示劑)儲存液(取50ml0.1%甲烯藍乙醇溶液與200ml0.1%甲基紅溶液混合,儲存於棕色瓶中備用.此指示劑在PH5.2為紫色;PH為5.4為暗灰色或灰色;PH5.6為綠色;變色點為PH5.4)、硼酸-田氏指示劑混合液(100ml2%硼酸溶液,滴加約1ml田氏指示劑,搖勻後,溶液呈紫紅色)、蛋白質樣品、容量瓶、吸管氏歷、凱氏燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、微量滴定管、電爐
三、操作方法
1、樣品處理：固體樣品,應在105℃乾燥至恆重.液體樣品可直接吸取一定量,也可經適當稀釋後,吸取一定量進行測定,使每一樣品的含氮量在0.2-1.0mg范圍內.
2、消化：取一定量樣品,於50ml乾燥的凱氏燒瓶內.加入300mg硫酸鉀-硫酸銅混合粉末,再加入3ml濃硫酸.用電爐加熱,在通風廚中消化,瓶口加一小漏斗.先以文火加熱,避免泡沫飛濺,不能讓泡沫上升到瓶頸,待泡沫停止發生後,加強火保持瓶內液體沸騰.時常轉動燒瓶使樣品全部消化完全,直至消化液清澈透明.
另取凱氏瓶一個,不加樣陵核首品,其它操作相同,作為空白試驗,用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質,以對樣品進行校正.
3、蒸餾：將微量凱氏蒸餾裝置洗滌(先用水蒸氣洗滌)干凈.將凱氏燒瓶中的消化液冷卻後,全部轉入100ml的容量瓶,用蒸餾水定容至刻度.
吸取20ml稀釋消化液,置於蒸餾裝置的反應室中,加入10ml30%氫氧化鈉溶液,將玻璃塞塞緊,於漏斗中加一些蒸餾水,作為水封.
取一三角瓶,加入10ml硼酸-田氏指示劑混合液,置於冷凝管之下口,冷凝管口應浸沒在硼酸液面之下,以保證氨的吸收.
加熱水蒸汽發生器,沸騰後,夾緊夾子,凱氏蒸餾.三角瓶中的硼酸-指示劑混合液,吸收蒸餾出的氨,由紫紅色變為綠色.蒸餾15min,讓硼酸液面離開冷凝管口,再蒸1-2min以沖洗冷凝管口.空白試驗按同樣操作進行.
4、滴定：樣品和空白均蒸餾完畢後,用0.01M標准鹽酸滴定,至硼酸-指示劑混合液由綠色變回淡紫色,即為滴定終點.
四、計算 樣品總氮量(mg)=(A-B)×c×14×100/20
式中：A：樣品滴定時消耗的標准鹽酸體積 B：空白滴定時消耗的鹽酸體積 C：標准鹽酸的當量濃度 14：氮的相對分子量 20：用於蒸餾的稀釋消化液體積 100：稀釋消化液的體積
樣品中粗蛋白含量(mg)=樣品總氮量(mg)×6.25

J. 食品中蛋白質含量的測定

食品中蛋白質的測定如下：

蛋白質的檢測原理是基於食品中蛋白質含量與食品中氮含量的比例關系換算的。如乳中蛋白質與氮含量的比值為6.38，大豆中蛋白質與氮含量的比值為5.71，普通食品中蛋白質與氮含量的比值為6.25。因此是通過測定食品中氮含量後再根據換算系數得到食品中蛋白質含量。

2、杜馬斯定氮法：樣品在高純氧中充分燃燒的過程中，將氮元素轉化為氮氣或氮氧化物，再經過高溫銅的還原，使所有的氮轉化為N2，然後利用熱導檢測器檢測N2的含量來推算樣品中氮含量。因此杜馬斯定氮法也稱為杜馬斯伍散燃燒法或燃燒定氮法。