質粒dna提取蒸餾水調零

『壹』 DNA的粗提取與鑒定實驗第一步驟加入蒸餾水的目的和第三步驟加入蒸餾水的目的

第一步加蒸餾水是為了促進血細胞破裂，使DNA從細胞核中釋放出來。第三部加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出。關鍵要理解實驗原理。

『貳』 質粒DNA提取時為什麼洗脫液在60度水浴加熱更好呢

有利於提高洗脫效率。
洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃後使用，有利於提高洗脫效率。

『叄』 dna粗提取和鑒定實驗中蒸餾水的作用

在DNA粗提取的實驗中，先後兩次向燒杯中加入蒸餾水的作用分別是使血細胞吸水漲破，釋放DNA；降低NaCl濃度，使DNA析出．
故選：B．

『肆』 質粒DNA的提取方法總共有哪些，回答的全給高分

(一)鹼裂解法提取質粒
[實驗原理]
鹼裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介於12.0~12.5這個狹窄的范圍內,線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環質粒DNA的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復Ph至中性時，共價閉合環狀質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而准確，在而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那麼迅速而准確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉澱下來而被除去。
[實驗儀器與設備]
1.恆溫培養箱 2.恆溫搖床
3.台式離心機(最大轉速4000rpm) 4.冷凍高速離心機
5.高壓滅菌鍋 6.超凈工作台
7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip
[實驗材料]
1.葡萄糖 2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氫氧化鈉
5.十二烷基硫酸鈉(SDS) 6.乙酸鉀
7.冰乙酸 8.氯仿
9.乙醇 10.胰RNA酶
11.氨苄青黴素 12.蔗糖
13.溴酚藍 14.酚
15.β巰基乙醇 16.鹽酸
17.含pUC18質粒的大腸桿菌
附：試劑的配製
1.溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖
5mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)
10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2.溶液Ⅱ
0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等體積混合
3.溶液Ⅲ
5mmol/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4.TE緩沖液
10mmol/L Tris·HCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用後即放回)
6.胰RNA酶
將RNA酶溶於10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，於100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存於-20℃。
7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴藍酚
8.酚
[實驗步驟]
(一) 提取質粒
1.將2ml含相應抗生素的LB液體培養基加入到試管中，接入含質粒的大腸桿菌，37℃振盪培養過夜。
2.取1.5ml培養物倒入微量離心管中，4000rpm，離心2min。
3.吸去培養液，使細胞沉澱盡可能乾燥。
4.將細菌沉澱懸浮於100μl溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10 min。
5.加200μl溶液Ⅱ(新鮮配製)，混勻內容物，將離心管放冰上5 min。
6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上預冷)，蓋緊管口，顛倒數次使混勻。
7.1200rpm，離心15 min，將上清轉至另一離心管中。
8.向上清中加入等體積酚：氯仿(去蛋白)，反復混勻，12000rpm，離心5min,將上清轉移到另一離心管中.
9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻後,室溫放置5-10min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。
10.用1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉澱，振盪並離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中乾燥。
11.加50μl TE緩沖液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。
(二)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA
[實驗原理]
瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應，DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由於糖磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠(ethim bromide ,EB)，在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場中，pH8.0條件下，凝膠中帶負電荷的DNA向陽極遷移。
瓊脂糖凝膠有如下特點：
(1) DNA的分子大小 在凝膠基質中其遷移速率與鹼基對數目的常用對數值成反比，分子越大遷移得越慢。
(2) 瓊脂糖濃度 一個特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對數與凝膠濃度(t)成線性關系。
(3) 電壓 低電壓時，線狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大於2kb的DNA片段的解析度達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。
(4) 電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時的溫度影響不明顯，不同大小的DNA片段其相對遷移速率在4℃與30℃之間不發生明顯改變，但濃度低於0.5%的凝膠或低熔點凝膠較為脆弱，最好在4℃條件下電泳。
(5) 嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用於檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的鹼基對間並拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀遷移率降低15%。
(6) 離子強度 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配製凝膠，電導率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高並明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化。
對於天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配製成濃縮母液，室溫保存，用時稀釋。
[實驗儀器與設備]
1. 恆溫培養箱 2. 瓊脂糖凝膠電泳系統
3. 高壓滅菌鍋 4. 紫外線透射儀
[實驗材料]
1.三羥甲基氨基甲烷(Tris) 2.硼酸
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚藍
5.蔗糖 6.瓊脂糖
7.溴化乙錠 8.DNA marker
9.DNA樣品
[實驗步驟]
1.緩沖液的配製
① 5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)
配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml
Ph8.0
② 凝膠加樣緩沖液(6×)
溴酚藍 0.25%
蔗糖 40%
③溴化乙錠溶液(EB) 0.5μg/ml
2.制備瓊脂糖凝膠
按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
瓊脂糖凝膠濃度 線性DNA的有效分離范圍
0.3% 5-60 kb
0.6% 1-20 kb
0.7% 0.8-10 kb
0.9% 0.5-7 kb
1.2% 0.4-6 kb
1.5% 0.2-4 kb
2.0% 0.1-3 kb
3.膠板的制備
(1) 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、乾燥的玻璃板的邊緣(或電泳裝置所皿備的塑料盤的開口)封住，形成一個膠膜(將膠膜放在工作台的水平位置上，用水平儀校正)。
(2) 配製足夠用於灌滿電泳槽和制備凝膠所需的電泳緩沖液(1×TBE)。准確稱量的瓊脂糖粉。緩沖液不宜超過錐瓶或玻璃瓶的50%容量。 在電泳槽和凝膠中務必使用同一批次的電泳緩沖液，離子強度或pH值的微小差異會在凝膠中形成前沿，從而大大影響DNA片段的遷移率 。
(3) 在錐瓶的瓶頸上鬆鬆地包上一層厚紙。如用玻璃瓶，瓶蓋須擰松。在沸水浴或微波爐中將懸浮加熱至瓊脂糖溶解。注意：瓊脂糖溶液若在微波爐里加熱過長時間，溶液將過熱並暴沸。應核對溶液的體積在煮沸過程中是否由於蒸發而減少，必要時用緩沖液補充。
(4) 使溶液冷卻至60℃。加入溴化乙錠(用水配製成10mg/ml的貯存液)到終濃度為0.5ug/ml，充分混勻。
(5) 用移液器吸取少量瓊脂糖溶液封固膠模邊緣，凝固後，在距離底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖後可以形成完好的加樣孔。如果梳子距玻璃板太近，則拔出梳子時孔底將有破裂的危險，破裂後會使樣品從玻璃板之間滲透。
(6)將剩餘的溫熱瓊脂糖溶液倒入膠模中。凝膠的厚度在3-5mm之間。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。
(7)在凝膠完全凝固後(於室溫放置30-45分鍾) ，小心移去梳子和高壓滅菌紙帶，將凝膠放入電泳槽中。
低熔點瓊脂糖凝膠及濃度低於0.5%的瓊脂糖凝膠應冷卻至4℃，並在冷庫中電泳。
(8)加入恰好沒過膠面約1mm深的足量電泳緩沖液。
4.加樣
DNA樣品與所需加樣緩沖液混合後，用微量移液器，慢慢將混合物加至樣品槽中。此時凝膠已浸沒在緩沖液中。 一個加樣孔的最大加樣量依據DNA的數量及大小而定，一般為20-30μl樣品。
已知大小的DNA標准，應同時加在凝膠的左凝膠的左側和右側孔內。確定未知DNA的大小。測量未知DNA的大小時，要所有樣品都用相同的樣品緩沖液。
5.電泳
在低電壓條件下,線形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關系,但是,在電場增加時,不同相對分子質量的DNA片段泳動度的增加是有差別的。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨之減小。為了獲得電泳分離DNA片段的最大解析度，電場強度不應高於5V/cm。當溴酚藍指示劑移到到距離膠板下沿約1-2cm處，停止電泳。

『伍』 DNA提取過程中的關鍵步驟及注意事項有哪些

質粒抽提流程詳解——沉澱菌體
檢查細菌培養情況，將明顯渾濁的菌液倒在已經編號的2ml的沉菌用離心管里，在約12000轉/min的速度下離心沉澱1分鍾，保證無懸浮物後取出；將離心管倒扣在衛生紙上，用力敲擊，至液體培養基完全去除；如發現菌體沉澱的少，可多加2ml菌液重復沉菌一次。
在離心管中加入250µl 加過RNaseA1酶的Buffer S1，用振盪器震盪，直到沉澱完全充分懸浮。
1. Buffer S1是什麼？主要組分是什麼？
50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0

2. Buffer S1的功能是什麼？
50 mM葡萄糖：加了葡萄糖後最大的好處只是懸浮後的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果Buffer S1中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。
EDTA ：大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在Buffer S1中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，只要是在不太長的時間里完成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。 ——但是對於測序而言，我們是用水溶解質粒，所以EDTA是必須的。

3.如果抽提質粒恰好Buffer S1用完了，可不可以用水代替？
只要用等體積的水，或LB培養基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。

質粒抽提流程詳解——裂解
在離心管中加入250µl Buffer S2，上下緩慢顛倒7~8次至混旋液澄清（這步的操作時間不得超過4分鍾）；
☆ 注意：顛倒時不能太劇烈，否則會有核DNA污染；如果Buffer S2因溫度過低有SDS沉澱析出，可將其放置55~60C水溶鍋中適當加熱至澄清後再用。
1.抽提質粒的原理是什麼？
鹼裂解法

2. Buffer S2是什麼？主要組分是什麼？
0.2 N NaOH / 1% SDS
SDS：十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），是洗潔精的主要成分。常用於DNA提取過程中使蛋白質變性後與DNA分開。

3.Buffer S2的功能是什麼？
NaOH：NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了鹼都會幾乎在瞬間就溶解。用了不新鮮的NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為SDS也是鹼性的，只是弱了點而已。
4.加入Buffer S2為何時間不能太久，動作要輕柔？
第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的鹼性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。

質粒抽提流程詳解——中和
加入400ul Buffer S3，劇烈顛倒5~10次，使之充分中和，同時將大塊白色沉澱振成小塊，便於離心。
在約13600轉/min的速度下離心沉澱12分鍾，如有因沉澱不完全引起的白色絮狀物質，可重復振盪離心直至沉澱完全。
1. Buffer S3是什麼？主要組分是什麼？
3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸

2.加入Buffer S3後出現的白色沉澱是什麼？&3.Buffer S3的功能是什麼？
每個人都知道，溶液III加入後就會有大量的沉澱，但大部分人卻不明白這沉澱的本質。
最容易產生的誤解是，當SDS碰到酸性後發生的沉澱。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉澱的出現，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉澱，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉澱出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沉澱，那會不會是遇鹽發生的沉澱呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發現SDS在高鹽濃度下是會產生沉澱的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉澱。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發現沉澱的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發生了沉澱。如此看來，溶液III加入後的沉澱實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉澱更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質沉澱了，與此同時大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉澱了。這個過程不難想像，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉澱了，盡管SDS並不與DNA分子結合。

2 M的醋酸的作用是什麼？
是為了中和NaOH，因為長時間的鹼性條件會打斷DNA，所以要中和。基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉澱了。所以鹼處理的時間要短，而且不得激烈振盪，不然最後得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。

質粒抽提流程詳解——純化
將上步離心上清液用移液器轉移到吸附柱上，在約10500轉/min的速度下離心1分鍾。
注意：不要把沉澱物轉移到吸附柱里，1個樣品使用1個槍頭。

為何離心上清液經離心後，質粒DNA就被吸附到膜上？
在高鹽狀態下，硅膠膜專一性地吸附DNA；而在低鹽或水溶液狀態下，DNA被洗脫下來。

質粒抽提流程詳解——洗滌脫鹽
取出DNA吸附柱，棄掉廢液收集管中的液體，將柱子放回這個離心管中，加入500ul Wash Solution到柱子中，高速離心（10,000rpm)30秒。
重復上述步驟一次。
取出DNA吸附柱，棄掉廢液收集管中的液體，將柱子放回這個離心管中，最大速度離心2分鍾
使用Wash Solution要進行兩次洗滌，目的是使殘留的蛋白、鹽離子等雜質更充分的被去除，保證硅膠膜上吸附的DNA盡量純。

質粒抽提流程詳解——產物回收
將DNA吸附柱移入新的1.5ml離心管中，在DNA吸附柱的膜中央加入30-40ul 預熱無菌雙蒸水，室溫放置2分鍾後12，000rpm離心1分鍾，離心管底即為質粒DNA。

『陸』 質粒提取為什麼加蒸餾水

質粒提取加蒸餾水是因為：稀釋層析液，更有利於色素擴散。

葉綠體色素在葉綠體內以其親水部分與蛋白質結合，親脂部分與類脂結合，純的有機溶劑不能打破色素與蛋白質的聯系，所以必須用能與水混溶的有機溶劑並有少量水存在時，才能將葉綠素提取出來。

加蒸餾水是為了促進血細胞破裂，使DNA從細胞核中釋放出來。加蒸餾水降低NaCl溶液濃度，使DNA析出。關鍵要理解實驗原理。

實驗原理

提取質粒DNA的方法有很多種，從提取產量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取，從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取，從具體操作方法分可以分為鹼裂解法、煮沸法、牙簽法等，各種不同的方法各有其優缺點，根據不同的實驗目的可以採用合適的提取方法。詳細內容請參考《分子克隆實驗指南》。

以上內容參考：網路-質粒抽提

『柒』 如何對提取的DNA純化

質粒DNA的提取、純化和電泳檢測
摘要
本實驗通過鹼變性法提取E.coli DH5α(pUC19)的質粒DNA,並且通過一系列的分離純化技術將其質粒DNA與染色體DNA、RNA、蛋白質等雜質分開從而得到純化的質粒DNA分子。通過瓊脂糖凝膠電泳可以通過DNA條帶的位置來大致判斷其分子大小,也可以將實際電泳的結果和理論結果相對比,分析差異產生原因,從而完善實驗方法,嚴謹實驗步驟。
關鍵詞鹼變性法分離純化技術瓊脂糖凝膠電泳
引言
質粒是細菌細胞中與主染色體共存、可自主復制的一段大多數呈環形的DNA。細菌質粒的相對分子質量大小從1kb至200kb以上不等。一些質粒永遠獨立於染色體之外,另外一些質粒在一定條件下會可逆地整合到寄主染色體上,隨著染色體的復制而復制,並通過細胞分裂傳遞到後代。質粒在基因工程中質粒常被用做基因的載體。目前,已發現有質粒的細菌有幾百種,已知的絕大多數的細菌質粒都是閉合環狀DNA分子(DNA)。質粒在基因工程中是一類重要的載體,其作用主要是攜帶一些基因片段(可以是編碼基因,也可以是調控區等),在細胞內環境中進行表達或參與通路的相互作用,通過將質粒轉化到宿主細胞可以探究基因相互作用關系,取得蛋白產物,實現特定基因片段的克隆等。總之,質粒在生物科學研究方面具有廣泛的作用。
提取和純化質粒DNA的方法很多,目前常用的有:鹼裂解/鹼變性法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-***化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中,鹼變性提取法最為經典和常用。鹼裂解/鹼變性法是基於染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的的分離方法。在pH12.6的鹼性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結構解開而變性;質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離。當以pH4.8的KAc高鹽緩沖液調節其pH值至中性時,變性的質粒DNA恢復原來的構型,保存在溶液中;染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構,與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉澱下來,通過離心被除去。最後,質粒DNA用冰乙醇沉澱獲得。由於DNA和RNA性質類似,乙醇沉澱DNA的同時,也伴隨著RNA沉澱,可利用RNaseA將RNA降解。質粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通過酚/***仿抽提除去,最後獲得純度較高的質粒DNA。
電泳(electrophoresis)是帶電物質在電場中向著與其電荷相反的電極移動的現象。各種生物大分子在一定pH條件下,可以解離成帶電荷的離子,在電場中會向相反的電極移動。凝膠電泳是分子生物學的核心技術之一。凝膠是電泳支持介質,具有分子篩效應。含有電解液的凝膠在電場中,其中的電離子會發生移動,此時移動的速度可因帶電離子的大小、形態及電荷量的不同而有差異。利用移動
速度差異,就可以區別各種大小不同的分子。因而,凝膠電泳可用於分離、鑒定和純化DNA片段。
正文
1.材料和方法
1.1材料和試劑
實驗材料:E.coli DH5α(pUC19)。
實驗試劑:LB液體培養基、氨苄青黴素(Amp)母液(儲存濃度100mg/mL)、溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mM EDTA (pH 8.0);溶液Ⅱ:0.2MNaOH,1% SDS;溶液Ⅲ:5MKAc(pH 4.8);TE溶液:10mM Tris-HCl,1mM EDTA (pH 8.0);冰乙醇、70%乙醇、RNase A、Tris飽和酚、***仿/異戊醇混合液、酚/***仿/異戊醇(PCI)(25:24:1)混合液、3M NaAc溶液、滅菌雙蒸水ddH2O、50×TAE緩沖液、10mg/mL溴化乙錠(EB)溶液、6×上樣緩沖液(6×loading buffer)。
1.2實驗方法
大腸桿菌的增值
用牙簽從LB固體培養基挑取E.coli DH5α(pUC19)菌落於LB+Amp(Amp工作濃度為100μg/mL)液體培養基中,置於37℃、200rpm培養箱下振盪過夜培養。
實驗前准備
(1)用搪瓷杯取一杯冰。
(2)將小燒杯放在天平上,調至平衡。
(3)配置80ml溶液Ⅱ: 將原液10M NaOH,10% SDS配製成0.2M NaOH,1% SDS。取用8ml SDS,1.6ml NaOH和70.4ml蒸餾水配置。
3. E.coil菌株的收獲( 4°C操作)
(1)取一個滅菌離心管,稱重,標記為W1 14.552g
(2)倒入菌液至距瓶口1/3處,兩兩配平
(3) 6000rpm,離心5min,棄上清
(4)加入5ml 溶液Ⅰ,渦旋, 6000rpm,5min,棄上清,稱重為W2 14.676g,計算W2-W1 0.124g。
4.細胞裂解提取質粒DNA ( 4°C操作)
向菌體沉澱中量加入(按菌體量接近的重新分組,溶液Ⅰ補平)
(1)2.0 mL 溶液Ⅰ,充分渦旋振盪;用溶液Ⅰ再次配平
(2)4.0 mL溶液Ⅱ,輕柔顛倒混勻,冰浴3-5mi
(3)3.0 mL 溶液Ⅲ,輕柔顛倒混勻,冰浴5mi
(4)12000rpm, 15min;小心轉移上清到新的離心管內,記錄體積V。
(5)加入2V冰乙醇,顛倒混勻;-20℃,15min;。
(6)12000rpm,15min,棄上清。
(7)加入5mL70%乙醇,12000rpm,3min,吸棄上清。
(8)重復乙醇洗滌一次;37℃風干5-10min。
(9)分次加入0.5mL TE溶液兩次,將沉澱吹開吹勻,並移到Ep管中,得質粒DNA粗提物
(10)加入5μl RNase A(10mg/ml),終濃度為50μg/mL,37℃孵育1-2小時。
5.質粒DNA的純化
將1mL質粒DNA粗提物分出500μL到一新EP管中,使得每組兩管。每個EP管進行如下操作:
(1)加入等體積的Tris飽和酚,渦旋振盪,12000rpm,5mi
(2)轉移上清V1(兩管均為400μL)至新管,加入V1的酚/***仿/異戊醇混合液,渦旋振盪(<1min),12000rpm,5mi
(3)轉移上清V2(一管為400μL,一管為378μL)至新管,加入V2的***仿/異戊醇混合液,渦旋振盪(<1min),12000rpm,5mi
(4)轉移上清V3(兩管均為250μL)至新管,加入1/10 V3的3M NaAc溶液(pH=5.2),再加入2V4(V4=V3+1/10V3)的冰乙醇,震盪混勻,-20℃保存30mi
(5)12000rpm,15min,棄上清
(6)加入500μL 70%乙醇洗滌,12000rpm離心2min,棄上清
(7)重復洗滌一次,吸棄上清,37℃風干5mi
(8)每管加入25μL TE溶解沉澱,合並,得50μL純化質粒DNA。
6. 1% 瓊脂糖凝膠的制備
(1)配製2L 1×TAE:取40mL 50×TAE,用雙蒸水將其稀釋至2L
(2)正確組裝制膠槽、制膠板、樣品梳
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文檔介紹：
(3)取40mL 1×TAE至250mL干凈紅蓋瓶中,稱量0.4g瓊脂糖,混勻,輕旋瓶蓋,微波爐加熱沸騰3-4次,至溶液澄清無顆粒
(4)待溶液冷卻至60℃左右,加入20μL 1mg/mL的溴化乙錠(EB)溶液,使EB溶液終濃度為0.5mg/L,混勻後倒入制膠槽中,冷卻凝固待用(冷卻凝固時間要在30min以上)。
7.電泳上樣
(1)取2.0μL純化DNA、2μL雙蒸水、1μL上樣緩沖液(6×loading buffer),用微量移液器吹吸混勻
(2)將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中,添加1×TAE至高出膠面約1mm
(3)將上述混合好的DNA樣品,按照下表順序,點樣到凝膠中。。
8.凝膠電泳與DNA分離
(1)開啟電泳儀電源,選擇合適的電壓120V和時間40mi
(3)將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極,與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負極,與電泳儀負極相連
(4)啟動電泳,待觀察到負極有氣泡升起方可離開
(5)電泳結束,關閉電源,取出凝膠,在紫外燈下觀察電泳條帶。
2.實驗結果
表 DNA樣品加樣順序
泳道
DNA
樣品/
marker
超螺旋marker
UC19
UC19/HindⅢ
1組DNA樣品
2組DNA樣品
3組DNA樣品
4組DNA樣品
5組DNA樣品
超螺旋marker
樣量
6μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
6μL
泳道
10
11
12
13
14
15
16
17
DNA
樣品/
marker
6組DNA樣品
6組DNA樣品(陽性對照)
7組DNA樣品
8組DNA樣品
9組DNA樣品
10組DNA樣品
UC19
HindⅢ
UC19/
樣量
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
5μL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
5,026
5,026
3,049
2,087
圖鹼裂解法提取質粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠電泳
泳道1與泳道9 加的樣品是Supercoiled DNA Ladder Marker。supercoiled DNA Ladder Marker 由8種超螺旋的質粒DNA 構成,DNA大小分別為:2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp。其中5,026 bp的條帶最亮。
泳道2與泳道17加的樣品是pUC19質粒。DNA,即超螺旋的共價閉合環狀結構的質粒DNA,其條帶在2.7kb左右,起對照作用。
泳道3與泳道16加的樣品是用HindⅢ酶切的pUC19質粒。HindⅢ酶切pUC19的結果是使超螺旋的共價閉合環狀結構的pUC19質粒DNA的鏈斷裂成線狀的DNA, 線狀DNA電泳速率減慢。但是實驗中所用的HindⅢ沒有將pUC19酶切充分,因此泳道3與泳道16電泳後會形成兩條條帶,其中暗帶是被HindⅢ酶切的pUC19 質粒,明帶是沒有被HindⅢ酶切的pUC19質粒。
泳道11是沒有加RNase的對照組的電泳圖像,由於RNA易形成各種高級結構,同樣大小的DNA和RNA相比,RNA的電泳速率快。泳道11下方的大量明帶即為RNA電泳區域。
除了泳道15存在pUC19質粒所在區域條帶,其他組的都無或無明顯的pUC19質粒所在區域的條帶,包括泳道15在內的所有組的條帶位置都偏低,因為鹼變性法有缺陷:容易導致不可逆的變性,不適合大質粒的抽提。鹼裂解法是很劇烈的方法,質粒在鹼性條件下會變性,時間一長,這種變性就是不可逆的了,我們鹼變性時間太長,導致質粒DNA的變性不可逆,所以實際條帶位置和預估不一樣。
除了位置偏下的質粒DNA帶以外,每一組都存在中間位置較弱的雜帶(實心箭頭所指),我們推測此雜帶是沒有被沉澱的,在加了有機物後渦旋震盪過程中所產生的線性染色體DNA的碎片,DNA,所以它的位置偏後。這一雜帶在泳道4、7、8、10、12和16尤為明顯。
個別組在加樣孔下方也存在較窄的DNA條帶(線性箭頭所指),據推測,這種條帶的產生是質粒DNA沉澱中少量染色體DNA雜質的存在而產生的,由於染色體DNA片段過大,1%的瓊脂糖凝膠的解析度有限,片段過大的DNA在電泳時速度極慢或很難穿過瓊脂糖凝膠的孔徑,因此,形成離上樣孔近的較窄的雜帶。這一雜帶在泳道4、7、10和12尤為明顯。
個別組在加樣孔處也存在較弱的DNA條帶(方形箭頭末端所指),我們推測可能是沒有除盡的蛋白質把加樣孔堵住了,導致少數DNA無法從加樣孔跑到凝膠當中去。這一雜帶在泳道4、7、10和12尤為明顯。
我們組的質粒DNA(0.124g)在泳道13,和其他泳道相比,我們的質粒DNA的條帶稍微偏弱,這說明我們在組提取質粒DNA時有一定的DNA損失,但是我們組的DNA碎片和染色體DNA雜帶也相對較弱,這可能和我們所提取的DNA量較少有關(和泳道4對照,由於此組提取的質粒DNA量較大,所獲得的雜帶也較明顯。因此,不能因為我們組的雜帶少而確定我們組的結果好),也有可能是我們的雜質除去得較為充分(和泳道14相比,我們組的雜帶明亮程度和他們相近,但是我們的目標帶明顯比他們亮度高)。
3.討論
加入5ml 溶液Ⅰ,渦旋的目的是重懸並洗滌菌體。溶液Ⅰ中葡萄糖的作用是為細胞提供等滲環境,
Tris-HCl作為pH緩沖液,為細胞提供適宜酸鹼環境,EDTA(pH 8.0時溶於水)是重要金屬螯合劑,可以與Mg2+、Ca2+等金屬絡合,抑制DNase對DNA的降解作用。離心後盡可能去除干凈上清液,減少培養基對實驗結果的影響。
加入2.0 mL 溶液Ⅰ的作用是重懸並洗滌菌體。
加入4.0 mL溶液Ⅱ的目的:①SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵,使分子去折疊,從而破壞蛋白質分子的二級結構和三級結構而達到裂解細胞的目的。加入溶液Ⅰ後,溶液變得清亮粘稠,變得清亮是由於細胞破碎了,粘稠是由於細胞內蛋白質等有機物析出。加入溶液Ⅰ要慢慢顛倒,使之混勻,不能烈震盪。震盪過於劇烈會使染色體DNA斷裂成碎片,導致在質粒DNA中引入雜質。②NaOH的鹼裂解作用和鹼變性作用:NaOH可以與蛋白質結合(細胞膜含有蛋白質)從而破碎細胞;在pH12.6的鹼性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結構解開而變性,而質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離。因此可通過之後對pH值的調節達到分離染色體DNA與質粒DNA的目的。
此步驟等待時間不能過長,因為強鹼也會破壞質粒DNA。
加入3.0 mL 溶液Ⅲ(5M KAc(pH 4.8))的作用是使質粒DNA復性,而染色體DNA太長難以復性從而沉澱出來。不能復性的染色體DNA與

『捌』 在質粒DNA的提取過程中，應注意哪些操作，為什麼

非本人原創，轉載自網路。認真看。質粒提取需要注意的提到了。
溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；
溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；
溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。
讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那麼50 mM葡萄糖是干什麼的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖後最大的好處只是懸浮後的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那麼EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什麼大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。
輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合後使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了鹼性。很多人不知道其實破細胞的主要是鹼，而不是SDS，所以才叫鹼法抽提。事實上NaOH是最佳 的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了鹼都會幾乎在瞬間就溶解，這是由於細胞膜發生了從bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為SDS也是鹼性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉澱，這是由於沒有正確理解一些書上的有關DNA變性復性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什麼要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的鹼性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩，後面我再詳細說明。
每個人都知道，溶液III加入後就會有大量的沉澱，但大部分人卻不明白這沉澱的本質。最容易產生的誤解是，當SDS碰到酸性後發生的沉澱。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉澱的出現，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉澱，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉澱出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沉澱，那會不會是遇鹽發生的沉澱呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發現SDS在高鹽濃度下是會產生沉澱的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉澱。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發現沉澱的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發生了沉澱。如此看來，溶液III加入後的沉澱實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉澱更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質沉澱了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉澱了。這個過程不難想像，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉澱了，盡管SDS並不與DNA分子結合。
那麼2 M的醋酸又是為什麼而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的鹼性條件會打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉澱了。所以鹼處理的時間要短，而且不得激烈振盪，不然最後得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入後基因組DNA無法快速復性就被沉澱了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產物，與它是不是沉澱下來其實沒有關系。溶液III加入並混合均勻後在冰上放置，目的是為了PDS沉澱更充分一點。
不要以為PDS沉澱的形成就能將所有的蛋白質沉澱了，其實還有很多蛋白質不能被沉澱，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然後進行酒精沉澱才能得到質量穩定的質粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大於氯仿，按道理應該用酚來最大程度將蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心後酚相會跑到上層，不利於含質粒的水相的回收；但加入氯仿後可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提後會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），因此如果單獨用酚抽提後一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉澱時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。至於異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心後上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
回收後的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鍾後離心就可以將質粒DNA沉澱出來。這時候如果放到－20℃，時間一長反而會導致大量鹽的沉澱，這點不同於普通的DNA酒精沉澱回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發生沉澱。如果感覺發生了鹽的沉澱，就用70％的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上，並用tip將沉澱打碎，就能得到好的樣品。得到的質粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進行溶解，不然大量未降解的RNA會干擾電泳結果的。
瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時，多數情況下你能看到三條帶，但千萬不要認為你看到的是超螺旋、線性和開環這三條帶。鹼法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質粒後再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入後過度振盪，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時候抽提到的質粒會有7－10條帶，這是由於特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數不同）所致。

『玖』 DNA粗提取實驗步驟

一 教學目的
1.初步掌握DNA的粗提取和鑒定的方法。
2.觀察提取出來的DNA物質。
二 教學建議
在本實驗的教學中，教師應注意以下幾點。
1.實驗材料必須准備充足。本實驗所用的實驗材料是雞血細胞液,由活雞的鮮血經沉澱後獲得。每組(2個學生)需用5 mL 雞血細胞液,則每班(50人)至少需要130 mL,而雞血細胞液與雞血的體積比為1:3,這樣每班至少需要390 mL 雞血細胞液。宰殺1隻中等大小的活雞,一般可得120 mL 左右的鮮血,因此,1個班實驗需要買4隻活雞。如果不具備購買活雞的條件,也可以到市場售活雞處去索取雞血,但所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑。
2.盛放雞血細胞液的容器,最好是塑料容器。雞血細胞破碎以後釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由於細胞內DNA的含量本來就比較少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就會更少。因此,實驗過程中最好使用塑料的燒杯和試管,這樣可以減少提取過程中DNA的損失。
3.獲取較純凈的DNA的關鍵步驟。
(1)充分攪拌雞血細胞液DNA存在於雞血細胞的細胞核中。將雞血細胞液與蒸餾水混合以後,必須用玻璃棒沿一個方向快速攪拌,使雞血細胞加速破裂,並釋放出DNA。
(2)沉澱DNA時必須用冷酒精實驗前必須准備好大量的體積分數為95%的酒精,並在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。
(3)正確攪拌含有懸浮物的溶液實驗步驟3、5、7,都需要用玻璃棒攪拌。教師應提醒學生注意,在進行步驟3、5時,玻璃棒不要直插燒杯底部,而且攪拌要輕緩,以便獲得較完整的DNA分子。進行步驟7時,要將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間,用手緩慢轉動510 min。
三 參考資料
實驗原理的補充介紹
1.DNA的釋放 DNA位於雞血細胞的細胞核中,正常情況下不會釋放出來。為了使DNA從細胞核中釋放出來,實驗中採用了向雞血細胞液中加入蒸餾水並且攪拌的方法。蒸餾水對於雞血細胞來說,是一種低滲液體,水分可以大量進入血細胞內,使血細胞破裂。同時,再加上攪拌的機械作用,就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂),於是釋放出DNA,當然也有RNA。但是,釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質結合在一起。
2.將DNA與蛋白質分離 根據二者的特性,即在濃度較高的氯化鈉溶液(物質的量濃度為2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游離出DNA。而DNA在濃度較高的氯化鈉溶液中的溶解度很高,Na+與帶負電的DNA結合成DNA鈉鹽。這時DNA在溶液中呈溶解狀態。
3.DNA的析出與獲取 利用DNA在濃度較低的氯化鈉溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的濃度較高的氯化鈉溶液中加入大量(300 mL )蒸餾水,稀釋氯化鈉溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白質的溶解度增高(這就是蛋白質的鹽溶現象),從而使二者分離。這時,加上不停地攪拌,溶解度下降的DNA逐漸呈絲狀物。再通過過濾,濾去蛋白質,就可以獲取DNA的黏稠物了。如果採用離心法則更好,用4 000 r/min 的旋轉頻率,離心15 min ,除去上清液(含有蛋白質),留下的沉澱物中含DNA。
4.DNA的再溶解 再用較高濃度的氯化鈉溶液去溶解DNA黏稠物。
5.DNA的沉澱和濃縮 除去了蛋白質的核酸溶液,必須再進一步沉澱和濃縮。最常用的方法是酒精沉澱法。就是將含有Na+的DNA溶液,加入到相當於其兩倍體積的體積分數為95%冷酒精溶液中,混勻以後可以使DNA沉澱、濃縮,形成含雜質較少的DNA絲狀物,懸浮於溶液中。如果出現的絲狀物較少,可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分。濃縮後的DNA絲狀物,可以用緩緩旋轉玻璃棒的方法捲起(因為玻璃棒有吸附DNA的作用)。
6.DNA的鑒定 本實驗中鑒定DNA的方法為二苯胺法(配方見下述的「葯品配製」)。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而顯現藍色(溶液呈淺藍色)。
鑒定時溶液藍色的深淺,與溶液中DNA含量的多少有關。
二苯胺試劑的配製
A液： 15 g二苯胺溶於100 mL 冰醋酸中,再加15 mL濃硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈結晶狀態,則需加溫後待其熔化,再使用。
B液： 乙醛的體積分數為0.2%的溶液。
配製： 將0.1 mL B液加入到10 mL A液中,現配現用。
DNA粗提取與鑒定的另一種方法
1.材料用具
新鮮菜花(或蒜黃、菠菜)。
塑料燒杯,量筒,玻璃棒,尼龍紗布,陶瓷研缽,試管,試管架,試管夾,漏斗,酒精燈,石棉網,三角架,火柴,刀片,天平。
研磨液,體積分數為95%的酒精溶液,二苯胺試劑,蒸餾水。
2.方法步驟
(1)DNA的粗提取
①准備材料 將新鮮菜花和體積分數為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室,至少24 h。
②取材 稱取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 將碎菜花放入研缽中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④過濾 在漏斗中墊上尼龍紗布,將菜花研磨液濾入燒杯中(有條件的學校可將濾液倒入塑料離心管中進行離心,用1 000r/min的旋轉頻率,離心25 min,取上清液放入燒杯中)。在4 ℃冰箱中放置幾分後,再取上清液。
⑤加冷酒精 將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數為95%的冷酒精溶液中,並用玻璃棒緩緩地輕輕攪拌溶液(玻璃棒不要直插燒杯底部)。沉澱35 min後,可見白色的DNA絮狀物出現。用玻璃棒緩緩旋轉,絮狀物會纏在玻璃棒上。
(2)DNA的鑒定
①配製二苯胺試劑 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混勻。
②鑒定 取4 mL DNA提取液放入試管中,加入4 mL 二苯胺試劑,混勻後觀察溶液顏色(不變藍)。用沸水浴(100 ℃)加熱10 min 。在加熱過程中,隨時注意試管中溶液顏色的變化(逐漸出現淺藍色)。
研磨液的配製方法
Tris：10.1 g(相對分子質量為121.14),先加50 mL 蒸餾水溶解,用物質的量濃度為2 moL/L 的鹽酸調至pH8.0,再加下述葯品。
NaCl：8.76 g(相對分子質量58.44)
EDTA：37.2 g(相對分子質量372.24)
SDS：20 g(相對分子質量288.3)
待上述葯品全部溶解後,再用蒸餾水定容至1 000 mL。
若在室溫低於20 ℃時配製葯液,SDS呈沉澱析出,此時需要加溫,才能將SDS溶解。如果提前配製的研磨液出現了沉澱,則應加溫使沉澱溶解後再使用。
研磨液中幾種葯品的作用
SDS(十二烷基磺酸鈉):可使蛋白質變性,與DNA分離。
EDTA(乙二胺四乙酸二鈉):為DNA酶的抑制劑,可以防止細胞破碎後DNA酶降解DNA。
物質的量濃度為0.15 moL/L的氯化鈉溶液：能很好地溶解DNA。
Tris/HCl：提供緩沖體系,DNA在這個緩沖體系中呈穩定狀態。(Tris為三羥甲基氨基甲烷)
鑒定DNA的其他方法 用紫外燈照射法鑒定DNA效果很好。具體鑒定方法如下。
1.配製染色劑。用蒸餾水配製萬分之五的溴化乙錠(EB)溶液。
2.將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹於蠟紙上,再滴1滴EB溶液染色。
3.將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射(暗室中),可見橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm處)。