蛋白蒸餾系統驗證

⑴ 蛋白質蒸餾裝置的水蒸氣發生器中為什麼要用硫酸調成酸性

避免揮發性的鹼性物質進入蒸餾產物，影響氨的測定。

⑵ 蛋白質提取分離純化鑒定的實驗方案

一.血清ǐ-球蛋白的初步提取
1. 血細胞與血清分離：
取人血液 1000ml,放置10min, 1000rpm離心20min .棄沉澱,留上清備用(沉澱為血細胞，上部為血清).
2. 乳糜粒分離：4000rpm 10°C離心10分鍾,採用密度梯度離心
梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0.5MnaCl+0.3MEDTA,PH7.4 乳糜粒上浮，將乳糜粒吸出,留其餘液體備用。
3. 血清蛋白分離：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白質。
5000rpm 10°C離心1h,密度梯度離心
梯度.液配置：管容量1/3為血清，2/3為1。31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌後終密度為1。21g/ml .管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其它蛋白。
4.取2ml下部5/6血清於小試管中,加0.9％氯化鈉溶液2.0ml，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液乙4.0ml，加入PBS洗脫液2ml,混勻後於室溫中放置10min，此步驟可重復1～2次
3000rpm 離心5min.沉澱物即是ǐ-球蛋白.
二.凝膠層析提純血清ǐ-球蛋白(1)裝柱：海綿墊裝入玻璃柱底端,作為柱底支持物,裝入定量的蒸餾水(約為柱體積的1/5),以避免膠粒直接沖擊柱底支持物;用玻璃棒小心排除柱底支持物.將密實洗凈的層析柱保持垂直位置，關閉出口，柱內留下約2.0ml洗脫液。邊攪拌凝膠,邊向柱內緩慢,連續,均勻地加入凝膠,(打開柱底端的螺旋夾)不要中斷,使膠粒均勻沉降,以免膠面一次性將疑膠從塑料介面加入層析柱內，打開柱底部出口，調節流速0.3ml/min。凝腔隨柱內溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部傾斜和發生斷層;檢查裝好的凝膠柱用眼觀察有無凝膠分層.溝流和氣泡現象.最後使凝膠床達20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面並防止層析床內出現「紋路」。用緩沖液平衡凝膠柱,流速控制在3-5s/滴.(2)上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關緊下端出口，用長滴管吸取鹽析法制備的球蛋白混合樣品，將裝有上樣液的滴管頭插入床面以上1-2cm處,小心緩慢地貼壁加到凝膠床表面。柱上樣量控制在柱體積的2%-5%.打開下端出口，將流速控制在0.25ml/min使樣品進入凝膠床內。關閉出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內壁。打開下端出口，待緩沖液進入凝膠床後再加少量緩沖液。如此重復三次，以洗凈內壁上的樣品溶液。然後可加入適量緩沖液開始洗脫。加樣開始應立即收集洗脫液。洗脫時接通蠕動泵，流速為0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。(3)洗脫液中NH4+與蛋白質的檢查：取比色板兩個(其中一個為黑色背底)，按洗脫液的順序每管取一滴，分別滴入比色板中，前者加雙縮脲2滴，出現藍色混濁即示有蛋白質析出，由此可估計蛋白質在洗脫各管中的分布及濃度；於另一比色板中，加人奈氏試劑l滴，以觀察NH4+出現的情況。 合並球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其餘用DEAE纖維素陰離子交換柱進一步純化。三．純化――DEAE纖維素陰離子交換層析用DEAE纖維素裝柱約8-10cm高度，並用0.0175mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然後將脫鹽後的球蛋白溶液緩慢加於DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20％磺基水楊酸溶液檢查蛋白質分布情況。(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質檢查等操作步驟同凝膠層析)。四．濃縮經DEAE纖維素陰離於交換柱純化的γ－球蛋白液往往濃度較低。為便於鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ－球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2～ 0.25gSephadex G一25干膠，搖動2～3min， 3000r／min 離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。五. 乙酸纖維素薄膜電泳鑒定ǐ-球蛋白(一)儀器與薄膜的准備1.醋酸纖維素薄膜的潤洗與選擇用竹夾子取一片薄膜，小心地平放在盛有緩沖液的平皿中，若漂浮於液面的薄膜在15—30s內迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用於電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點等，則表示薄膜厚薄不均勻應棄去，以免影響電泳結果。將選好的薄膜用竹子輕壓，使其完全浸泡於緩沖液中約30min後，方可用於電泳。
2.電泳槽的准備根據電泳槽膜支架的寬度，剪裁尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內。當濾紙條全部潤濕後，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯系醋酸纖維素薄膜的橋梁，因而稱為濾紙橋。
3.電極槽的平衡用平衡裝置(或自製平衡管)連接兩個電泳槽，使兩個電極槽內的緩沖液彼此處於同一水平狀態，一般需平衡15——20min。注意，取出平衡裝置時應將活塞關緊。
(二)點樣
1.制備點樣模板取一張干凈濾紙(10×10cm)，在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點樣標志區。
2.點樣用竹夾子取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙間以吸去多餘的緩沖液。無光澤面向上平放在點樣模板上，使其底邊與模板底邊對齊。點樣區距陰極端1.5cm處。點樣時，先用玻璃棒或血色素吸管取2—3�0�8L血清，均勻塗在加樣器上，再將點樣器輕輕印在點樣區內，使血清完全滲透至薄膜內，形成一定寬度、粗細均勻的直線。此步是實驗的關鍵，點樣前應在濾紙上反復練習，掌握點樣技術後再正式點樣。
(三).電泳用竹夾子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點樣面朝下)，另一端平貼在陽極端支架上，要求薄膜緊貼濾紙橋並綳直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。用導線將電泳槽的正、負極與電泳儀的正、負極分別連接，注意不要接錯。在室溫下電泳，打開電源開關，用電泳儀上細調節旋扭調到每厘米膜寬電流強度為0.3mA(8片薄膜則為4.8mA)。通電10—15min後，將電流調節到每厘米膜寬電流強度為0.5mA(8片共8 mA)，電泳時間約50—80min。電泳後調節旋扭使電流為零，關閉電泳儀切斷電源。
(四).染色與漂洗
1.血清蛋白染色與漂洗脫色用解剖鑷子取出電泳後的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培養皿中，浸染5min，取出後再用漂洗液浸洗脫色，每隔10min 換漂洗液一次，連續數次，直至背景藍色脫盡。取出薄膜放在濾紙上，用吹風機的冷風將薄膜吹乾。
(五)透明將脫色吹乾後的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出後立即緊貼於干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡，約2—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然乾燥，或用吹風機冷風吹乾且無酸味。再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗，當薄膜完全潤濕後用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下，用濾紙吸干所有的水分，最後將薄膜置液體石蠟中浸泡3min，再用濾紙吸干液體石蠟，壓平。此薄膜透明，區帶著色清晰，可用於光吸收計掃描。長期保存不褪色。
(六)結果判斷與定量血清蛋白電泳經蛋白染色後，可顯示出區帶，未經透明處理的電泳圖譜可直接用於定量測定。可採用洗脫法或光吸收掃描法，測定各蛋白組分相對百分含

⑶ 蛋白質驗證實驗

1.實驗課題：（ 細胞膜中是否含有蛋白質成分 ）
2.實驗目的：（ 驗證細胞膜中是否含有蛋白質成分 ）
3.實驗原理：（ 雙縮脲試劑與蛋白質結合變成紫色 ）
4.實驗材料：細胞膜樣液、蒸餾水、潔凈試管、雙縮脲試劑等.
5.實驗步驟：
第一步：取潔凈的試管2支,編號甲、乙.
第二步：向甲試管中滴加2mL的細胞膜樣液,（ 向乙試管中也滴加2mL的細胞膜樣液） ）.
第三步：（ 向甲試管中加入適量的雙縮脲試劑,向乙試管中加入等劑量的蒸餾水）
6.實驗現象：（ 甲試管中樣液變紫 ）.
7.實驗結論：（ 細胞膜中含有蛋白質成分 ）.只求實驗步驟.括弧里為本人添加設計的實驗步驟內容,因與參考答案不一致,故來求教.本人設計乙管是為空白對照,就如蛋白質鑒定實驗中也最好設置空白對照,以使實驗更具說服力.我認為設計的妥,還望網友來點評指教,

⑷ 蛋白質蒸餾裝置的水蒸氣發生器中的水為何要用硫酸調成酸性

防止氮元素生成氨氣揮發。

⑸ 蛋白質的蒸餾操作,正確方法是

加入過量的氫氧化鈉
先加接受瓶再蒸餾
在小玻杯中加入水防漏氣

⑹ 說明常用蛋白質測定方法的原理,並對各種方法加以比較

1、凱氏定氮法

准備4個50mL凱氏燒瓶並標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化。

消化完畢後進行蒸餾，全部蒸餾完畢後用標准鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不幹擾顯色， Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。

利用標准蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標准曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，並只加入硫酸鈉不含血清的試管作對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，混合後於37℃環境中放置10分鍾，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，標准曲線上直接查出蛋白質含量。

3、酚試劑法

取6支試管標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量加入蒸餾水補足而保持一致，混合均勻，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

5、考馬斯亮藍法

Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，測定抗體，可用純化的抗體作為標准。待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，出現沉澱，過濾除去。

每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min。根據標准曲線計算待測樣本的濃度。

⑺ 「蛋白質的鑒定」實驗怎麼做

實驗一 生物組織中脂肪,蛋白質的鑒定
一,實驗原理
(1)鑒定實驗設計的理念:
某些化學試劑 + 生物組織中有關有機化合物 產生特定的顏色反應.
(2)具體原理:
1、脂肪小顆粒 + 蘇丹Ⅲ染液→橘黃色小顆粒.
2、蛋白質 + 雙縮脲試劑→紫色反應.
二,目標要求
初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
三,重點,難點
1.重點
①初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
②通過實驗的操作和設計培養學生的動手能力,掌握探索實驗設計技巧,從而培養創新思維能力.
2.難點
根據此實驗方法,原理,設計實驗來鑒定常見食物的成分.
四,實驗材料
1.脂肪的鑒定實驗:選擇富含脂肪的種子,以花生種子為最好(實驗前浸泡3h～4h).
2.蛋白質的鑒定實驗:可用浸泡1d～2d的黃豆種子(或用豆漿,或用雞蛋蛋白).
五,儀器,試劑
1.儀器:剪刀,解剖刀,雙面刀片,試管,試管架,試管夾,大小燒杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精燈,三腳架,石棉網,火柴,研缽,石英砂,紗布,載玻片,蓋玻片,毛筆,吸水紙,顯微鏡.
2.試劑：1蘇丹Ⅲ染液;2雙縮脲試劑;3 體積分數為50%的酒精溶液;4蒸餾水.
六,方法步驟
（1）脂肪的鑒定
脂肪的鑒定步驟:
取材:花生種子(浸泡3-4h),將子葉削成薄片
取理想薄片
在薄片上滴2-3滴蘇丹Ⅲ染液
去浮色
製成臨時裝片
觀察:先在低倍鏡下,找到材料的脂肪滴,然後,轉為高倍鏡觀察.
結論:細胞中的圓形脂肪小顆粒已經被染成橘黃色.
實驗成功的要點:
①.脂肪的鑒定實驗:選擇富含脂肪的種子,以花生種子為最好(實驗前浸泡3h～4h).
②該試驗成功的關鍵是獲得只含有單層細胞理想薄片.
③滴蘇丹Ⅲ染液染液染色2-3min,時間不宜過長,以防細胞的其他部分被染色.
（2）蛋白質的鑒定
蛋白質的鑒定步驟:
選材:卵清稀釋液或黃豆(浸泡1-2d) 豆漿 濾液

結論:蛋白質與雙縮脲試劑發生紫色反應.
2,實驗成功的要點:
①蛋白質的鑒定實驗:可用浸泡1d～2d的黃豆種子(或用豆漿,或用雞蛋蛋白稀釋液).
②雙縮脲試劑的使用,一定要先加入A液(即0.1 g/ml的 NaOH 溶液),再加入雙縮脲試劑B液(即0.01 g/ml的 CuSO4 溶液).
③還可設計一隻加底物的試管,不加雙縮脲試劑,進行空白對照,說明顏色反應的引起是蛋白質的存在與雙縮脲試劑發生反應,而不是空氣的氧化引起.

⑻ 驗證細胞膜中有蛋白質，用細胞膜樣液、蒸餾水、試管、滴管、雙縮脲試濟，怎樣驗證請詳細一點。謝謝！

將細胞膜樣液用蒸餾水稀釋後，取2ml加入試管，加入2ml雙縮脲試劑A液，使細胞樣液呈鹼性，再用滴管滴入雙縮脲試劑B液2~3滴，振盪試管，若試劑呈紫色，則證明細胞膜樣液稀釋液中有蛋白質。

⑼ 蛋白質鑒定實驗

實驗一 生物組織中脂肪,蛋白質的鑒定
一,實驗原理
(1)鑒定實驗設計的理念:
某些化學試劑 + 生物組織中有關有機化合物 產生特定的顏色反應.
(2)具體原理:
1、脂肪小顆粒 + 蘇丹Ⅲ染液→橘黃色小顆粒.
2、蛋白質 + 雙縮脲試劑→紫色反應.
二,目標要求
初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
三,重點,難點
1.重點
①初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
②通過實驗的操作和設計培養學生的動手能力,掌握探索實驗設計技巧,從而培養創新思維能力.
2.難點
根據此實驗方法,原理,設計實驗來鑒定常見食物的成分.
四,實驗材料
1.脂肪的鑒定實驗:選擇富含脂肪的種子,以花生種子為最好(實驗前浸泡3h～4h).
2.蛋白質的鑒定實驗:可用浸泡1d～2d的黃豆種子(或用豆漿,或用雞蛋蛋白).
五,儀器,試劑
1.儀器:剪刀,解剖刀,雙面刀片,試管,試管架,試管夾,大小燒杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精燈,三腳架,石棉網,火柴,研缽,石英砂,紗布,載玻片,蓋玻片,毛筆,吸水紙,顯微鏡.
2.試劑：1蘇丹Ⅲ染液;2雙縮脲試劑;3 體積分數為50%的酒精溶液;4蒸餾水.
六,方法步驟
（1）脂肪的鑒定
脂肪的鑒定步驟:
取材:花生種子(浸泡3-4h),將子葉削成薄...實驗一 生物組織中脂肪,蛋白質的鑒定
一,實驗原理
(1)鑒定實驗設計的理念:
某些化學試劑 + 生物組織中有關有機化合物 產生特定的顏色反應.
(2)具體原理:
1、脂肪小顆粒 + 蘇丹Ⅲ染液→橘黃色小顆粒.
2、蛋白質 + 雙縮脲試劑→紫色反應.
二,目標要求
初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
三,重點,難點
1.重點
①初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
②通過實驗的操作和設計培養學生的動手能力,掌握探索實驗設計技巧,從而培養創新思維能力.
2.難點
根據此實驗方法,原理,設計實驗來鑒定常見食物的成分.
四,實驗材料
1.脂肪的鑒定實驗:選擇富含脂肪的種子,以花生種子為最好(實驗前浸泡3h～4h).
2.蛋白質的鑒定實驗:可用浸泡1d～2d的黃豆種子(或用豆漿,或用雞蛋蛋白).
五,儀器,試劑
1.儀器:剪刀,解剖刀,雙面刀片,試管,試管架,試管夾,大小燒杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精燈,三腳架,石棉網,火柴,研缽,石英砂,紗布,載玻片,蓋玻片,毛筆,吸水紙,顯微鏡.
2.試劑：1蘇丹Ⅲ染液;2雙縮脲試劑;3 體積分數為50%的酒精溶液;4蒸餾水.
六,方法步驟
（1）脂肪的鑒定
脂肪的鑒定步驟:
取材:花生種子(浸泡3-4h),將子葉削成薄片
取理想薄片
在薄片上滴2-3滴蘇丹Ⅲ染液
去浮色
製成臨時裝片
觀察:先在低倍鏡下,找到材料的脂肪滴,然後,轉為高倍鏡觀察.
結論:細胞中的圓形脂肪小顆粒已經被染成橘黃色.
實驗成功的要點:
①.脂肪的鑒定實驗:選擇富含脂肪的種子,以花生種子為最好(實驗前浸泡3h～4h).
②該試驗成功的關鍵是獲得只含有單層細胞理想薄片.
③滴蘇丹Ⅲ染液染液染色2-3min,時間不宜過長,以防細胞的其他部分被染色.
（2）蛋白質的鑒定
蛋白質的鑒定步驟:
選材:卵清稀釋液或黃豆(浸泡1-2d) 豆漿 濾液

結論:蛋白質與雙縮脲試劑發生紫色反應.
2,實驗成功的要點:
①蛋白質的鑒定實驗:可用浸泡1d～2d的黃豆種子(或用豆漿,或用雞蛋蛋白稀釋液).
②雙縮脲試劑的使用,一定要先加入A液(即0.1 g/ml的 NaOH 溶液),再加入雙縮脲試劑B液(即0.01 g/ml的 CuSO4 溶液).
③還可設計一隻加底物的試管,不加雙縮脲試劑,進行空白對照,說明顏色反應的引起是蛋白質的存在與雙縮脲試劑發生反應,而不是空氣的氧化引起.

⑽ 蛋白質的鑒定

雙縮脲反應產物雙縮脲結構雙縮脲試劑是由雙縮脲試劑A和雙縮脲試劑B兩種試劑組成. 雙縮脲試劑A的成分是氫氧化鈉的質量分數為0.1 g/mL的水溶液； 雙縮脲試劑B的成分是硫酸銅的質量分數為0.01 g/mL的水溶液。 雙縮脲試劑可以驗證蛋白質的存在。 具體方法是： 先將雙縮脲試劑A加入組織樣液，搖盪均勻（必須營造鹼性環境），再加入雙縮脲試劑B，搖盪均勻。如果組織里含有蛋白質，那麼會看到溶液變成紫色。具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆可與雙縮脲試劑產生紫色反應。蛋白質的肽鍵在鹼性溶液中能與Cu2+絡合成紫紅色的化合物。顏色深淺與蛋白質濃度成正比。 雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。 雙縮脲試劑本是用來檢測雙縮脲，因蛋白質中也有-CONH-基也可用於檢驗蛋白質，與蛋白質接觸後的顏色呈紫色。

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