① 測定蛋白質中氨基酸含量的主要步驟有哪些為什麼一般分析報告顯示17種氨基酸成分
一般來說人體必須的17種氨基酸，也較為重視
氨基酸的定性測定
一、氨基酸的一般顯色反應
本節介紹三種顯色反應：茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經典的常用顯
色法，後一種是近年來發展起來的熒光顯色法，具有靈敏度高的特點。
1. 茚三酮法
顯色方法有下列數種：
①常用法：將點有樣品的層析或電泳完畢的濾紙充分除盡溶劑，用 5g/L 茚三酮無水丙
酮溶液噴霧，充分吹乾，置65℃烘箱中約30min（溫度不宜過高，避免空氣中氨，以免背
景泛紅色），氨基酸斑點呈紫紅色。
為了使各種氨基酸呈現不同顏色，可用下列方法：
②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液顯色。
③用 1g/L 茚三酮無水丙酮溶液顯色完畢後，再用鹽酸蒸汽熏1min。
④用 1g 茚三酮，600mL 無水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80
℃染色5～10min。
為了使顯色穩定，可用下列方法：
⑤配製含醋酸鎘 2g 加蒸餾水200mL 及冰醋酸40mL 的貯存液。將上述貯存液加200mL
丙酮及2g 茚三酮，即為顯色液。點有樣品的濾紙上浸有此顯色液後，放置於盛有一小杯濃
硫酸的密閉玻璃容器中，25℃，18h，或較高溫度下適當縮短時間。背景色淺，氨基酸斑點
也比較穩定。
⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮異丙酮溶液顯色時，氨基酸斑點呈紅色，也
可在茚三酮顯色後噴以含鈷、鎘或銅等無機離子的異丙醇溶液，斑點自藍紫色變成紅色。
2．吲哚醌法
（1）原理
各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可藉此辯認氨基酸。氨對吲哚醌顯色沒
有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩定，顏色只有在絕對乾燥的環境中才能保存。
（2）試劑
①顯色劑：1g 吲哚醌溶於100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量減少則靈敏度
稍差）。
②底色褪色劑：在 100mL 200g/L 碳酸鈉溶液中加入60g 硅酸鈉（Na2SiO3•9H2O）在水
浴（60～70℃）中加熱攪拌直至完全溶解，待溶液比較清澈為止。在溶解過程中，有時硅酸
鈉會結成凝膠，此時只需繼續攪拌即可溶解。配製時若硅酸鈉用量多則褪色較快，但背景容
易變黃，硅酸鈉用得少（40g），雖裉色較慢，但背景較為潔白。
顯色步驟
層析或電泳後濾紙烘乾後，仔細噴上或塗上顯色劑，用電吹風迅速吹乾，待醋酸氣味不
太刺鼻時移置100℃烘箱烘5～15min，直至顯色為止（溫度不要太高，以免引起減色）注
意觀察所顯出的顏色，然後均勻地塗上底色褪色劑，紙的背景即由黃色變為絳紅而後逐漸變
淺，待黃色背景幾乎褪盡時，迅速用電吹風吹乾，並隨時觀察顏色的變化。例如蘇氨酸在褪
色前為淺紅帶褐色，褪色後則呈橙黃色或黃色：脯氨酸在褪色前為藍色，吹乾時很快褪成無
色。室溫較低時，底色褪色很慢，此時可將褪色劑加溫到30～40℃。溫度過高也不宜，因
氨基酸斑點的褪色速度也同時加快，應該避免。
其他顯色步驟：顯色劑為 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸鋅溶解於70～80mL 熱異丙醇中，冷卻
後加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸鋅溶解於95mL 熱異丙醇中，加3mL 水，冷卻
後加1mL 冰醋酸。點有樣品的濾紙仔細噴以顯色劑後，80～85℃放置10min，背景可用水
迅速浸洗去而不使氨基酸斑點退去
由於吲哚醌試劑配製方法不同，對同一種氨基酸所顯顏色往往也有差異。
3．鄰苯二甲醛法
鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可
用於氨基酸溶液定量，並推廣應用於乙內醯苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白質的檢出和定量。根
據文獻報道，氨基酸紙上層析靈敏度達0.5μmoL，在硅膠薄層層析上為0.05～0.2μmoL。
這里介紹在紙上層析顯現氨基酸方法。（熒光胺是另一種常用的熒光試劑，由於熒光胺來源
比較困難，這里未作介紹）
（1）原理
鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，在鹼性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適
的激發光和發射光波長分別為340nm 和455nm。
各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，
異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。
（2）試劑
鄰苯二甲醛顯色液：取0.1g 鄰苯二甲醛，0.1mg 巰基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油
醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶劑至100mL。放置0.5h 後使用。
顯色步驟
將含有氨基酸樣品的濾紙浸入鄰苯二甲醛顯色液中 1min，冷風吹乾，在溫度18℃以下，
濕度50%～90%之間顯色0.5h，於紫外燈下觀察熒光點。
說明
在濾紙上顯現氨基酸時，鄰苯二甲醛濃度以 0.1%為宜。顯色時必須有一定的濕度，以
便氨基酸溶解，提高分子碰撞機率，並使極性基團解離，促進反應趨於完全。濕度太低，顯
不出熒光。溫度對顯現的熒光延時有顯著影響，溫度高熒光延時短，溫度低熒光延時長。
二、個別氨基酸的顯色反應
利用個別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應定性氨基酸。可應用於紙層析和紙電
泳顯色，也可單獨應用。方法很多，僅將常用的方法介紹如下：
1．精氨酸的顯色——坂口（Sakaguchi）反應
(1)第一種方法
試劑：①5g 尿素溶解於100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加約5g KOH。
②0.7mL 溴水溶解於100mL 5%NaOH 中。
顯色步驟：在點有樣品的濾紙上噴試劑①後，在空氣中吹幾分種，再噴試劑②。精氨
酸或含精氨酸的多肽顯紅色。此試劑對含精氨酸的蛋白質也適用。
(2)第二種方法：
試劑：①1g/L 8-羥基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解於100mL 0.5mol/LnaOH 溶
液中。
顯色步驟：將點有樣品的濾紙烘乾後，噴上試劑①，吹乾後，再噴試劑②。精氨酸或
其他胍類物質顯桔紅色。
2．胱氨酸和半胱氨酸的顯色
試劑：①1.5g 亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5NO2•5H2O）溶於5mL 2mol/L H2SO 4 溶液
中，加95mL 甲醇。此時會有沉澱產生，可保存一個月以上。使用時在每100mL 上述溶液
中加10mL 28%氨水，過濾除去沉澱，清液僅能保持一天左右。②2g 氰化鈉溶於5mL 水中，
然後加95mL 甲醇。此時有沉澱產生，使用時只需搖勻即可。
顯色步驟：半胱氨酸的顯色：在濾紙上噴以試劑①的清液，5min 後半胱氨酸顯紅色。
胱氨酸的顯色：先將濾紙浸入試劑②，迅速取出，稍等片刻再噴試劑甲的清液，5min 後胱
氨酸顯紅色。也可以把試劑②配製的濃度增加一倍，在顯色前混和，再噴到濾紙上。
3．甘氨酸的顯色
試劑；0.1g 鄰苯二甲醛溶於100mL 77%乙醇中。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑，甘氨酸顯墨綠色，在汞燈（365nm）下顯巧克力
棕色。吲哚醌顯色後，再用此試劑仍有效。以甘氨酸為N 端的小肽也能顯色，但其N 端被
保護後，以及其他氨基酸均不顯色。
4．脯氨酸的顯色
試劑：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸鋅，1mL 醋酸，5mL 蒸餾水混和，再加入95mL 異丙醇。
新鮮配製。
顯色步驟：層析濾紙除盡溶劑，噴上以上試劑，80℃～85℃烘箱內放置30min，脯氨酸
顯藍色，再以30℃溫水漂洗除去多餘的試劑後，背景為白色或淺黃色。
也可剪下脯氨酸斑點，在試管中加入5mL 水飽和酚，在黑暗中洗脫15min，間歇振搖，
於610nm 測定其吸光度。從已知標准曲線即可求得樣品內脯氨酸含量，測定范圍5～20μg。
5．絲氨酸和羥賴氨酸的顯色
試劑：①0.035mol/L 過碘酸鈉（748mgNaIO4 溶於數毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 鹽酸，
再用甲醇稀釋至100mL）。②15g 醋酸銨加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙醯丙酮，用甲醇稀釋到
100mL。
顯色步驟：點有樣品的濾紙吹乾，先噴試劑①，近干後再噴試劑②，室溫放置 2h，紫
外燈下照射0.5h，絲氨酸和羥賴氨酸呈黃色斑點，在紫外線下都有熒光。
6．羥脯氨酸的顯色
試劑：①1g 吲哚醌溶於100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 對二甲胺苯甲醛溶於100mL
的丙酮濃鹽酸（9＋1）混合液中。（此試劑不穩定，隔數日後溶液顏色增深發黑，靈敏度降
低，故用時新鮮少量配製。
顯色步驟：將待鑒定的溶液點於小方塊紙上，干後先點上試劑①，熱風吹乾。這時純
羥脯氨酸呈墨綠色，純脯氨酸呈深藍色（極靈敏），對其他氨基酸呈程度不同的紫紅色（不
太靈敏）；然後再點上試劑②吹乾，如溶液中含有羥脯氨酸即轉變為玫瑰紅色，而其他氨基
酸與吲哚醌所生成的顏色則褪去。
7．色氨酸的顯色
(1)第一種方法
試劑：1g 對二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 濃鹽酸。新鮮配製。
顯色步驟：點有樣品的濾紙乾燥後，噴上以上試劑，在室溫下放置幾分鍾後，色氨酸
顯藍色或紫紅色。茚三酮顯色後，仍可使用本法。
(2)第二種方法：
試劑：10mL 35%甲醛加10mL25%鹽酸，20mL 無水乙醇。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上以上試劑後，100℃烘5min，色氨酸在長波長紫外光下
呈現熒光（黃-橙-帶綠色）。
8．酪氨酸的顯色
試劑：①0.1%α-亞硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑①後，吹乾，再噴試劑②，然後在100℃烘3min，
酪氨酸或含酪氨酸的多肽在淺灰綠色的背景上顯紅色，0.5h 後轉變為桔紅色，其後漸退去。
靈敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮顯色後，再用此試劑處理，仍能顯色，茚三酮所顯出的紫紅
色斑點變成紅色。
9．酪氨酸和組氨酸的顯色——pauly 反應
試劑：①4.5g 對氨基苯磺酸與45mL 12mol/L 鹽酸共熱溶解，以蒸餾水稀釋至500mL。
用時取出30mL，在0℃與等體積的5%亞硝酸鈉水溶液相混合。（室溫放置太長會失效）
②10%碳酸鈉水溶液。
顯色步驟：點有樣品的濾紙上噴試劑①，片刻後再噴試劑②。組氨酸及含組氨酸的多
肽顯桔紅色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽顯淺紅色。
第六節 氨基酸定量測定
一、氨基酸的一般定量測定
（一）甲醛滴定法
1．原理
氨基酸具有酸性的-COOH 基和鹼性的-NH2 基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內
鹽。當加入甲醛溶液時，-NH2 基與甲醛結合，從而使其鹼性消失。這樣就可以用標准強鹼
溶液來滴定-COOH 基，並用間接的方法測定氨基酸總量。反應式（有三種不同的推論）如
下：
2．方法特點及應用
此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮氣容量法分析結果相近。在發酵工業中常用此
法測定發酵液中氨基氮含量的變化，來了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，並以此
作為控制發酵生產的指標之一。脯氨酸與甲醛作用時產生不穩定的化合物，使結果偏低；酪
氨酸含有酚羧基，滴定時也會消耗一些鹼而致使結果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反
應，往往使結果偏高。
3．操作方法
吸取含氨基酸約 20mg 的樣品溶液於100mL 容量瓶中，加水至標線，混勻後吸取20.0mL
置於200mL 燒杯中，加水60mL，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L 氫氧化鈉標准溶液滴定至
酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標准溶液mL 數，供計算總酸含量。
加入10.0mL 甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標准溶液繼續滴定至pH9.2，記錄消
耗氫氧化鈉標准溶液毫升數。
同時取 80mL 蒸餾水置於另一200mL 潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標准溶液調至pH8．2，
（此時不計鹼消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氫氧化鈉標准溶液滴定
至pH9.2，作為試劑空白試驗。
4．結果計算
氨基酸態氮質量分數（%）=
式中：V1——樣品稀釋液在加入甲醛後滴定至終點（pH9.2）所消耗氫氧化鈉標准溶液
的體積，mL；
V2——空白試驗加入甲醛後滴定至終點所消耗的氫氧化鈉標准溶液的體積，mL；
c——氫氧化鈉標准溶液的濃度，mol/L；
m——測定用樣品溶液相當於樣品的質量，g；
0.014——氮的毫摩爾質量，g/mmoL。
5．說明
①本法准確快速，可用於各類樣品游離氨基酸含量測定。②渾濁和色深樣液可不經處
理而直接測定。
(二)茚三酮比色法
1．原理
氨基酸在鹼性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應），
可用吸光光度法測定。
該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為 570nm，故據此
可以測定樣品中氨基酸含量。
2．操作方法
(1)標准曲線繪制
准確吸取 200μg /mL 的氨基酸標准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相當於
0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分別置於25mL 容量瓶或比色管中，各加
水補充至容積為4.0mL，然後加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH 為8.04）各
1mL，混合均勻，於水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，加水至標線，搖勻。靜置15min
後，在570nm 波長下，以試劑空白為參比液測定其餘各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克
數為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪制標准曲線。
(2)樣品測定
吸取澄清的樣品溶液 1～4mL，按標准曲線製作步驟，在相同條件下測定吸光度A 值，
用測得的A 值在標准曲線上可查得對應的氨基酸微克數。
3．結果計算
氨基酸含量（mg/100g）=
式中：c——從標准曲線上查得的氨基酸的質量數，μg；
m——測定的樣品溶液相當於樣品的質量，g。
4．說明及注意事項
①通常採用的樣品處理方法為：准確稱取粉碎樣品 5～10g 或吸取樣液樣品5～10mL，
置於燒杯中，加入50mL 蒸餾水和5g 左右活性炭，加熱煮沸，過濾，用30～40mL 熱水洗
滌活性炭，收集濾液於100mL 容量瓶中，加水至標線，搖勻備測。
②茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進行
純化，具體操作可參閱黃偉坤等編著《食品檢驗與分析》。
(三)非水溶液滴定法
1．原理
氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標准溶液滴定其含量。根據酸
鹼的質子學說：一切能給出質子的物質為酸，能接受質子的物質為鹼；弱鹼在酸性溶劑中鹼
性顯得更強，而弱酸在鹼性溶劑中酸性顯得更強，因此本來在水溶液中不能滴定的弱鹼或弱
酸，如果選擇適當的溶劑使其強度增加，則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中
呈現中性，而在冰醋酸中就能接受質子顯示出鹼性，因此可以用高氯酸等強酸進行滴定。
本法適合於氨基酸成品的含量測定。允許測定的范圍是幾十毫克的氨基酸
2．測定
(1)直接法（適用於能溶解於冰醋酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg 左右，溶解
於20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示劑，用0.100mol/L 高氯酸標准液滴定（用10mL 體積
的微量滴定管），終點為紫色剛消失，呈現藍色。空白管為不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至
同樣終點顏色。
(2)回滴法（適用於不易溶解於冰醋酸而能溶解於高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣
品30～40mg 左右，溶解於5mL0.1mol/L 高氯酸標准溶液中，加2 滴甲基紫指示劑，剩餘的
酸以醋酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經過綠、藍至初次出現不褪的紫色為終點。
3．說明
(1)能溶解於冰醋酸的氨基酸，可以用直接法測定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、組
氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解於冰
醋酸，但能溶解於高氯酸可以回滴法測定的有：賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。
(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解於2mL 甲酸中，再
加20mL 冰醋酸，直接用標準的高氯酸溶液滴定。
(四)鄰苯二甲醛法(OPT 法)
1．原理
鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，於鹼性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適
的激發光和發射光波長分別為340 和455nm。可能產物為：
各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，
異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。
本法可用於測定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法約高 100 倍以上，可測到0.1～
1×10－4mol 氨基酸。如用於血清中α-氨基氮的測定，每次血清用量只需5～10μL。與另一
種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無熒光，只有與氨基酸結合才產生熒光。缺點是與脯氨酸
不產生熒光，鄰苯二甲醛與半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已有用於氨基酸自動分析定量分析，
但由於試劑昂貴及個別氨基酸反應不滿意，目前還未普遍應用。
(五)三硝基苯磺酸法
三硝基苯磺酸（TNBS）是定量測定氨基酸的重要試劑之一。TNBS 在偏鹼性的條件下
與氨基酸反應，先形成中間絡合物，如下式所示：
中間絡合物在光譜上有二個吸收值相近的高峰，分別位於355nm 和420nm 附近。然
而溶液一旦酸化，中間絡合物轉化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 處的吸收值
顯著下降，而350nm 附近的吸收峰則移至340nm 處。
利用 TNBS 與氨基酸反應的這一特性，可在420nm 處（偏鹼性溶液中）或在340nm
（偏酸性溶液中）對氨基酸進行定量測定。下表列出各種氨基酸與TNBS 反應後在不同條
件下測定的吸光度。在340nm 處，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 處的吸光度
因氨基酸種類而異；在加入適量SO3
2－時，吸收值升高。
本法允許的測定范圍是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
表 10-3 各種氨基酸與TNBS 反應後在不同條件下測定的吸光度
氨基酸種類 鹼性溶液① 酸性溶液加 SO3
①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，於40℃反應2h，用水補充至4mL，
在420nm 處測定。製作氨基酸濃度—吸光度坐標圖，從曲線中求得各氨基酸於1μmol 時的吸光度。
②條件同上，但在與TNBS 反應時加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最後總體積也是4mL，同樣在420nm 處
測定。
③條件同①，但與 TNBS 反應後加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 處測定。
(六)乙醯丙酮和甲醛熒光法
1．原理
氨基酸與乙醯丙酮和甲醛反應，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙醯基1,4-二氫吡啶，
產生黃-綠色熒光，可用熒光分析法檢測。主要反應如下：
乙醯丙酮 甲醛 氨基酸 熒光物質
2．試劑
混合試劑：取1mol/L 乙酸鈉溶液10mL，加入乙醯丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，
用水稀釋至30mL。
3．測定
取氨基酸液 1mL，加入混合試劑1mL，用棉花塞滿試管口，避光於100℃下加熱10min，
冷卻，加水2mL，然後測定熒光值。
表 10-4 各種氨基酸的發射波長和檢測范圍
化合物（激發波長405nm） 發射波長（nm） 檢測范圍（mg/L）
甘氨酸 485 2～10
苯丙氨酸 490 8～40
絲氨酸 485 5～25
半胱氨酸（鹽酸鹽） 500 20～100
谷氨酸 485 20～100
與標准相比較求出樣品中的氨基酸含量。
二、個別氨基酸的定量測定
（一）賴氨酸的測定
1．原理
用銅離子阻礙游離氨基酸的α-氨基,使賴氨酸的ε-氨基可以自由地與1-氟-2,4 二硝基
苯(FDNB)反應,生成ε-DNP-賴氨酸。經酸化和用二乙基醚提取,在波長390nm 處有吸收峰,
從而求出樣品中游離賴氨酸的含量.
2．試劑
(1)氯化銅液：稱28.0g 無水氯化銅，用水稀釋至1000mL。
(2)磷酸三鈉溶液：稱68.5g 無水磷酸鈉,用水稀釋至1000mL。
(3)硼酸鹽緩沖液（pH9.1～9.2）：稱54.64g 帶有10 結晶水的四硼酸鈉，用水稀釋至
1000mL 。
(4)磷酸銅懸浮液：攪拌情況下，把氯化銅液200mL，緩慢倒入400 mL 的磷酸三鈉溶液
中，把懸浮液以2000r/min 速度離心5min ，用硼酸鹽緩沖液再懸浮沉澱物，洗滌離心3 次，
把最後的沉澱物懸浮在硼酸鹽緩沖液中，並用緩沖液稀釋至1L。
(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀釋至100mL。
(6)賴氨酸-HCl 標准溶液：稱取一定量賴氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作標准液。
(7)100g/L 丙氨酸溶液。
3．測定
(1)稱取通過40 目篩的均勻試樣1.00g，置於100mL 燒瓶中。另吸取賴氨酸-HCl 標准工
作液5mL（相當1mg 賴氨酸-HCl），連同試劑空白同時進行試驗。
(2)向各燒瓶中加入25mL 磷酸銅懸浮液，然後再加10%丙氨酸1.0mL,振搖15min。吸
取10%FDNB 溶液0.5mL.置於各處理燒瓶中,將燒瓶置沸水中加熱15min。
(3)取出燒瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,並不斷搖動使之酸化和分散均勻。
(4)燒瓶中的溶液冷卻至室溫,用水稀釋至100mL.取約40mL 懸浮液進行離心。
(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。並將溶液收集於有刻度試管中,於65℃
水浴中加熱15min，以除去殘留的醚。並記錄溶液的毫升數。
(6)吸取上述各處理液10mL，分別與95%乙醇溶液10mL 混合，用濾紙過濾。
(7)用試劑空白液凋零，測定樣液A390nm，與賴氨酸-HCl 標准液對照，求出樣品中賴氨
酸-HCl 的含量。
本法在 0～40mg/L 賴氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。
4．說明
(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸的濃度，有助於賴氨酸-HCl 濃度
具有良好的線性關系。
(2)用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，並把FDWB
的產物破壞，否則這些產物在390nm 處存在干擾。
（二）色氨酸的測定
1.原理
樣品中的蛋白質經鹼水解後，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生
成哈爾滿化合物（norharman），具有特徵熒光值，可以進行定量測定。
2．試劑
(1)0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸溶液：稱取三氯化鐵(FeCl3•6H2O)41mg，加入10%三
氯乙酸溶液溶解並定溶至500mL。
(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。
(3)色氨酸標准溶液：稱取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解並定容至100mL,
置棕色瓶中備用,使用時用水稀釋成1mg/L 的標准溶液.
3．測定
稱取樣品粉末 100～200mg 於離心管中，加入4mL 乙醚,搖勻後過夜，以3000r/min 速
度離心。將乙醚提取液移入試管內,並用乙醚洗滌殘渣3 次，收集乙醚液於試管中，於40℃
水浴除去醚。殘留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，於110℃水解16～24h。水
解液用4mol/L HCl 溶液調節至pH6～8 後,用水定容至50mL,過濾備用。
吸取濾液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸混合液2mL，
搖勻後於100℃水浴中加熱1h，取出，冷卻後用水定容至10mL。在激發波長為365nm，發
射波長449nm 條件下，測定樣品的熒光強度，與色氨酸標樣作對照，求出樣品中色氨酸含
量。
本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。
② 蛋白質溶液滴加該濃度的乙酸，加熱，有什麼實驗現象
蛋白質溶液滴加該濃度的乙酸，加熱，有什麼實驗現象
在強酸或強鹼溶液中,蛋白質分子帶正電或負電.即使加熱也不會發生沉澱,當蛋白質處於等電點o時,加熱凝固最完全和迅速
③ 為什麼醋酸能使蛋白質變性 不是要強酸才可以嗎 醋酸是弱酸啊
書上沒說只有強酸能使蛋白質變性。強酸性條件下都可以，也就是氫離子達到一定量的情況下都可以。
④ 蛋白質和醋會發生反應嗎
而且甜咸參半的食物，吃後使人神經不安。 2.吃豆腐忌放蔥 吃豆腐放蔥是不科學的，因蔥中含有大量的草酸，可以與豆腐中的鈣結合成為白色沉澱的草酸鈣，使鈣難以吸收，我們知道鈣是人體必需的元素，長期這樣，會降低豆腐的營養價值，如果進食含鈣量豐富的食物較少，則可能使體內缺鈣，出現煩躁不安、抽搐、軟骨症等症狀。因此，在烹制豆製品時，最好少放或不放蔥。 3.奶粉忌用酸梅晶作甜味劑 有些人喜歡把奶粉和酸梅晶放在一起沖泡，用酸梅晶作糖 來使用，這是不科學的。因為在沖泡過程中酸梅晶中的檸檬酸 與奶粉中的蛋白質充分作用，會出現蛋白質凝結的現象，越是攪動，凝結現象就越明顯。因此，不能用酸梅晶或山核晶、菠蘿晶、桔子晶等作為甜味劑。另外，因紅糖也有明顯的酸性，加紅糖後亦發生蛋白質凝結的現象。 4.忌豆腐與菠菜同煮 豆腐是在豆漿中加入鹽鹵或石膏後製成的。鹽鹵中有氯化鎂，石膏含有硫酸鈣，菠菜中含有很多草酸，它可與氯化鎂、硫酸鈣發生化學反應，生成不溶於水的草酸鎂或草酸鈣的白色 沉澱。人體就不能吸收鈣鹽和鎂鹽了。因此，菠菜與豆腐同煮是不科學的。 5.忌紅、白蘿卜同煮 紅蘿卜與白蘿卜同煮是不科學的，因紅蘿卜中含有一種抗壞血酸酵酶，能破壞白蘿卜中的維生素，二者合煮便降低了白蘿卜的營養價值。因此，紅蘿卜與白蘿卜要分開加工。 6.忌蘿卜和人參同用 人參大補元氣、益血生津、寧神益智，對體弱乏力、低血壓、貧血、植物神經功能紊亂等症有良好的效果，是補氣佳品，能強體壯力，特別適用氣虛無力者;而蘿卜有下氣定喘、化積消食之功效。若兩者同時服用，一個補氣、一個破氣，人參的補益作用就會減弱。另外，蘿卜利尿，有消積作用，會影響人參有效成分的吸收，加快排泄，對人參的滋補作用也產生影響。因此中醫認為籮卜和人參同時服用是不科學的。 7.忌酒與咖啡同飲 咖啡的主要成分是咖啡因，其對大腦皮層有選擇性興奮作用。適量飲用咖啡能使人消除或減輕疲勞、振奮精神、增加食慾，提高工作效率。 適量飲酒對人體也是有好處的，因為飲酒後90%的酒精可直接由十二指腸和空腸吸收而進入血液。酒精在肝臟中被轉變為乙醛，並被每個細胞所利用，起到幫助消化、舒筋活血、消除疲勞等作用。適量飲酒，還能增加血液中高密度脂蛋白的流動性，從而降低心臟的發病率。 但是，如果酒與咖啡同飲，即使飲量很少，也會使大腦皮層由極度興奮轉入極度的抑制，並刺激血管擴張，加快血液循環，大大增加了心血管的負擔。其對人體造成的損害比喝酒過量大得多，甚至危及生命。如果過量同飲酒和咖啡，其結果不堪設想。所以，切忌酒與咖啡同飲。 8.忌牛肉與栗子同燉共炒 牛肉甘溫，補中益氣，補脾胃壯腰腳;栗子甘咸而溫，益氣厚腸胃，補腎氣。從食物葯性看二者並無矛盾;從營養成分看，栗子除含蛋白質、糖、澱粉、脂肪外，富含維生素C，每100克中高達40毫克。此外，尚含胡蘿卜素、B族維生素和脂肪酸。栗子中的維生素C易與牛肉中的微量元素發生反應，削弱栗子營養價值。而且，二者不易消化，同燉共炒都不相宜。 在古籍《飲膳正要》中也有「牛肉不可與栗子同食」的記載。同時，有人還發現牛肉與栗子同吃會引起嘔吐。 9.忌肉類與豆類同煮 從營養觀點來看，豆類是不應該與肉類搭配的，原因有以下幾點：①豆類中植酸含量很高，它常與蛋白質和礦物質元素形成復合物而影響二者的可利用性，降低其利用效率。②多酚是豆類的抗營養因素之一，它與蛋白質起作用，影響蛋白質的可溶性，降低其利用率。多酚不僅影響豆類本身的蛋白質利用，在與肉類配合時也影響肉類蛋白質的消化吸收。③豆類纖維素中的醛糖酸殘基可與瘦肉、魚類等葷食中的礦物質如鈣、鐵、鋅等成鼓合物而干擾或降低人體對這些元素的吸收。④豆中含有產氣的化合物一寡糖化合物如棉籽糖、水蘇糖和毛蕊花糖等，由於人體消化系統不分泌半乳糖旮酶，因而不能消化這些化合物。它們在大腸腔內由於細菌的作用，分解後產生大量氣體，加上消化不良等因素形成腹脹氣塞氣滯。 10.忌雞肉與鯉魚同烹 雞肉甘溫，鯉魚甘平。雞肉補中助陽，鯉魚下氣利水，性味不反但功能相乘。魚類皆含豐富蛋白質、微量元素、酶類及各種生物活性物質;雞肉成分亦極復雜。古籍中常可見到雞、魚不可同食的說法，主要不可同煮、同煎炒。 11.忌雞肉與芥末同
⑤ 蛋白質能和醋反應嗎
蛋白質是兩性化合物，-NH2顯鹼性，與酸反應，-COOH顯酸性，與鹼反應。
蛋白質是可以和食醋反應的
將白醋倒入雞蛋清中，並等待，蛋白質變異之後，散發出了惡臭，這種氣體是硫化氫羰基把里邊的巰基替換,釋放出硫化氫
蛋白質還會變性結塊產生沉澱
⑥ 蛋白質與醋酸反應為什麼有沉澱
蛋白質變性發生沉澱
⑦ 專家幫我
尖銳濕疣(Genital Warts，Condyloma acuminata，verruca acuminata)，又稱尖圭濕疣、生殖器疣（陰部疣）、性病疣。近年來由於性病的外延不斷擴大，此病被公認為性傳播疾病，也是現代社會最常見的性傳播疾病之一。
尖銳濕疣是歐美國家最常見的性病之一，其發病率逐年上升，據不完全統計，近15年來，美國尖銳濕疣的發病數增加了5倍。尖銳濕疣在我國也是最主要的性病之一，有些地區發病數佔全部性病病人的20%～31％，為第2位或第3位。我國南方比北方多見，好發年齡在16～35歲之間。尖銳濕疣的傳染性很強，發病率較高，在國外僅次於非淋菌性尿道炎和淋病，占第三位。在國內因尚無有效條件檢測非淋菌性尿道炎，所以它居淋病之後，占第二位，其年增長率超過100%，居各類性病之首。因此，有些單位在體檢時發現20-30%的女性患有尖銳濕疣也就不奇怪了。此病可在幾個月內自然消退，但也有少數病人的病變持續多年，經久不愈。因而要及早發現、及時徹底治療。
尖銳濕疣是性傳播疾病之一，但與淋病、梅毒的傳染方式不同，除了性接觸所致之外，還有30-40%系接觸污染物所致。
病理學
[病原體]
本病的病原體是人類乳頭瘤病毒（HPV）。屬DNA病毒。人體皮膚及粘膜的復層鱗狀上皮上HPV的唯—宿主，尚未在體外培養成功。病毒顆粒直徑為50～55nm。這是非常小的，一般光學顯微鏡是不能看到的，只有藉助電子顯微鏡才能看到。人類乳頭瘤病毒的類型很多，近年來分子生物學技術研究發展迅速，證實人類乳頭瘤病毒有60種以上的抗原型，即這一家族裡有60多個相似而又不同的病毒（亞型），其中至少有10個類型與尖銳濕疣有關（如6，11，16，18及33型，最常見6、11型），而第11，16，18型，則是國外目前研究宮頸癌、外陰癌甚至陰莖癌的最熱門的病毒因子，其長期感染與女性宮頸癌的發生有關。尖銳濕疣與尋常疣、扁平疣、絲狀疣、掌跖疣等，同為感染人類乳頭瘤病毒（HPV）引起。但不同類型的HPV能引起不同的疣。如Ⅰ型主要引起掌跖疣，Ⅱ型主要引起尋常疣，Ⅲ型主要引起扁平疣，而尖銳濕疣主要是由Ⅵ型、Ⅺ型病毒感染所引起。HPV在溫暖潮濕的環境中特別易生存增殖，故男女兩性的外生殖器是最易感染的部位。病毒可自身接種，因此發生於肛門等部位的損害常出現於兩側接觸面。
HPV為乳多空病毒科A屬成員，病毒顆粒直徑50-55nm無被膜的正20面體構成的病毒殼體，具有7900鹼基對的環狀雙鏈DNA組成，電鏡下病毒顆粒的大小、形態與口多瘤病毒極為相似。乳頭瘤病毒（PV）具有種屬特異性，HPV尚未能在組織培養或實驗動物模型中繁殖。
病毒的結構蛋白組成：85%的PV顆粒，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS——PAGE）可確定病毒有主要衣殼蛋白、分子量為56.000；次要衣殼蛋白，分子量遷移於76.000處，發現4種細胞組蛋白與病毒DNA相關。
所有HPV病毒的基因組結構相似，根據在嚴格條件下進行DNA雜交的程序可確定病毒的型和亞型，不同的HPV型DNA與其他類型病毒DNA僅50%出現交叉雜交，迄今已發現60多種HPV類型，隨著研究的深入，將會鑒定出更多HPV新的類型。
[發病機理]
尖銳濕疣的HPV感染通過性接觸傳播，接觸部位的小創傷可促進感染，三種鱗狀上皮（皮膚、粘膜、化生的）對HPV感染都敏感。每一型HPV與特殊的臨床損害有關，且對皮膚或粘膜鱗狀上皮各有其好發部位。當含有比較大量病毒顆粒的脫落表層細胞或角蛋白碎片進入易感上皮裂隙中時，感染就可能產生，它可因直接接觸或少見的自動接種或經污染的內褲、浴盆、浴巾、便盆感染。
病毒感染人體後，可潛伏在基底角朊細胞間，在表皮細胞層復制，HPV侵入細胞核，引起細胞迅速分裂，同時伴隨病毒顆粒的繁殖與播散，形成特徵性的乳頭瘤。晚期基因表達結構多肽，即出現結構蛋白裝配顆粒，病毒主要集中在顆粒層中的細胞核內，在表皮的顆粒層出現凹空細胞增多，組織學上正常的上皮細胞也有HPV，治療後殘余的DNA常可導致疾病的復發。
HPV在皮膚上引起疣贅、在咽部、肛周、生殖器粘膜上形成增殖性病變，其病毒型為小型DNA病毒。感染HPV發生病變多數屬於良性，能自行消退，但也有惡化病例。如肛周、生殖器粘膜上形成扁平上皮癌的報道。還有罕見的遺傳性皮膚疾患、疣贅狀表皮發育異常症（EV）續發的皮膚癌等，在癌細胞中檢出HPV。
流行病學
[流行情況]
尖銳濕疣為人類乳頭瘤病毒所引起。目前一致認為此病在增多，成為STDS中的最常見疾病，在年輕成人中患病率可達0.5%-1%。英國尖銳濕疣發病率從1970年的30/10萬增到1988年的260/10萬，幾乎增加了8倍，美國此病發病率從1966年到1984年增加了6倍。和艾滋病相似，有症狀的尖銳濕疣僅代表感染者的「冰山」之頂，所以如考慮亞臨床感染在內，人類乳頭瘤病毒感染可能是發病率占第一位的性病。此感染的傳播方式包括直接與間接傳播，但以性接觸最為常見，而且越是近期損害越有傳染性，一次性接觸估計有50%被傳染的可能性；其次為直接非性接觸，如自體傳染以及新生兒經產道受染；再其次為間接接觸，通過污染傳染、推測有可能，但因此病病毒尚不能培養，未能證實。
二、尖銳濕疣發生的危險因素
（一）性行為：性伴數及過早性交是造成發生HPV感染的因素。
（二）免疫抑制：HPV感染和與HPV有關的癌似乎是慢性免疫功能抑制的晚期並發症。腎異體移植者中患CA的危險性增加。
（三）HIV感染：HIV陽性發生HPV感染及HPV相關腫瘤的機率增加。
（四）年齡，妊娠：在婦科塗片中檢測HPV高峰流行率的年齡為20-40歲，隨著年齡增加，流行率穩步下降；妊娠期間的HPV檢出率高，產後HPV檢出率下降。
[傳播途徑]
它具有高度接觸傳染性。尖銳濕疣的潛伏期長短不一，一般為3周～8個月，平均為3個月。有的患者，半年前有不潔性交，出現尖銳濕疣後，十分困惑，當大夫詢問病史時，往往否認，其實，病毒在局部潛伏可達8個月之久而不發病，當人體的抵抗力下降時，病毒大量繁殖，即可發病。雖然這些患者未發病，病毒潛伏於人體，它也有傳染性，同樣是傳染源。
(1)直接性接觸傳染 這是主要的傳播途徑。據研究有2/3與尖銳濕疣患者有性接觸的人可發生本病。病期平均在3個半月時傳染性最強，故在性混亂者中最易感染本病。通常通過不潔性交，經受損的皮膚和粘膜感染。調查資料表明，尖銳疣濕就多發生於20-30歲的青年人，而這些病人中，多數有婚外不潔的性亂史。
(2)母嬰傳染 嬰幼兒尖銳濕疣或喉乳頭瘤病和兒童的尖銳濕疣，可能是分娩過程中胎兒經過感染HPV的產道或在出生後與母親密切接觸而感染的。
(3)間接物體傳染 可通過日常生活用品如內褲、浴盆、浴巾傳染。如果女性穿著尼龍內褲，又不注意清潔外陰，黴菌性陰道炎或滴蟲性陰道炎便容易發生，或出現其他感染所致的白帶增多等情況時，局部的浸漬、潮濕便為乳頭瘤病毒的接種，滋生繁衍提供了有利條件。用污染的手搔抓陰部或使用污染的毛巾也會引起尖銳濕疣的傳染。引起感染的原因還有不注意陰部衛生或在便前不注意洗手。人們都知道飯前便後要洗手，殊不知便前或接觸外陰（如更換月經栓或衛生棉）前更應洗手，人們只怕以手接觸外陰會沾污手而不知手也會沾污外陰。
免疫學
宿主對HPV感染引起的免疫應答，包括細胞免疫與體液免疫兩個方面。
一、細胞免疫
人體細胞免疫狀態是影響CA發生、轉歸的重要基礎之一。細胞免疫比體液免疫更為重要。臨床上伴細胞免疫缺陷的尖銳濕疣患者皮疹常持續不退，其外周血中抑制性T細胞數增多NK細胞功能低下，r-干擾素和白細胞介素2產生減少，而消退疣皮損中常常出現活化T細胞和NK細胞的浸潤，部分角朊細胞HLA-DR陽性。
免疫抑制或免疫缺陷時，生殖器HPV感染和HPV相關疾病的發生率均增加。尖銳濕疣中輔助性T細胞耗竭，CD4/CD8比值倒置，其值＜1。在CA病人的外周血中，發現抑制/細胞毒性T細胞百分率顯著增高，輔助/誘導性T細胞的比值和輔助/抑制T細胞比值均降低。宮頸CA和宮頸上皮內瘤樣病變（CIN）病損中朗格罕細胞明顯減少。CA中NK細胞 產生r-干擾素和白介素-2減少。鮑溫樣丘疹病和肛門生殖器癌者中NK細胞對含有HPV-16的角朊細胞的溶解活性下降，可能是對疾病特異性靶細胞的識別缺陷所致，宮頸CA的角朊細胞不表達MHCⅡ型抗原(HLA-DR)，無此抗原提呈功能可以破壞免疫監視作用。
二、體液免疫
目前血清學檢測結果顯示：①抗晚期蛋白抗體產生率為25%-65%，較抗早期蛋白抗體產生率高；②檢測出的HPV抗體似有型特異性，無交叉反應；③抗HPV-16E7抗體與宮頸癌的存在有密切關系；④抗HPV-16E4抗體也是發生宮頸癌、復發或近期HPV感染的標志；⑤估計成人和兒童產生IgG抗體的陽性率相同，不同型別陽性率在10%-75%之間；⑥已證明HPV-16或18型腫瘤抗體陽性患者中，僅50%-70%可檢出該抗體。
三、尖銳濕疣自然消退
對CA自然消退尚無系統評估，然而以安慰劑對照研究發現其自然消退率在0%，17%、18%和69%之間，CA消退或治癒後，仍有45%患者存在潛伏感染，其中67%患者復發。
臨床表現
潛伏期3周到8個月，平均3個月，多見於性活躍的青、中年男女，發病高峰年齡為20-25歲，病程平均在3-5個月的男女患者，在性接觸後不久即發病，而病程平均12個月的男性患者，其性接觸者可不發病。多數患者一般無症狀。損害大小及形狀不等。可僅為數個，亦可為多數針頭樣大的損害：在陰肛部可長成大的腫瘤樣物，有壓迫感；有惡臭味；有時小的濕疣可出現陰部痛癢不適，病人可出現尿血和排尿困難；直腸內尖銳濕疣可發生疼痛、便血，而直腸內大的濕疣則可引起里急後重感。
男性患者好發於包皮系帶、冠狀溝、包皮、尿道、陰莖、肛門周圍和陰囊。病初為淡紅或污紅色粟狀大小贅生物，性質柔軟，頂端稍尖，逐漸長大或增多。可發展成乳頭狀或囊狀，基底稍寬或有帶，表面有顆粒。在肛門部常增大，狀如菜花，表面濕潤或有出血，在顆粒間常積存有膿液，散發惡臭氣味，搔抓後可繼發感染。位於濕度較低乾燥部位的生殖器疣，損害常小而呈扁平疣狀。位於濕熱濕潤部位的疣常表現為絲狀或乳頭瘤狀，易融合成大的團塊。有嚴重肝病的患者濕疣可增大。妊娠可使濕疣復發或生長加快。
亞臨床感染是指臨床上肉眼不能辨認的病變，但用3%-5%醋酸液局部外塗或濕敷5-10分鍾可在HPV感染區域發白，即所謂「醋酸白現象」。
HPV感染和腫瘤的發生：
（一）HPV與皮膚腫瘤的發生有關
它在皮膚癌和其他解剖部位的腫瘤似乎起決定作用。口腔良性贅生物和癌前病變，皮膚鱗狀細胞癌組織中可發現HPV-11、16、18型DNA，曾報道喉部HPV-6乳頭瘤惡變成喉癌，皮膚疣狀表皮發育不良（EV）是HPV潛在致癌作用的證據，EV皮損中發現多種HPV型DNA，並在患者皮膚鱗狀細胞癌中檢出HPV-5、8、14、17及20型，皮膚鱗狀細胞癌似乎是由先已存在的病毒性損害惡變而來。
（二）尖銳濕疣與肛門生殖器癌
生殖器癌與HPV類型有一定的關系。利用DNA雜交技術發現生殖器癌組織中存在HPV-6、11、16、18型等。
1．宮頸癌：根據HPV與宮頸癌的關系，可將其分為兩大類型：低危型主要指HPV-6、11型，高危型是指HPV-16、18型，Gissmann等觀察到在侵襲性宮頸癌中，有57.4%患者存在著HPV-16、18型，其他學者也有相同發現。還有人從侵襲性宮頸癌中分離出HPV-33和35型。
2．皮膚鱗狀細胞癌（SCC）：HPV感染而發生的CA也可能是癌前損害，並可發展成肛門生殖器SCC，這表明HPV是女陰、陰莖及肛門生殖器SCC的重要因素。CA，巨大CA和疣狀SCC組成一個生殖器癌前病變和癌的損害病譜，有些部位生殖器癌病例在其周圍皮膚有CA存在，有時肉眼見為典型的CA，但組織學檢查中發現SCC的孤立病灶。
3．鮑溫樣丘疹病：常見於陰莖、女陰或肛門周圍，曾在皮損內發現HPV-16型DNA。
實驗室檢查
一、醋酸白試驗
用3-5%醋酸外塗疣體2-5分鍾，病灶部位變白稍隆起，肛門病損可能需要15分鍾。本試驗的原理是蛋白質與酸凝固變白的結果，HPV感染細胞產生的角蛋白與正常的未感染上皮細胞產生的不同，只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗檢測HPV的敏感性很高，它比常規檢測觀察組織學變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現假陽性、假陽性變白跡象顯得界限不清和不規則。美國CDC提示，醋酸白試驗並不是特異試驗，且假陽性較常見。
二、免疫組織學檢查
常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法（即PAP），顯示濕疣內的病毒蛋白，以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽性時，尖銳濕疣的淺表上皮細胞內可出現淡紅色的弱陽性反應。
三、組織化學檢查
取少量病損組織製成塗片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結合。在過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成紅色。此法特異性強且較迅速，對診斷有幫助。
四、病理檢查
主要為角化不全，棘層高度肥厚，乳頭瘤樣增生，表皮突增厚，延長，其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細胞和基底細胞並有相當數量的核分裂、頗似癌變。但細胞排列規則，且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點為粒層和刺層上部細胞有明顯的空泡形成。此種空泡細胞較正常大，胞漿著色淡、中央有大而圓，深嗜鹼性的核。通常真皮水腫、毛細血管擴張以及周圍較緻密的慢性炎性浸潤。Bushke-loewenstein巨大型尖銳濕疣，表皮極度向下生長，代替了其下面的組織、易與鱗狀細胞相混，故須多次活檢。若有緩慢發展之傾向， 則為一種低度惡變的過程，即所謂疣狀癌。
五、基因診斷
迄今，HPV難於用傳統的病毒培養及血清學技術檢測，主要實驗診斷技術是核酸雜交。近年來發展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優點，為HPV檢測開辟了新途徑。
（一）標本的採集及處理
1．標本的採集和預處理：用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細胞。在作細胞學檢查的同時，將標本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS離心（3000g，10min）洗滌2次，沉積細胞重懸於1mlPBS中，取0.5ml細胞懸液抽提DNA。
2．標本核酸的提取：按1體積細胞懸液加10倍體積的細胞裂解液（10mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿(1:1)，氯仿/異戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10體積3mol/L NaAc（pH 5.2）及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉澱DNA；加1體積乙醇洗滌1次；用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)溶解DNA，37℃溫育30min。
（二）PCR擴增
1． 引物設計和合成：HPV基因組可分為早期區（E）和晚期區（L），每區含一系列開放讀碼框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非編碼區及E1、E6、E7和L1區均有保守序列。Manos等從HPVL1區中選擇保守序列設計合成引物MY11和MY09見表1，該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補序列，也可擴增其它型HPV。
Manos等設計的HPVL1通用引物
MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG
MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC
表1 HPV型 MY11的第1個鹼基位置 MY09的第1個鹼基位置 PCR產物長度（bp）
6 6722 7170 448
11 6707 7155 448
16 6584 7035 451
18 6558 7012 454
33 6539 6987 448
M=A+C， R=A+G，W=A+T，Y= C+T
表2列述了Manos等設計的寡核苷酸探針。公用混合探針序列選自HPVL1區中另一保守序列，可與 MY11和MY09引物產生的多種HPVL1 PCR擴增產物雜交：型特異探針只與相應HPV型有互補序列，用於檢出的HPV分型。
表2 Manos等設計的HPVL1 PCR產物探針 公用混合探針
GP1 CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC
GP2 CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC
第一個鹼基位置
HPV6 6771 HPV11 6757 HPV16 6631
HPV18 6607 HPV33 6588
型特異探針
探針 HPV型 序列 基因位置
MY12 HPV6 CATCCGTAACTACATCTTCCA 6813—6833
MY13 HPV11 TCTGTGTCTAAATCTGCTACA 6800—6820
MY14 HPV16 CATACACCTCCAGCACCTAA 6926—6945
MY74 HPV18 GGATGCTGCACCGGTCTGA 6905—6922
MY16 HPV33 CACACAAGTAACTAGCTACAG 6628—6648
H=A+C+T，R=A+G，W=A+T，Y=C+T
2．PCR反應試劑：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/L dNTP貯備液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR緩沖液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100μmol/L MY11和MY09貯備液，滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。
3．PCR擴增方法和程序：以100μl PCR反應液,用無菌0.5ml硅化塑料離心管為反應管進行擴增反應。
（1）實驗前配製預混反應試劑並分裝。預混反應試劑包括除標本DNA外的其它各種PCR反應試劑。每支反應管中含有的PCR反應試劑見表3。
表3 每支反應管中的PCR反應試劑
反應試劑 體積（μl） 終濃度
10×PCR緩沖液 10 1×PCR緩沖液
dNTP貯備液 2 200μmol/L每種dNTP
MY11貯備液 0.5 500μmol/L
MY09貯備液 0.5 500μmol/L
Taq DNA聚合酶 0.5 2.5μ
滅菌蒸餾水 75.5
總計 90
（2）各反應管依次加入10μl標本和90μl預混反應試劑。
（3）加入80-100μl石蠟油，在台式離心機上快速離心數秒鍾，使各反應試劑收集於油層下。目前，PCR試劑已商品化，反應體積為25μl。使用時只加入標本DNA即可。
（4）將反應管置PCR擴增儀上，循環參數為95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循環35次，最後72℃延伸5min。
4．每次試驗應設陽性及陰性對照。以載有HPV的重組質粒（每反應為100pg）或含有HPV的細胞系（如Caski、HeLa）DNA為陽性對照，以無HPV的人細胞系DNA為陰性對照。
（三）擴增產物的檢測和分析
1． 凝膠電泳：擴增反應結束後，取出反應管，冷卻至室溫，取10μl擴增產物用5%-7%聚丙烯醯胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀下分析結果，分子量約為450bp處出現明顯的DNA帶。
2． 核酸雜交：如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時，可用標記的公用混合探針和（或）型特異探針作Southern吸印雜交、斑點雜交驗證。
按照標准方法制32P ATP標記的寡核苷酸探針，需達到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml。在55℃緩慢振盪下雜交2-3h，隨後於30-55℃下用洗滌液（2×SSC、0.1%SDS）迅速沖洗雜交膜，除去多餘探針。然後進行洗膜，其條件依所用探針而異：公用混合探針，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探針，56-57℃下10 min，並換液重洗1次；MY14及WD74探針，58-59℃下10min，亦換液重洗1次。
用PCR方法檢測HPV比核酸雜交方法優越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結果，可檢出標本中200個拷貝的HPV DNA，若以核酸雜交檢測PCR產物，敏感性提高，能檢出10個拷貝的HPV DNA。
鑒於PCR技術的高度敏感性，以生殖道脫落細胞為檢材足以滿足試驗要求，避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下，PCR擴增產物經凝膠電泳，觀察產生的DNA可直接作出診斷。因此，PCR技術檢測HPV實驗周期短、簡便快速。
診斷及鑒別診斷
一、診斷
1．不潔性交史。
2．典型皮損為生殖器或肛周等潮濕部位出現丘疹，乳頭狀、菜花狀或雞冠狀肉質贅生物，表面粗糙角化。
3．醋酸白試驗陽性，病理切片可見角化不良及凹空細胞。
4．核酸雜交可檢出HPV-DNA相關序列，PCR檢測可見特異性HPV-DNA擴增區帶。
二、鑒別診斷
1．生殖器鱗癌；多見於40歲以上或老年人，皮損向下浸潤，發生潰瘍，組織病理有特徵性改變。
2．扁平濕疣：為多個濕丘疹融合成片狀的皮損，多見於肛周，皮損處可查到梅毒螺旋體，梅毒血清試驗呈陽性反應。
3．珍珠狀陰莖丘疹病：為沿冠狀溝排列，針頭及粟粒大小的皮色或淡粉紅色丘疹。組織病理無凹空細胞。
4．假性濕疣；損害為局限於小陰唇的粟粒大呈魚卵狀淡紅色小丘疹或絨毛狀改變，皮損表面光滑，醋酸白試驗陰性，病理上無具有診斷意義的凹空細胞。
5．鮑溫樣丘疹病；為棕紅色或色素性小丘疹，組織病理可見異型鱗狀細胞及類似原位癌的組織象。
治 療
由於目前沒有特效的抗病毒葯物，尖銳濕疣的治療必須採用綜合治療。
（一）治療誘因：（白帶過多，包皮過長、淋病）。
（二）提高機體免疫力。
（三）應用抗病葯物。一般只要堅持規則的綜合治療都可治癒。
1． 手術療法
對於單發、面積小的濕疣，可手術切除；對巨大尖銳濕疣，可用Mohs氏手術切除，手術時用冷凍切片檢查損害是否切除干凈。
2． 冷凍療法
利用-196℃低溫的液體氮，採用壓凍法治療尖銳濕疣，促進疣組織壞死脫落，本法適用於數量少，面積小的濕疣，可行1-2次治療，間隔時間為一周。
3． 激光治療
通常用CO2激光，採用燒灼法治療尖銳濕疣，本療法最適用女陰、陰莖或肛周的濕疣。對單發或少量多發濕疣可行一次性治療，對多發或面積大的濕疣可行2-3次治療，間隔時間一般為一周。
4． 電灼治療
採用高頻電針或電刀切除濕疣。方法：局部麻醉，然後電灼，本療法適應數量少，面積小的濕疣。
5． 微波治療
採用微波手術治療機，利多卡因局麻，將桿狀輻射探頭尖端插入尖銳濕直達疣體基底，當看到就體變小、顏色變暗、由軟變硬時，則熱輻射凝固完成，即可抽出探頭。凝固的病灶可以用鑷子挾除。為防止復發，可對殘存的基底部重復凝固一次。
6． β-射線治療
我們應用β-射線治療尖銳濕疣取得了較為滿意的效果，該方法療效高，無痛苦、無損傷、副作用少，復發率低，在臨床上有推廣價值。
7． 葯物療法
（1）足葉草脂：本療法適用濕潤區域的濕疣，例如發生於包皮過長而未曾作包皮環切除手術的龜頭及會陰部的濕疣。但對宮頸尖銳濕疣不能用足葉草脂治療。用20%足葉草脂酊劑塗到皮損處或用葯前，先有油質抗菌葯膏保護皮損周圍的正常皮膚或粘膜 ，然後塗葯，用後4-6小時，用30%硼酸水或肥皂水清洗，必要時3天後重復用葯，該葯是國外用於本病治療的首先葯，一般用一次可愈。但有很多缺點，如對組織破壞性大，使用不當可引起局部潰瘍。毒性大，主要表現為惡心、腸梗阻、白細胞及血小板減少，心動過速、尿閉或少尿，故使用時必須謹慎，發現上述反應時，應立即停葯。
（2）抗病毒葯：可用5%酞丁胺霜劑，或用0.25%皰疹凈軟膏，每日2次，外塗。無環鳥苷口服，每日5次，每次200mg，或用其軟膏外用，α-干擾素每日注射300萬單位,每周用葯五天。或干擾素300萬單位注入疣體基部，每周2次。連用2-3周，主要副作用為流感樣綜合症，局部用葯副作用較少且輕微。
（3）腐蝕劑或消毒劑：常用有30%-50%三氯醋酸或飽和二氯醋酸，或18%過氧乙酸。用10%水楊酸冰醋酸或40%甲醛、2%液化酚、75%乙醇蒸餾水100ml混合溶液，點塗局部，用於龜頭、肛周濕疣，每日或隔日一次，效果甚好。消毒劑可用20%碘酊外塗，或2.5-5%碘酊注射於疣體基部，每次0.1-1.5ml，或用新潔爾滅外塗或以0.1-0.2%外敷，後者需配合全身療法。
（4）抗癌葯
① 5-氟脲嘧啶(5-F u)：一般外用5%軟膏或霜劑，每日2次，3周為一療程。2.5%~5%氟脲嘧啶濕敷治療陰莖、肛周尖銳濕疣，每次敷20分鍾，每日一次，6次為一療程。也可用聚乙二醇作基質，加入占其干質5%的5- F u粉劑製成栓劑，治療男女尿道內尖銳濕疣，也可用5- F u基底注射，多者可分批註射。
② 噻替哌：主要用於5-F u治療失敗的尿道內尖銳濕疣，每日用栓劑（每個含15mg），連用8天，也可將本品60mg加入10-15ml消毒水中，每周向尿道內滴注，保持半小時，副作用有尿道炎。亦可用本品10mg加入10ml浸泡患處，每日3次，每次半小時，治療陰莖、龜頭冠狀溝濕疣，主要用於經其它方法治療後，尚有殘存疣體或復發者。也可將此溶液再稀釋兩倍浸泡局部，以預防復發。
③ 秋水仙鹼：可用2-8%的生理鹽水溶液外塗，塗兩次，間隔72小時治療陰莖濕疣，塗後可出現表淺糜爛。
④ 爭光黴素或平陽黴素：用0.1%的生理鹽水溶液作皮損內注射，每次總量限制在1毫升（1 mg），大多一次可愈。平陽黴素為爭光黴素換代品，用法基本相同，亦有用平陽黴素10 mg溶於10%普魯卡因20ml內注射。
8．免疫療法
① 自體疫苗法:用病人自己的疣體組織勻漿(融冷滅活病毒)，並進行加熱處理（56℃一小時）收集上清液注射，可用於頑固性肛周濕疣。
② 干擾素誘導劑：可用聚肌胞及梯洛龍。聚肌胞每日注射2 ml，連用10天，停葯1-2月後，再繼續用葯。梯洛龍每日3次，每次300 mg，停葯4天，或隔日口服600 mg。
③ 干擾素、白介Ⅱ，靈桿菌素，利百多聯合應用，療效較佳。
預 防
控制性病是預防CA的最好方法。發現治療患者及其性伴；進行衛生宣教和性行為的控制；陰莖套具有預防HPV感染的作用，目前尚無有效疫苗。
⑧ 應用醋酸纖維素薄膜電泳鑒定分離純化根據什麼來確定它是清蛋白還是γ-球蛋白
蛋白質用醋酸纖維素薄膜電泳可分為五個區帶，γ-球蛋白的等電點約為7.3，在pH8.6的巴比妥緩沖液中，帶的負電荷最少，因此在電場中比其它蛋白質移動速度慢。而清蛋白等其它蛋白質的等電點均小於7.3（pl分別為4.9、5.06和5.12），因此在電場中比γ-球蛋白移動速度快，其中清蛋白等電點為4.88帶負電荷最多，速度最快，且清蛋白在血清中含量最多。所以最接近點樣線的是γ-球蛋白，最遠離點樣線的最粗的線是清蛋白。
【沒有查到答案就只能自己整理了，順便來造福一下人類】
⑨ 在試管中加入20滴5%的蛋白質溶液和1滴1%的醋酸，加熱後會發生什麼變化，為什麼
蛋白質的種類不明，無法計算等電點，因此加入醋酸後，可能毫無變化，也可能有沉澱析出。加熱後會變性，空間結構遭到破壞，蛋白質會失去原有的功能。
⑩ 測定蛋白質的等電點為什麼應在緩沖液中進行
假設測定蛋白質的等電點不在緩沖液中進行，當調節pH的時候，每加一滴酸或者鹼因為溶液中沒有緩沖液，pH的變化會非常劇烈，可能從pH7.0會直接跳到pH11.0。這樣就沒有辦法讓pH呈一定梯度的變化。
所以測定蛋白質的等電點應在緩沖液中進行。
一、目的：
了解等電點的意義及其與蛋白質分子聚沉能力的關系。
二、原理：
蛋白質的分子量很大，它能形成穩定均一的溶液，主要是由於蛋白質分子都帶有相同符號的電荷，同時蛋白質分子周圍有一層溶劑化的水膜，避免蛋白質分子之間聚集而沉降。
蛋白質分子所帶的電荷與溶液的pH值有很大關系，蛋白質是兩性電解質，蛋白質在鹼性溶液中成陰離子，在酸性溶液中成陽離子：
蛋白質分子所帶凈電荷為零時的pH值稱為蛋白質的等電點（PI）。在等電點時，蛋白質分子在電場中不向任何一極移動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時可以使蛋白質溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。若再加入一定量的溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質分子爭奪水分子，竭力減低蛋白質水化層的厚度而使混濁更加明顯。
各種蛋白質的等電點都不相同，但偏酸性的較多，如牛乳中的酪蛋白的等電點是4.7~4.8，血紅蛋白等電點為6.7~6.8，胰島素是5.3~5.4，魚精蛋白是一個典型的鹼性蛋白，其等電點在pH12.0~12.4。近年來蛋白質的等電點可以採用等電聚焦技術加以准確測定，但需一定的實驗條件。本實驗採用蛋白質在不同pH溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時的pH值即為該種蛋白質的等電點值，這個方法雖然不很准確，但在一般實驗條件下都能進行，操作也簡便。
四、操作步驟：
1．制備蛋白質膠液
（1）稱取酪蛋白3克，放在燒杯中，加入40℃的蒸餾水。
（2）加入50毫升1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，微熱攪拌直到蛋白質完全溶解為止。將溶解好的蛋白溶液轉移到500毫升容量瓶中，並用少量蒸餾水洗凈燒杯，一並倒入容量瓶。
（3）在容量瓶中再加入1 mol·L-1醋酸溶液50毫升，搖勻。
（4）加入蒸餾水定容至500毫升，得到略現渾濁的，在0.1mol·L-1 NaAC溶液中的酪蛋白膠體。
2．等電點測定
按下表順序在各管中加入蛋白質膠液，並准確地加入蒸餾水和各種濃度的醋酸溶液，加入後立即搖勻。
觀察各管產生的混濁並根據混濁度來判斷酪蛋白的等電點。觀察時可用+，++，+++，表示渾濁度。