nc膜在蒸餾水中浸泡時間過長會如何

Ⅰ 硝酸纖維素膜NC膜的應用舉例

1.分子雜交
雜交技術有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術目前較為常用，先將待測核酸結合到一定的固相支持物上，再與液相中的標記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜。
固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個基本過程：第一，通過印跡技術將核酸片段轉移到固相支持物上；第二，用標記探針與支持物上的核酸片段進行雜交；第三，雜交信號的檢測。
用探針對細胞或組織切片中的核酸雜交並進行檢測的方法稱之為核酸原位雜交。某特點是靶分子固定在細胞中，細胞固定在載玻片上，以固定的細胞代替純化的核酸，然後將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進入組織細胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細胞內。例如。可用特異性的細菌、病毒的核酸做為探針對組織、細胞進行原位雜交，以確定有無該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對於組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應用上有獨特的意義。下面以放射性標記探針與固定在NC膜上的核酸進行雜交為例，雜交反應操作如下：
① 配製所需試劑
SSC溶液(20×)：3mol/L NaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉。
Denhardt』s溶液(50×)：聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。
預雜交液：6×SSC，5×Denhardt』s溶液，0.5%SDS，100?g/ml經變性或斷裂成片段的鮭精DNA。
② 將含靶核酸的NC膜漂浮於6×SSC液面，使其由下至上完全濕潤，並繼續浸泡2分鍾。
③ 將濕潤NC膜裝入塑料袋中，按0.2ml/cm2的量加入預雜交液，盡可能擠出氣泡，將袋封口，置68℃水浴1-2小時或過夜。
④ 將雙鏈探針做變性處理使成單鏈，即於100℃加熱5分鍾，然後立即置冰浴使驟冷。
⑤ 從水浴中取出雜交袋，剪去一角，將單鏈探針加入，盡可能將袋內空氣擠出去，重新封口，並將雜交袋裝入另一個干凈的袋內，封閉，以防放射性污染。
⑥ 將雜交袋浸入68℃水浴，溫育8-16小時。
⑦ 取出雜交袋，剪開，取出濾膜迅速浸泡於大量2×SSC和0.5%SDS中，室溫振盪5分鍾，勿使濾膜乾燥。
⑧ 將NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室溫漂洗15分鍾。
⑨ 將NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，37℃漂洗30分鍾至1小時。
⑩ 將NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，68℃漂洗30分鍾至1小時。
⑾ 取出濾膜，用0.1×SSC室溫稍稍漂洗，然後置濾紙上吸去大部分液體，待做雜交信號的檢測。

Ⅱ 懸賞300分:我想做northern blot,誰幫我設計一下

我只會做
要不傳影象給你

溶液:
(1) 轉移緩沖液：稱取2.9g甘氨酸，5.8g Tris鹼，0.37 SDS，200ml甲醇，加去離子水至1000ml，如果蛋白分子量小可不加SDS。
(2) PBS－T： NaCl 8.0g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4•12H2O 2.9g, 溶於800ml去離子水中，用鹽酸調PH值為7.4，定溶至1000ml，加0.05％Tween20。
(3) 封閉液：5%脫脂奶溶於PBS中
(4) 氨基黑染液：0.2%氨基黑溶於7%乙酸中。
(5) 氨基黑脫色液：30%甲醇, 10%冰醋酸溶液

SDS-PAGE相關溶液
(1).電極緩沖液：
Tris: 6g
甘氨酸： 28.8g
(10% )SDS: 10ml
加1000 ml H2O PH:8.3
(2).分離膠buffer: 100ml:
Tris:36.6g
1N HCL:(約48ml): PH:8.9
加水至：100ml
(3). 濃縮膠buffer: 100ml:
Tris: 5.98g
1N HCL:(約48ml): PH:
加水至：100ml
(4).凝膠貯存液： 100ml:
Acr:30g
Bis:0.8g
加水至：100ml
(5). 4Xloading buffer:
2-Me: 20% 2ml
SDS: 8% 0.8g
Glycerin: 40% 4ml
Bromophenol Blue: 0.4% 0.04g
Tris-CL (ph6.8) 240mM 2.5ml(濃縮膠buffer)
加1.5ml H2O
total: 10ml

(6) 染色液(快速染色配方，染色1小時
0.1% Coomassie blue, 10% acetic acid, 45% methanol
考馬斯藍R-250 1g
甲醇 450ml
水 450ml
冰醋酸 100ml

(7). 脫色液：1000ml
冰醋酸： 75ml
甲醇： 50ml
水： 875ml

細胞裂解液
（1）Buffer A: 25 mM Tris pH 7,5
50 mM KCl
2 mM MgCl2
1 mM EDTA
5 mM dithiothreitol (DTT)
（2）細胞核裂解液
Buffer NE:
25 mM Tris pH 7,5
0.42 M NaCl
1.5 mM MgCl2
0.5 mM EDTA
1 mM dithiothreitol (DTT)
25% Sucrose
0.2% SDS (免疫沉澱不加)
裂解細胞前加入蛋白酶抑制劑至終濃度為 100 mg•L-1 PMSF, 1 mg•L-1 Aprotinin, 2 mg•L-1 Leupeptin

步驟:SDS-PAGE電泳
按照膠配置方法配製不同濃度PAGE膠，電泳置染料抵達分離膠底部，斷開電源。 取下凝膠，
Western Blot
1. 電泳結束後，切下帶有要轉移蛋白泳道的凝膠用，右下角作一標記以確定方向及正反面。
2. 剪1塊與凝膠大小相同的NC膜（不能大於凝膠），右下角作一標記，浸泡於轉移緩沖液中，大約5分鍾。
3. 剪8塊新華1號濾紙，右下角作一標記，其大小略與凝膠相同（不能大於凝膠）。
4. 將剪好的濾紙在轉移緩沖液中浸泡，按陽極到陰極（從下至上）順序安裝轉移裝置: 平放底部電極，在底部電極上放置4張浸泡好的濾紙,精確對齊，將NC膜放在濾紙上，排除氣泡。把SDS-PAGE 電泳凝膠轉移到去轉移緩沖液中漂洗，平放於NC膜上，用玻棒擠出所有氣泡。在其上再放置4張浸泡好的濾紙，排出氣泡。
5. 將上層電極放於夾層物上，連接電源，根據凝膠面積按1mA/cm2接通電源，電轉移2~4h。100mA,2h。
6. 轉移結束後，去除濾紙。把凝膠轉移到考馬斯亮藍染液的托盤中染色，以檢查蛋白轉移是否完全。剪下含分子量標準的NC膜放在氨基黑染液中染色30秒，氨基黑脫色液脫色。
7. 將轉移上蛋白的NC膜以蒸餾水略洗稍干後，浸在封閉液中4℃封閉過夜，然後用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次10min。
8. 將膜與第一抗體室溫孵育2h，第一抗體用PBS-T緩沖液按不同稀釋度稀釋以摸索最合適的一抗濃度，然後PBS-T緩沖液洗膜3次，每次10min。
9. 將膜與HRP標記的羊抗鼠IgG(1:5000)共同孵育1h，PBS-T緩沖液洗膜3次，每次10min。
10. 配製發光底物（按1：1混合底物液）。
11. PBS-T緩沖液洗滌後在化學發光底物顯色2分鍾，凝膠成像系統觀察照相。（或DAB顯色液中避光顯色~15分鍾，出現條帶後立即以水沖洗以中斷顯色反應）。

我只是舉個例子給你看,因為只有你自己想出來的實驗才是得心應手的.別人手把手教你做實驗,那麼你的思路就會跟著別人走,有可能被別人誤導,那你做這個實驗又有什麼意思.

Ⅲ nc膜包被後長時間沒有放進去乾燥會怎麼樣

硝酸纖維素膜NC膜
硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜)，在膠體金試紙中用做C/T線的承載體，同時也是免疫反應的發生處。NC膜是生物學試驗中最重要的耗材之一。

中文名：硝酸纖維素膜NC膜
外文名：nitrocellulose filter membrane
原理：勻漿配比
供應商：PALL(美國)
生產原理

勻漿配比
購買回來的原料硝酸纖維素粒子是一種非常普遍的有機化學物，溶解形成混漿，在該漿體內，通過加入一定比例的試劑來調整最後形成的膜的性質，一般主要包含表面活性劑/高分子聚合物/鹽離子/成型劑等溶解的一個緩沖體系內。不同的廠家加入的溶液配方不一樣，導致了產品的差異。

滾筒鋪膜
配好的勻漿通過滾筒，形成了一張薄膜，平攤在十分光滑的平面載體上。過程與造紙非常相似。

成型
當勻漿內的成型劑開始揮發，膜逐步乾燥成型。同時在這個過程中由於溫度比較高，有些廠家在這個過程採取了在密閉腔體內成型，同時補充配方溶液的形式，來避免一些有效成分的蒸發。

Ⅳ 做western blot 的時候我把膜在甲醇里泡了一下，結果膜毀了。之前看資料說要在甲醇里泡一下的，怎麼會這樣

我也是這樣的情況，膜直接化了，不過，轉膜緩沖液也有甲醇啊，這個怎麼辦？

Ⅳ 轉膜時間太長，小蛋白會不會從膜中穿過

影響因素應該有很多；一、首先需確定目的蛋白是否在膠上：跑完電泳可以先考馬斯亮藍染膠，如果在marker的指示下看到了目的蛋白的清晰條帶，基本可以確定蛋白已經在膠上跑開。二、膜的准備：1.根據被轉移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的pvdf膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm兩種規格的pvdf膜。大於20kd的蛋白可用0.45μm的膜，小於20kd的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就會發生「blowthrough」的現象。pvdf膜靈敏度、解析度和蛋白親和力比常規的膜要高，非常適合於低分子量蛋白的檢測。2.pvdf膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鍾，以使表面基團活化，有利蛋白結合。三、三明治做好後放入已經加入轉膜液的轉膜槽，連接電極，方向是膠負膜正。轉膜過程在4度冰箱中或置入冰水浴中進行。四、時間和電壓或電流依照分子量大小：分子量越大，時間越長，電壓或越大。轉移時間一般為1.5
小時，(
1ma-2ma/cm2，10%
gel)，可根據分子量大小調整轉移時間和電流大小。本人覺得17kd的蛋白可以試試恆壓90v40min。僅供參考。

Ⅵ 硝酸纖維素膜的NC膜的選擇

以上談了該行業的一些發展現狀,那麼我們大致了解後,回到最關心的問題,如何選擇膜? 經常會遇到的問題是,我是做**項目的,我該選擇那類膜?
這里涉及到一個膜的分類標准問題,一個供應商可能提供這個膜是8um,但另一個供應商告訴你膜是135s的.這之間的區別與聯系是什麼?
um指的是膜孔徑,而從上面膜的生產過程,我們可以看出,膜的孔徑實際上是沒有辦法界定的.由於乾燥成型等過程的非絕對均一,膜的孔徑也是非均一的.膜孔徑的說法實際上是沿用了一直以來的一個形象稱呼.而以秒為單位的定義為,每4cm膜,水的層析時間是***s.該單位已經越來越被各大廠商所接受,成為了一個通用的比較標准.以下我們將採用s單位來進行交流.
換算情況大致為: 8um=135s; 6um=180s.
不同秒數的膜對反應有什麼影響呢?
首先,我們分析一下液體在膜上的運動過程. 一張長度為4cm的膜, 每隔1cm做一個標記, 當液體運動過標記處時記錄時間點. 那麼你將會發現液體在膜上的運動是呈減速前行的. 而兩張不同秒數的膜(例如135s, 180s)在同一時間標記點處的運動速度不同.這個試驗用清水做不好觀察,可以考慮用色素水溶液,非常明顯.
那麼從這個試驗可以看出,在通過同一T線噴點位置時, 金溶液通過的速度是快速膜>慢速膜. 那麼通過速度越快和包被在T線的物質反應時間也就越短, 讀數快, 那麼靈敏度也就越低. 反之, 反應時間長, 讀數慢, 也就靈敏度高. 同時還有一個問題是, 反應時間越長, 發生非特異性結合的可能性就越大, 所以過長時間的反應不一定就能夠真正的提升靈敏度. 所以這里就有一個讀數時間/反應靈敏度/非特異性結合的均衡.
其實我們並沒有那麼多選擇. 經過使用實踐, 各供應商一般都只提供兩個型號, 就是135s和180s. 雖然看到有些廠家的產品目錄上型號種類繁多,但這兩個型號的定貨量就佔了95%以上, 其他型號供貨上也就遠不如這兩個型號來得順利. 135s一般用在雙抗體夾心法, 180s一般用在競爭法. 你所要做的是,先選擇其中的一個型號, 然後比較不同供應商同一個型號的差異, 由於前面說的添加配方與你的試驗條件配合的不同,這個差異可能大也可能小. 具體要根據試驗結果來確定最後的選擇.
我個人不建議地毯式的測試不同規格/不同廠家的膜, 這樣成本高, 成功的幾率也小.

Ⅶ 硝酸纖維素膜NC膜的應用技巧

從本節開始，我們開始對膜進行深入討論和談一些應用技巧。
1. 蛋白與膜的結合原理
蛋白與膜的結合原理， 已知的結合力包括疏水作用力H鍵靜電作用力等，確切的結合原理並不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說：
1）首先兩者靠靜電作用力結合，然後靠H鍵和疏水作用來維持長時間結合。
2）首先兩者靠疏水作用結合，然後靠靜電作用來維持長時間結合。
兩條假說，都表明其結合過程分為兩步，首先結合和後面長時間結合。由於結合原理的不明確性，導致在這方面的工作非常依賴實踐經驗。
2. 膜對結合的影響
1）膜孔徑
有些技術人員傾向使用膜孔徑來區分不同的膜，但是請注意這只僅僅限於同一廠家的產品，如果是不同廠家的產品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關系，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數為表面積比率（實際可用表面積與所用膜平面積的比率）。
另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那麼金標復合物通過T線的時間也就越長，反應也就越充分。
綜合以上兩點，結論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結合的機會，也就是假陽性越高.所以要按照試驗結果挑選適合實際項目的膜，找到合適的平衡點。
2）不同廠家的膜差異
這個差異主要來源於兩點：
1> 生產膜時，使用的聚合物和表面活性劑的來源，類型，數量不同。同理，在膜處理中這兩類物質一般會對性能產生較大影響。 2> 處理過程不同。
3. 生物原料，緩沖溶液的試劑和配方
1）生物原料， 作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這里只做略述。
首先，單克隆抗體與膜的結合優於多克隆抗體，主要時由於多克隆抗體有很多不同的表面位點，而各位點與膜的最佳結合條件都有細微的差別，毫無疑問就增加了優化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結合到固相材料上。
2）緩沖液
大家最關心的可能就是希望獲得一個性能優良的配方，包括緩沖液，封閉液等等處理溶液配方。
其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應體系需要不同的配方來支持， 而不同機構的反應體系又有差異。想獲」魚」先學」漁」.。為了不誤導大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。
緩沖液的構成一般是：PBS（或其他緩沖體系）+作用物質（針對某一特定問題）+PH調整. 我在參考過以前的各種資料後，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據自己的需要添加作用物質，原來的很多需要添加的作用物質，由於膜製造技術的改進已經不再需要。
推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2， 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應性。
作用物質的情況大致羅列如下：
少量NACL，減少信號強度，消假陽。
有機醇（甲醇，異丙醇等），潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利於結合包被。個人不推薦，因制膜工藝改進。
表面活性劑（TW20，TX100），增加親水力，可避免線條中空現象，也可增色。
糖，保護劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。
調PH到某個位置，可以消假陽。
4. 點樣環境
環境濕度對點膜過程非常重要。最佳濕度一般在45-65%。濕度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現散點，導致測試會出現疏水斑。濕度過高，膜上毛細作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴散。為了保證點樣時膜濕度的均一性，一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。
5. 點樣儀器與膜面情況的關系
目前有兩種點樣方式，劃膜式和非接觸點膜式.非接觸點膜式優於劃膜式，進口劃膜式優於國產劃膜式。
因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質為軟脆，劃管會在其表面留下印痕.進口的劃膜機由於使用的材料和控制系統較好，所以留下的劃痕較輕，而國產儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴重。 劃痕容易對層析的金標復合物形成阻力，導致假陽性。 同時容易出現跑板時在T線位置出現若有若無一條細線（鬼線），而跑板結束後鬼線消失的奇怪現象。
6. 膜的寬度與點樣位置
膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種， 分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標復合物通過T線位置時速度變慢，反應時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。
7. 溶液在膜上的擴散
溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當乾燥時線條邊緣的乾燥速度高於中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴散，所以乾燥後抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發現線條出現兩端紅，中間淡的現象，就要考慮這個問題了。可以加如上面說的作用物質來解決。
8. 點膜前後的封閉作用
從供應商處購買回的膜基本上都是已經優化處理好的，直接點膜就可使用.然而我們還是經常會遇到關於封閉的討論。其實封閉不象大家認為的那樣，一封閉什麼問題都解決了. 老問題走了新問題又來了，而且更麻煩，我要說的是慎用封閉。我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產膜時候，各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內，必然擾亂了膜內正常的物質分布。由此引發了許多問題，也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題，其實可以通過其他辦法來解決，封閉必然是下測。
我經常使用的封閉手法有兩種：流動封閉，將作用物質處理在樣品墊上。膜上定點封閉，將作用物質配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭，可以將不合格的半成品大板重新復活。只要是將封閉做在了膜上，就必然會對產品的穩定性造成影響，具體的影響程度要通過穩定性測試來評判。
9. 膜的儲存
剛生產出的膜一般含有5-10%的水分。關於膜的老化機理，有個理論支持，不過爭議比較大。理論認為：膜的老化是因為膜上的水分蒸發，使膜變得疏水，帶電荷並變脆。儲存膜一般要求是避光，密封，過干或過濕都不利。在這種保存條件下，一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理，就要根據具體試驗情況來判斷了。有些膜由於生產工藝的問題，使用後靈敏度會在一段時間內發生變化，遇到這種問題，就需要在點膜後放置一段時間，待穩定後方可進入調試生產。
硝酸纖維素膜NC膜
規格: 15X20cm
孔徑: 0.45μm
保存: 5-15℃密封保存,保質期一年
產品簡介: 本品外觀潔白，膜正面呈光澤，與水接觸應立即浸潤，不能立即浸潤老者視為失活，不能點樣，膜面有花斑或有粉性結構皆視為次品。用於轉移電泳，宜選孔經0.22或0.45，以保證膜的強度，並減少穿透損失，硝纖膜過份乾燥時脆,濕時有彈性，操作時室內應保持中常溫度，避免過份乾燥，防止發脆，本品靜電吸附膜的親水性好，滲濾時間適中，蛋白吸附力強，轉膜的蛋白集中而不擴散，顯色的靈敏度和特異性高，背景低。