抗原修復方法用蒸餾水

1. 請教免疫組化的具體步驟！

一 免疫組化（ LP 法）操作步驟 ：

1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行

2. 緩沖液洗 3min/2 次。

3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鍾。

4. 緩沖液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鍾以封閉非特異性的背景染色。

（註：孵育不要超過 10 分鍾，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）

6. 緩沖液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）

8. 緩沖液洗 5min/2 次。

9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增強子 ) , 在室溫下孵育 20 分鍾。

10 ．緩沖液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶標二抗 ) ，在室溫下孵育 30 分鍾。

（註： HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）

12 ．緩沖液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鍾。（具體時間由染色深淺決定。）

14 ．自來水充分沖洗 , 復染，脫水 , 透明 , 封片。

二．免疫組化 ( 三步法 ) 操作步驟 ：

（ 1 ）、石蠟切片脫蠟至水。

（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鍾 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。

（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鍾，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。

（ 5 ）、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。

（ 6 ）、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。

（ 7 ）、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。

（ 8 ）、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鍾。

（ 9 ）、 PBS 沖洗， 5 分鍾 x3 次。

（ 10 ）、顯色劑顯色 3-15 分鍾（ DAB 或 NBT/BCIP ）

（ 11 ）、自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

三. 冰凍切片免疫組化染色步驟：

冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鍾後，入 4 ℃丙酮固定 10分鍾，PBS洗，5分鍾x3，用過氧化氫孵育5-10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。以下同石蠟切片免疫組化

2. 用什麼方法進行抗原修復拜託了各位 謝謝

真空負壓抗原修復法： ① 切片脫蠟至水。 ②0.3%H2O2甲醇真空負壓處理5分鍾。 ③自來水洗，蒸餾水洗。 ④0.01M檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0)，真空負壓乾燥箱預先調至95℃，真空負壓處理10分鍾。 ⑤待修復注降至室溫的一，PBS洗3次，隨後按選好的免疫組化染色方法進行染色。 生物幫上面有這方面的詳細介紹， http://proct.bio1000.com/101641/ 二抗產品批發， 二抗產品價格

3. ：檸檬酸抗原修復液的配方

1.大鼠采血和選用什麼抗凝劑(采血,抗凝劑,大鼠,血液,血常規)
2.0.5%的甲基纖維素溶液配製(甲基纖維素,溶液配製,裸鼠,灌胃,粘度)
3.野百合鹼溶解困難(野百合鹼,肺動脈高壓,生理鹽水,配製)
4.b6小鼠飲食中鉀的控制(飲食,小鼠,含量,配製,對照組)
5.6-ohda分裝和配製(6-ohda,配製,帕金森,抗壞血酸,生理鹽水)
6.小鼠腹腔注射甲醛的一些問題(甲醛,腹腔注射,小鼠,甲醛溶液,動物實驗)
7.鼠腦電鏡固定液能保存多久(固定液,腦電鏡,現配現用,多聚甲醛,配製)
8.2%伊文思藍的配製(伊文思藍,配製,大鼠,血腦屏障,溶液配製)
9.啊拜託啦(配製,多聚甲醛)
10.小鼠麻醉後第二天死亡 腹部變黑(死亡,麻醉,腹部,小鼠,腹腔)
11.多聚甲醛配製(配製,多聚甲醛)
12.60%果糖老鼠飼料這么配製老鼠會不會將飼料中的果糖挑出來不吃(果糖,配製)
13.求指點dab具體配製步驟(配製)
14.請問各位前輩關於試劑配製的問題，謝謝(配製,試劑,緩沖液,碳酸氫銨,脫氧膽酸鈉)
15.配製好的環磷醯胺溶液的保存(環磷醯胺,配製,生理鹽水)
16.4%多聚甲醛固定液配製問題(配製,多聚甲醛固定液,多聚甲醛,石蠟切片,分層)
17.枸櫞酸鹽工作液、儲存液有哪些區別(枸櫞酸鹽,儲存液,溶液配製)
18.實驗室常用溶液配製(配製,緩沖液,溶液配製,二甲苯青,溴酚藍)
19.肝素鈉溶液的配製(配製,肝素鈉,效價)
20.向做過帕金森大鼠模型的同道們 (大鼠模型,帕金森,多巴胺,配製,劑量)
21.順鉑的配製(順鉑,配製,生理鹽水)
22.酒精性肝損傷大鼠實驗(大鼠,肝損傷,配製,死亡率,實驗數據)
23.d-gal建小鼠衰老模型劑量選擇與配製注意事項(劑量,衰老,小鼠,配製,半乳糖)
24.請問用伊文思藍做大鼠微血管滲透性實驗的溶液配製方法及具體實驗方法(滲透性,大鼠,微血管,伊文思藍,溶液配製)
25.硫酸軟骨素酶chabc配製問題(配製,硫酸,軟骨素酶,牛血清白蛋白,動物實驗)

4. 求免疫組化冰凍切片熒光染色具體流程

wifgw
石蠟切片免疫組化染色步驟

石蠟切片免疫組化染色步驟
1、載玻片的處理： 抗原修復過程中，由於高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：
1.1 APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鍾，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾乾即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，並盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。
1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鍾，然後用雙蒸水快速清洗三次，室溫乾燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、乾燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鍾，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜乾燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃製品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鍾，主要用於細胞內抗原的顯示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鍾，主要用於細胞間質抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。
g/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鍾。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10 3、抗原熱修復： 可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配製，取該粉劑一包溶於1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水後，3％H2O2處理10分鍾，蒸餾水洗2分鍾×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間並持續10~15分鍾（注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鍾（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置於金屬架上，放入鍋內，使切片位於液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鍾後），計時1~2分鍾，然後將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫後，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗後，PBS洗2分鍾×3，下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水後，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，並將此容器置於盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鍾，然後端離電爐，室溫冷卻20~30分鍾，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。 4、免疫組化染色步驟： （以美國ZYMED公司SP試劑盒為例）
石蠟切片脫蠟至水。
3%H2O2室溫孵育5~10分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。
蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鍾，(如需採用抗原修復，可在此步後進行)。
5~10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鍾。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鍾；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鍾；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
顯色劑顯色（DAB或AEC）。
自來水充分沖洗，復染，封片。
冰凍切片免疫組化染色步驟
m，室溫放置30分鍾後，入4℃丙酮固定10分鍾，PBS洗，5分鍾×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鍾×2。冰凍切片4~8

免疫組化非特異性染色的消除方法
一、非特異性染色的主要因素
組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點：
（1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去
。
（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。
（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。
（4）從組織中難於提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附於正常組織上而呈現非特異性染色。
（6）熒光素不純，標本固定不當等。 二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據產生的原因採取適當的方法，常用的方法有以下幾種：
（一）動物臟器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次後，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收後之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應作吸收前後之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織乾粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織乾粉或勻漿沉澱物吸收之。
用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min
10min離心沉澱，用其沉澱物吸收其熒光抗體即能完全達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收後放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的製法】
（1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結締組織的脂肪。
（2）剪碎，用生理鹽水反復洗滌至無血色止，然後再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。
（3）將肝勻漿裝入離心管內（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉澱15 min後，再除去上清液。
（4）最後用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉澱，將沉澱物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤乾（過夜）。
（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過後，分裝，密封，低溫乾燥保存。
2006-12-22 13:24 wifgw
二）透析法
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質大分子不能透過，可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。
（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內，液面稍留空隙，緊扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS中（懸於大於標記物體積約50～100倍的PBS內），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然後再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量後，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留於上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、後三部分收集，測F/P比值，合格者合並，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發生沉澱反應），繼續洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素後，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未完全洗脫時即出現NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現蛋白時，即進行收集，之後出現SO4++（用1%BaCl2檢查發生白色沉澱）。最後是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉澱），待洗脫液無SO4++及NH4+後可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
（四）DEAE纖維素柱層析法
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下： DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以乾重每克交換20～50mg標記蛋白量為宜
。常用梯度洗脫法如下：
（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標記物上柱後，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據床體積大小每梯度乘3），然後依下列各種離子強度洗脫液，
分別洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脫部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脫部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脫部分3。
將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合並，濃縮保存備用。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。
（2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續增加NaCl的濃度至
2.0mol/L洗脫完。
經過DEAE-纖維素層析後的標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。
（五）熒光抗體稀釋法
先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。
（六）純化抗原法
用各種方法提純單一成分的抗原是產生單價特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學技術（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關專著。
（七）純化抗體法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應，為此需要吸收，常採用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制備 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現混濁，逐現大塊膠塊，放置30min後，用研缽將凝膠磨細，繼用1.0mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液反復洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。
2．免疫吸收法 將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉澱，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏藍（Evans blue）襯染法
用0.01%伊文氏藍的0.01mol/L pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規應用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存於4℃，用前再稀釋至0.01%用以
和然釋熒光抗體。
此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。

5. 求助HE染色和免疫組化

• HE染色是應用最廣泛的組織病理學常規染色技術。
  一染色程序
  1．石蠟切片HE染色（常規HE染色）
  （1）二甲苯Ⅰ 5～10min
  （2）二甲苯Ⅱ 5～10min
  （3）無水乙醇Ⅰ 1～3min
  （4）無水乙醇Ⅱ 1～3min
  （5）95%乙醇Ⅰ 1～3min
  （6）95%乙醇Ⅱ 1～3min
  （7）80%乙醇 1min
  （8）蒸餾水 1min
  （9）蘇木素液染色 5～10min
  （10）流水洗去蘇木素液 1min
  （11）1%鹽酸-乙醇 1～3s
  （12）稍水洗 1～2s
  （13）返藍（用溫水或1%氨水等） 5～10s
  （14）流水沖洗 1～2min
  （15）蒸餾水洗 1～2min
  （16）0.5%伊紅液染色 1～3min
  （17）蒸餾水稍洗 1～2s
  （18）80%乙醇 1～2s
  （19）95%乙醇Ⅰ 2～3min
  （20）95%乙醇Ⅱ 2～3min
  （21）無水乙醇Ⅰ &, nbsp; 3～5min
  （22）無水乙醇Ⅱ 3～5min
  （23）石炭酸-二甲苯 3～5min
  （24）二甲苯Ⅰ 3～5min
  （25）二甲苯Ⅱ 3～5min
  （26）二甲苯Ⅲ 3～5min
  （27）中性樹膠封固
  註：①（12）和（13）項可省去，但（14）的沖水時間需延長至10～15min（細胞核顯示更清晰）。
  ②（23）項可用無水乙醇代替；北方地區可省略。
  2．冰凍切片HE染色
  （1）冰凍切片固定 10～30s
  （2）稍水洗 1～2s
  （3）蘇木素液染色（60℃） 30～60s
  （4）流水洗去蘇木素液 5～10s
  （5）1%鹽酸-乙醇 &n, bsp; &nbs, p; &nb, sp; 1～3s
  （6）稍水洗 1～2min
  （7）返藍（用溫水或1%氨水等） 5～10s
  （8）流水沖洗 15～30s
  （9）0.5%伊紅液染色 1～2min
  （10）蒸餾水稍洗 1～2min
  （11）80%乙醇 1～2min
  （12）95%乙醇 1～2min
  （13）無水乙醇Ⅰ 1～2min
  （14）無水乙醇Ⅱ 1～2min
  （15）石炭酸-二甲苯 2～3min
  （16）二甲苯Ⅰ 2～3min
  （17）二甲苯Ⅱ 2～3min
  （18）中性樹膠封固
  註：①（7）和（8）項可省去，但（9）的沖水時間需延長至10～15min（細胞核顯示更清晰）。
  ②（15）項可用無水乙醇代替；北方地區可省略。
  二染色結果：細胞核呈藍色，細胞漿、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細菌可呈藍色或紫藍色。
  三染色注意事項
  1．切片染色前，應徹底脫蠟。
  2．用含有升汞液體固定的組織，其切片染色前應先脫去汞鹽：
  （1）石蠟切片脫蠟至水洗
  （2）Lugol液 20min
  （3）流水沖洗 5min
  （4）95%乙醇 10min
  （5）水洗 1min
  （6）5%次亞硫酸鈉水溶液 5min
  （7）流水沖洗 5min
  （8）顯微鏡觀察除汞滿意後，轉入HE染色
  3．脫除福爾馬林色素（必要時）：
  （1）石蠟切片脫蠟至水洗
  （2）1%NaOH(1ml)與80%乙醇（99ml）混合液 10min
  （3）流水沖洗 5min
  （4）轉入HE染色
  4．嚴格執行HE染色流程，用顯微鏡控制細胞核的蘇木素染色質量。HE染片應著色鮮艷，紅、藍分明，對比清晰。
  5．載玻片自二甲苯中取出後，應立即用潔凈、光亮的蓋玻片和稠度適宜的中性樹膠濕封載玻片。封蓋處內無氣泡，外無溢膠。封片時必須進行操作人員和局部環境的二甲苯污染防護。不應將組織切片烤乾或風干後再行封片。
  6．必須在載玻片的一端牢貼標簽。標簽上應印有病理科所在的醫院名稱。標簽上應清楚顯示有關的病理號及其亞號；標簽上的病理號應准確無誤，無塗改。
  7．製片完成後，技術人員應對切片與其相應的病理學檢查記錄單或取材工作記錄單認真進行核對；確認無誤後，將制備好的切片連同相關的活檢申請單/活檢記錄單以及取材工作單等一並移交給有關的病理醫師；交接雙方經核對無誤後，辦理移交簽字手續。
  8．石蠟切片-HE染色的優良率（甲、乙級切片所佔的比率）應≥85%。石蠟切片-HE染色質量的基本標准列於附表。
  9．製片工作一般應在取材後2個工作日內完成（不含進行脫鈣、脫脂等需要特殊處理的標本）。
  10．製片過程出現意外情況時，技術室人員應及時向病理醫師和科主任報告，設法予以補救。
  
  附表 常規石蠟包埋-HE染色切片質量的基本標准
  優 質 標 准 滿 分 質 量 缺 陷 減 分
  ⒈組織切面完整， ①組織稍不完整：減1～3分②不完整：減4～10分
  內鏡咬檢、穿刺標本切面數 10 ③未達到規定面數：減5分
  
  ⒉切片薄(3～5μm)，厚薄均勻 10 ①切片厚(細胞重疊)，影響診斷：減6～10分
  ②厚薄不均勻：減3～5分
  
  ⒊切片無刀痕、裂隙、顫痕 10 ①有刀痕、裂隙、顫痕，尚不影響診斷：減2分
  ②有刀痕、裂隙、顫痕，影響診斷：減5分
  
  ⒋切片平坦，無皺褶、折疊 10 ①有皺褶或折疊，尚不影響診斷：各減2分
  ②有皺褶折或折疊，影響診斷：各減5分
  
  ⒌切片無污染 10 有污染：減10分
  
  ⒍無氣泡（切片與載玻片間/ 10 ①有氣泡：減3分
  蓋片與切片、載玻片間）， ②膠液外溢：減3分
  蓋片周圍無膠液外溢
  
  ⒎透明度好 10 ①透明度差：減1～3分
  ②組織結構模糊：減5～7分
  
  ⒏細胞核與細胞漿染色對比清晰 10 ①細胞核著色灰淡或過藍：減5分
  ②紅(細胞漿)與藍(細胞核)對比不清晰：減5分
  
  ⒐切片無鬆散，裱貼位置適當 10 ①切片鬆散：減5分
  ②切片裱貼位置不當：減5分
  
  ⒑切片整潔， ①切片不整潔：減3分
  標簽端正粘牢，編號清晰 10 ②標簽粘貼不牢：減3分
  ③編號不清晰：減4分
  合 計 100
  切片質量分級標准： ①甲級片： ≥90分 （優）
  ②乙級片：75～89分（良）
  ③丙級片：60～74分（基本合格）
  ④丁級片： ≤59分 （不合格）
  
  四HE染色試劑的配製
  1．蘇木素染液
  （1）Harri蘇木素染液
  蘇木素 1g
  無水乙醇 10ml
  硫酸鋁鉀 20g
  蒸餾水 200ml
  氧化汞 0.5g
  冰醋酸 8ml
  先用無水乙醇溶解蘇木素，用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀；然後將該兩液合並煮沸，加入氧化汞，繼續加熱和攪拌溶液至深紫色，隨即用冰水冷卻，恢復至室溫後過濾備用。使用前加入冰醋酸並混勻、過濾。
  （2）Gill改良蘇木素液
  蘇木素 2g
  無水乙醇 250ml
  硫酸鋁鉀 17g
  蒸餾水 750ml
  碘酸鈉 0.2g
  冰醋酸 20ml
  先用無水乙醇溶解蘇木素，用蒸餾水溶解硫酸鋁鉀；然後將該兩液混合，再依次加入碘酸鈉和冰醋酸。使用前過濾。
  （3）Mayer改良蘇木素液
  A液：蘇木素 2g
  無水乙醇 40ml
  B液：硫酸鋁鉀 100g
  蒸餾水 600ml
  將蘇木素溶於無水乙醇中（A液）；稍加熱，使硫酸鋁鉀溶於蒸餾水中（B液）。將A液與B液混合後煮沸2min，再用蒸餾水補足至600 ml，加入400mg碘化鈉充分混勻。染液呈紫紅色。
  2. 鹽酸－乙醇分化液
  濃鹽酸 1 ml
  70%乙醇 99 ml
  3．伊紅液
  （1）0.25～0.5%伊紅Y水溶液
  伊紅Y 0.25～0.5 g
  蒸餾水 100 ml
  冰醋酸 1滴
  （2）0.5%伊紅Y-氯化鈣水溶液
  伊紅Y 0.5 g
  蒸餾水 100 ml
  無水氯化鈣 0.5 g
  （3）0.25～0.5%伊紅Y-乙醇溶液。
  伊紅Y 0.25~0.5 g
  80%乙醇 100 ml
  4．石炭酸-二甲苯混合液
  石炭酸 1份
  二甲苯 3份
  
  石蠟組織切片的HE染色
  
  1．取材組織塊，經固定後，常規石蠟包埋，4μm切片。
  
  2．切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸餾水洗2min。
  
  3．蘇木素染色5min，自來水沖洗。
  
  4．鹽酸乙醇分化30s（提插數下）。
  
  5．自來水浸泡15min或溫水（約50℃）5min。
  
  6．置伊紅液2min。
  
  7．常規脫水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性樹脂封固。
  
  免疫組化操作規程
  
  （一）、儀器設備
  1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；
  2）水浴鍋
  （二）、試劑
  1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
  2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。
  3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。
  4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris鹼，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。
  5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配製。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配製。
  6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配製。
  7）封裱劑：
  a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；
  b、油和TBS(或PBS)配製。
  8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用於熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合於光學顯微鏡標本。
  （三）、操作流程
  1、脫蠟和水化
  脫蠟前，應將組織晶元在室溫中放置60分鍾或60℃恆溫箱中烘烤20分鍾。
  1）組織晶元置於二甲苯中浸泡10分鍾，更換二甲苯後再浸泡10分鍾；
  2）無水乙醇中浸泡5分鍾；
  3）95%乙醇中浸泡5分鍾；
  4）70%乙醇中浸泡5分鍾；
  2、抗原修復
  用於福爾馬林固定的石蠟包埋組織晶元。
  1）抗原熱修復
  （1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置於金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鍾，然後將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鍾後，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去後打開蓋子。本方法適用於較難檢測或核抗原的抗原修復。
  （2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織晶元加熱10~15分鍾。
  （3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰後將組織晶元放入，斷電，間隔5~10分鍾，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
  2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鍾；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鍾。適用於被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
  3、免疫組織化學染色
  SP法
  1）脫蠟、水化；
  2）PBS洗2～3次各5分鍾；
  3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鍾；
  4）PBS洗2～3次各5分鍾；
  5）抗原修復；
  6）PBS洗2～3次各5分鍾；
  7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鍾。甩去多餘液體。
  8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
  9）4℃過夜後需在37℃復溫45分鍾。
  10）PBS洗3次各5分鍾；
  11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
  12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
  13）PBS洗3次各5分鍾；
  14）DAB顯色5～10分鍾，在顯微鏡下掌握染色程度；
  15）PBS或自來水沖洗10分鍾；
  16）蘇木精復染2分鍾，鹽酸酒精分化；
  17）自來水沖洗10～15分鍾；
  18）脫水、透明、封片、鏡檢。
  SABC法
  1)脫蠟、水化。
  2)PBS洗兩次各5分鍾。
  3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鍾，蒸餾水洗3次。
  4)抗原修復。
  5)PBS洗5分鍾。
  6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。
  7)滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜後在37℃復溫45分鍾）。
  8)PBS洗三次每次2分鍾。
  9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鍾。
  10)PBC洗3次每次2分鍾。
  11)滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鍾。
  12)PBS洗4次每次5分鍾。
  13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
  14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鍾、鹽酸酒精分化。
  15)脫水、透明、封片、鏡檢。
  
  PAS染色法
  
  操作步驟
  
  1. 固定液:用Carnoy液或75%酒精 Carnoy固定液: 純酒精 60 ml 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml
  
  2. 染色液
  
  1) 過碘酸酒清夜配法:
  
  過碘酸(HIO .2H O) 0.4g 95% 酒精 35ml M/5醋酸鈉(2.72g+蒸餾水100ml) 5ml蒸餾水10ml
  
  保存於冰箱內,用棕色瓶,可用兩周.
  
  2) Schiff氏液:
  
  0.5克鹼性品紅加入100毫升蒸餾水中,時時搖動三角瓶5分鍾,使之充分溶解.冷卻至50℃後過濾,加入10毫升1N鹽酸.冷卻至25℃,加入0.5-1克偏重硫酸鈉,在室溫中至少靜置24小時,然後密封冰箱保存.
  
  3) Schiff氏酒精液配置 Schiff氏液 11.5ml 1N HCI 0.5ml 純酒精 23ml
  
  4) 亞硫酸水
  
  1%偏重亞硫酸鈉 10ml 1N HCI 10ml 蒸餾水 180ml的樹膠溶解。
  
  Schiff（希弗）試劑
  在100 mL熱水裡溶解0.2 g品紅鹽酸鹽（也有叫鹼性品紅或鹽基品紅），放置冷卻後，加入2g亞硫酸氫鈉和2 mL濃鹽酸，再用蒸餾水稀釋到200 mL。
  或先配製10 mL二氧化硫的飽和水溶液，冷卻後加人0．2g品紅鹽酸鹽，溶解後放置數小時使溶液變成無色或淡黃色，用蒸餾水稀釋至200 mL。
  此外，也可以將0.5 g品紅的鹽酸鹽溶於100 mL熱水中，冷卻後用二氧化硫氣體飽和至粉紅色消失，加人0.5 g活性炭，振盪過濾，再用蒸餾水稀釋至500 mL。本試劑所用的品紅是para-rossaniline（或稱para-fuchsin,又稱假紅）。此物與另一類似物rossaniline（或稱fuchsin,稱洋紅）不同。
  品紅溶液原是桃紅色，被二氧化硫飽和後變成無色的Schiff試劑。
  Schiff試劑應密封貯存於暗冷處，倘若受熱見光或露置空氣中過久，試劑中的二氧化硫易失，結果又顯桃紅色，遇此情況，應再通入二氧化硫，使顏色消失後使用。但應指出，試劑中過量的二氧化硫愈少，反應就愈靈敏。

• 
  

6. 經多聚甲醛固定的冰凍切片要做抗原修復嗎

冰凍切片一般不需要抗原修復，石蠟切片需要抗原修復。目前進行的常規石蠟切片標本，一般均用甲醛固定。事實上經甲醛固定的部分組織細胞，免疫組化標記敏感性明顯降低，其原因為：(1)在用甲醛固定過程中形成醛鍵而封閉了部分抗原決定簇；(2)甲醛在保存過程中會形成羧甲基，而封閉抗原決定族；(3)在用固定劑固定時，會使蛋白與蛋白之間發生交聯，也可能會封閉抗原決定族。因此在染色時為取得良好的染色效果，必須對有些抗原進行預先修復。對於冰凍切片用丙酮或甲醛固定效果較好。因為你是用4%PFA固定還是要考慮做抗原修復的。修復抗原的方法很多，一常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。也有人用蒸餾水修復抗原，方法如下：將脫蠟水洗過的切片放入盛有蒸餾水的容器中，置微波爐內高中火5 min煮沸，中低火維持沸騰狀態10 min。

7. 關於微波爐抗原修復

①該試劑也應注意有多種不同的含水分子量。
②該貯存液久放後可出現結晶。每次使用前，先取出回至室溫，搖晃其結晶溶解，也可用微波爐促其快速溶解，然後再用。
0.01M PBS工作液的配製：
取一2000ml的容量瓶一個，裝入已稱好的NaCt18g，加入少量蒸餾水讓其徹底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸餾水湊足2000ml，即可使用，即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周，但以新配為佳。
PBS工作液配製完畢後，都要測其PH值，如果偏酸，可用氫氧化鈉來調試，如果偏鹼可用HCl調試，測試有如下n種方法：
①PH測試筆測試，這是一種簡便、易行、結果較為准確的測試方法。當配製完PBS後，取一小杯，倒入配好的PBS，插入測試筆，打開開關，小屏幕上將可出現測出的PH結果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4調校，大量的可用氫氧化鈉調校。PH如果高於7.6，小量的用0.2M NaH2PO4調校，大量的可用HCL來調校。
②用試紙來測試：PH試紙有兩種，一種為廣泛PH試紙，范圍在1-14，另一種是精密試紙有各種各樣的范圍。但是，作為沖洗切片用的PBS，其精確度不需要十分精確，如配PH7.6時，測試時在PH7.5或7.7，都可使用。試紙測試PH值，停靠其反應的顏色來確定，十分簡便，一般的試劑都可用它來測試。
③儀器測試：對於要求較高，需較准確的PH值，須彩用儀器測試。
1. Tris緩沖溶液(Tris buffer solution,TBS)
①1N HCL ，濃HCL(雙重1.19)8.3ml，先取50ml蒸餾水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL緩沖液(PH7.6)
取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g，加入少許的蒸餾水攪拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然後用蒸餾水湊足100ml，於4℃冰箱保存。
臨用時，將上述溶液10稀釋倍，即為0.05M工作液。

8. 抗原修復的選擇合適的孵育時間

第一抗體的孵育時間，有較多的使用范圍，應用於臨床檢測抗體的孵育時間。一般室溫下孵育在30-60分鍾，120分鍾，對於研究性質的抗體孵育時間，也可按照上述的時間，但也有人提出於4℃冰箱中過夜孵育，根據我們的經驗一般不主張於4℃冰箱中過夜，原因是：
1.長時間的孵育可以使一些非特異性的物質沉澱下來，或者被吸附，造成背景的染色。
2.目前銷售的抗體，純度較高，特異性較強，不需要長時間的孵育，也能夠結合得很好。
3.長時間的孵育，較容易引起切片的脫落，造成染色的失敗。
4.長時間的孵育，不利於臨床病理報告的發出。
X、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現象。
免疫組化染色方法較多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，這時就必須要仔細地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據選用的抗體來進行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應的免抗鼠IgG，這樣才能連接上（目前生產廠家已生產出混合型抗體，即既適合於單克隆抗體，也適合於多克隆抗體。使用者不用擔心連接不上，隨便使用都可，但如果沒有訂購混合型的試劑盒，就必須注意的型號，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時間可在10分鍾，20分鍾或者30分鍾，一般在室溫中進行，如果室溫低於20℃以下，則可在37℃的孵育箱中進行。
XI、復合物的使用及孵育時間的確定。
各種方法有各自的復合物，如ABC法，復合物是卵白素和生物素結合的復合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的復合物是鏈雪菌素蛋白復合物，再帶有HRP，EV二步法的復合物則是二抗和三抗連接在一起的復合物，再帶上HRP，除此之外，根據水解底物的不同，可產生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產生黃棕色，帶AP的酶，水解的底物一般為AEC產生紅色。
XII、PBS的沖洗
免疫組化的染色過程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在PBS的沖沖洗洗中度過，PBS沖洗的正確與否，也是導致最後結果的關鍵。
1.單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完後，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染，影響最後的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。
2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對准切片沖洗，這樣由於沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導致切片的脫落。
3.沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
沖洗切片有人提出用微振盪器振染，振下未結合的各種物，使之不產生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實踐認為，用一小燒杯柔和地於切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好於切片上再注入PBS，持續2分鍾左右就完全足夠了。
4.PBS的PH和離子強度的使用和要求。
劉彥仿指出：中性及弱鹼性條件（PH7－8）有利於免疫復合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫復合物的形成，而高離子強度則有利於分解。[]免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據本室十幾年來的使用情況，認為該溶液價格便宜配製方面，使用效果好。
5.常用試劑的配製和使用。
在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，DAB的配製都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏鹼，都將影響染色的結果。下面將介紹有關方面的內容：

9. 1mM的 Tris/EDTA PH9.0抗原修復液怎麼配製

先配製 1M Tris, 方法如下：
121.1g Tris, 加水至1L.
再配製 500mM EDTA, 方法如下：
372.2/2=186.1g EDTA, 加水至1L。
因為1M=1000mM, 取1ml 1M Tris, 2ml 500mM EDTA, 調節PH至9.0.
再加水補足到1000ml.

10. 免疫組化用的枸櫞酸鹽緩沖液需要現配現用嗎

抗原修復用枸櫞酸鹽緩沖液是0.01M,ph6.0左右，配製方法：貯存液 A 0.1M檸檬酸鈉(Na3C6H5O7.2H2O2): 29.41g溶於1000ml蒸餾水；B 0.1M檸檬酸(C6H8O7.H2O2)：21.0g溶於1000ml蒸餾水；工作液 ：取9.5ml的A液、40.5ml的B液，蒸餾水補充至500ml即可用，不需現配現用。