粗蛋白蒸餾裝置漏氣驗證方法

1. 為什麼蒸餾裝置不能漏氣

若蒸餾一些有毒物質,那後果不堪設想

2. 如何檢測家禽類飼料中的粗蛋白

凱氏法測定試樣中的含氮量，即在催化劑作用下，用硫酸破壞有機物，使含氮物轉化成硫酸銨。加入強鹼進行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收後，再用酸滴定，測出氮含量，將結果乘以換算系數6.25，計算出粗蛋白含量。
2、試劑
2.1 硫酸（GB 625）：化學純，含量為98％，無氮。
2.2 混合催化劑：0.4g硫酸銅，5個結晶水（GB 665），6g硫酸鉀（HG 3—920）或硫酸鈉（HG 3—908），均為化學純，磨碎混勻。 2.3 氫氧化鈉（GB 629）：化學純，40％水溶液（m/V）。 2.4 硼酸（GB 628）：化學純，2％水溶液（m/V）。
2.5 混合指示劑：甲基紅（HG 3—958）0.1％乙醇溶液，溴甲酚綠（HG 3—1220）0.5％乙醇溶液，兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為三個月。
2.6 鹽酸標准溶液：鄰苯二甲酸氫鉀法標定，按GB 601制備。 2.6.1 鹽酸標准溶液：c（HCl）=0.1mol/L。8.3mL鹽酸（GB 622，分析純），注入 1 000mL蒸餾水中。
2.6.2 鹽酸標准溶液：c（HCl）=0.02mol/L。1.67mL鹽酸（GB 622，分析純），注入1 000mL蒸餾水中。 2.7 蔗糖（HG 3—1001）：分析純。 2.8 硫酸銨（GB 1396）：分析純，乾燥。
2.9 硼酸吸收液：1％硼酸水溶液1 000mL，加入0.1％溴甲酚綠乙醇溶液10mL，0.1％甲基紅乙醇溶液7mL，4％氫氧化鈉水溶液0.5mL，混合，置陰涼處保存期為一個月（全自動程序用）。
3、 儀器設備

3.1 實驗室用樣品粉碎機或研缽。 3.2 分樣篩：孔徑0.45mm（40目）。 3.3 分析天平：感量0.0001g。 3.4 消煮爐或電爐。
3.5 滴定管：酸式，10、25mL。 3.6 凱氏燒瓶：250mL。
3.7 凱氏蒸餾裝置：半微量水蒸氣蒸餾式。 3.8 錐形瓶：150、250mL。 3.9 容量瓶：100mL。 3.10 消煮管：250mL。
3.11 定氮儀：以凱氏原理製造的各類型半自動。
4、 試樣的選取和制備
選取具有代表性的試樣用四分法縮減至200g，粉碎後全部通過40目篩，裝於密封容器中，防止試樣成分的變化。
5 分析步驟
5.1.1 試樣的消煮
稱取試樣0.5～1g（含氮量5～80mg）准確至0.0002g，放入凱氏燒瓶中，加入6.4g混合催化劑，與試樣混合均勻，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，將 凱氏燒瓶置於電爐上加熱，開始小火，待樣品焦化，泡沫消失後，再加強火力 （360～410℃）直至呈透明的藍綠色，然後再繼續加熱，至少2h。
5.1.2 氨的蒸餾：
將試樣消煮液冷卻，加入20mL蒸餾水，轉入100mL容量瓶中，冷卻後用水稀釋至刻度，搖勻，做為試樣分解液。將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示劑的錐形瓶內。蒸汽發生器 的水中應加入甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則需補加硫酸。准確移取試樣分解液10～20mL注入蒸餾裝置的反應室中，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4min降下錐形瓶使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內，然後停止蒸餾。
5.1.2.3 蒸餾步驟的檢驗
精確稱取0.2g硫酸銨，代替試樣，按5.1.2步驟進行操作，測得硫酸銨含氮量為21.19±0.2％，否則應檢查加鹼、蒸餾和滴定各步驟是否正確。
5.1.3 滴定
用5.1.2.1或5.1.2.2法蒸餾後的吸收液立即用0.1mol/L或0.02mol/L（4.6.2）鹽酸標准溶液滴定，溶液由藍綠色變成灰紅色為終點。
6 、空白測定

稱取蔗糖0.5g，代替試樣，按第5章進行空白測定，消耗0.1mol/L鹽酸標准溶液的體積不得超過0.2mL。消耗0.02mol/L鹽酸標准溶液體積不得超過0.3mL。
7、 分析結果的表述
7.1 計算見下式：
粗蛋白質（％）=（V2-V1）·c×0.0140×6.25/（m×V＇/V） ×100 式中：V2── 滴定試樣時所需標准酸溶液體積，mL； V1── 滴定空白時所需標准酸溶液體積，mL； c── 鹽酸標准溶液濃度，mol/L； m── 試樣質量，g；
V── 試樣分解液總體積，mL； V── 試樣分解液蒸餾用體積，mL；
0.0140── 與1.00mL鹽酸標准溶液〔c（HCl）=1.000mol/L〕相當的、以克表示的氮的質量。
6.25── 氮換算成蛋白質的平均系數。
7.2 重復性
每個試樣取兩個平行樣進行測定，以其算術平均值為結果。 當粗蛋白質含量在25％以上時，允許相對偏差為1％。 當粗蛋白含量在10％～25％之間時，允許相對偏差為2％。 當粗蛋白質含量在10％以下時，允許相對偏差為3％。

3. 有機化學實驗，怎麼檢查水蒸氣蒸餾裝置不漏氣

不行 水加熱放出的水蒸氣太多 如果只是小孔漏氣 就檢查不出來
手握蒸餾燒瓶 導管一端插入水中 如果有氣泡冒出 說明氣密性良好

4. 測蛋白時如何檢查其是否漏氣

直觀點就是用眼看。再一個就是變色時間長的話也有可能漏氣。最後，可以測一個硫酸銨。

5. 凱氏定氮法影響蛋白質測定結果准確性的因素有哪些

1、樣品消化的完全程度。如：被濃硫酸脫水的樣品（有機物），炭化成的內氮，由於消化不容完全就不能被二氧化硫完全還原成氨，就會造成測定結果偏低。
2、消化溫度。消化食不能用強火，應保持緩和沸騰，以免粘附在凱氏瓶內壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下未消化完全而造成氮損失。
3、蒸餾裝置的氣密性。若氣密性差（漏氣），蒸餾出來的氨氣就會揮發流失。（所以，漏斗加鹼後應立刻水封，以免氨氣由此處逸出而造成損失。）
4、吸收液的溫度。硼酸吸收液的溫度不應超過40℃，否則對氨的吸收作用減弱，而造成氨損失。

6. 進行蒸餾裝置，如何檢查裝置氣密性

1、如圖將導管出口埋入燒杯的水中，用手掌焐熱燒瓶，觀察燒杯中管口是否有氣泡回逸出，過一會兒答移開手，觀察浸入水中的導管末端有無水上升形成水柱。若焐時有氣泡溢出，移開手有水柱形成，說明裝置氣密性良好，可以安心開始實驗。

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對水蒸氣發生器進行加熱，稍後發現三口燒瓶中的水蒸氣導入管口冒出氣泡則證明密封良好，反之漏氣。

它利用混合液體或液-固體系中各組分沸點不同，使低沸點組分蒸發，再冷凝以分離整個組分的單元操作過程，是蒸發和冷凝兩種單元操作的聯合。

與其它的分離手段，如萃取、Absorption等相比，它的優點在於不需使用系統組分以外的其它溶劑,從而保證不會引入新的雜質。

7. 粗蛋白的測定有沒有比凱氏定氮更好地方法呀

主要成分是蛋白質。檢驗方法是剴氏定氮法。

蛋白質的測定方法

pro的測定方法分為兩大類：一類是利用pro的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測定pro含量，另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸、鹼性基團和芳香基團測定pro含量。但是食品種類很多，食品中pro含量又不同，特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此pro的測定通常利用經典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標准酸液吸收，用標准酸或鹼液滴定，由樣品中含氮量計算出pro的含量。由於食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。

一 凱氏定氮法

這種方法是1883年Kjeldahl發明，當時凱氏只使用H2SO4來分解試樣，來定量穀物中的pro，他只知用H2SO4分解試樣，而不能闡明H2SO4分解有機氮化合物生成氨的反應歷程，所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長時間，後來由Gunning加入改進，他改進的辦法是在消化時加入K2SO4使沸點上升，這樣加快分解速度，因為溫度由原來硫酸沸點的380上升到400℃，提高了不到67℃所以速度也就加快了，凱氏定氮法至今仍在使用。

我們在檢驗食品中pro時，往往只限於測定總氮量，然後乘以pro核算等數，得到蛋白質含量，實際上包括核酸、生物鹼、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質氮化合物，故稱為粗pro。

1 凱氏常量定氮法：

不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的，首先第一個步驟是消化：

（1）消化：樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機物脫水。並破壞有機物，使有機物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，則與硫酸結合成硫酸銨，留在酸性溶液中。

（2）在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解，它與硫酸反應生成硫酸氫鉀，可提高反應溫度，一般純硫酸加熱沸點330℃，而添加硫酸鉀後，溫度可達400℃，加速了整個反應過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點增加。加速了有機的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會分解，放出氨而造成損失。

為了加速反應過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。

所以有機物全部消化後，出現硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為鹼性反應指示劑。

（1）蒸餾：樣液中的硫酸銨在鹼性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。

（2）吸收與滴定：

蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標准硫酸或標准鹽酸溶液進行氨的吸收，然後再用標准氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收後，再用標准鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應，它有吸收氨的作用。

1．操作步驟：

准確稱取樣品中0.50-2.00g→於500ml凱氏瓶中→加10g無水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通風櫥中先以小火加熱，待泡沫消失後，加大火力，消化至透明無黑粒後，將瓶子搖動一下使瓶壁炭粒溶於硫酸中→繼續消化30分鍾→至到樣液呈綠色狀態，停止消化，冷卻→加200ml水→連接蒸餾裝置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波動珠數粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加熱→至到K氏瓶內殘液減少到三分之一時，取出用水沖洗→用0.1N HCl滴定。

N（V2-V1）0.014

W

計算：

總氮量%= （N(V2-V1)×0.014）/W × 100

0.014----氮的毫克當量數

pro%=總氮%×K

乳製品K=6.38（N=15.7%）

小麥粉K=5.79（N=17.6%）

動物膠K=5.6（N=18.0%）

冰蛋K=6.7（N=14.8%）

大豆製品K=6.0（16.7%） K=6.25則（N=16%）

K-換稱等數

各種試劑的作用:

濃H2SO4：

A ：脫水使有機物炭化，然後有機物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2，本身則變為CO2

B： 氧化

C： pro與濃H2SO4生成NH3↑，CO2，SO2，H2O↑

D： NH3與H2SO4生成硫酸銨

（1）CuSO4的作用（催化劑）

CuSO4為紅色沉澱，當C完全消化後，反應停止，紅色消失，變為蘭色，即為消化達到完全，蘭色為CuSO4的顏色

（2）K2SO4的作用（提高沸點）

沸點由330℃提高到400℃加速了反應過程。

（3）硒粉和過氧化氫，氧化汞都為催化劑，但為了防止污染通常採用硫酸銅

（4）50%NaOH的作用

下面我就針對幾點來說明為何影響氨化完全和速度快的因素:

（1）K氏燒瓶和取樣量

如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對於縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。

（2）分解劑

A H2SO4和K2SO4的添加量

有機無分解需要H2SO4量，H2SO4應根據有機物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g樣品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml

這種比例在國內外都使用，是公認的

還有一種比例： K2SO4：H2SO4=10：20ml

B 催化劑

用作催化劑的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，對Hg，HgO有毒但結果好，Se與CuSO4得到結果是一種，TiO2，的結果偏低，採用不同的催化劑則消化時間不同， HgO消化麥子為38，Se與CuSO4消化麥子55，TiO2消化麥子70，所以在給出測定結果時要註明催化劑的類型。

（3）熱源的強度

消化時熱源的強度同迅速消化和完全氨化關系很大，即便鹽類K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒有意義的，熱源過強導致H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，頸部的粗細和長短等，也與熱源的強度有關。

（4）氨的蒸餾和吸收及滴定

蒸餾有兩種:

1 直接蒸餾（裝置簡便，准確性好）

2 水蒸汽蒸餾

蒸餾加NaOH是50%，加的量為H2SO4量的4倍，硫酸量為12ml，則NaOH為12×4=48ml，而且一般高於這個理論值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強酸，使顏色變紅。

吸收液有：

1標准H2SO4 用標准鹼返滴定，甲醛紅指示劑

2 硼酸 用HCl進行滴定，混合指示劑

目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強酸，要求較嚴，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險期間一般用4%。

〈6〉實驗注意事項

a.樣品應時均勻的，若是固體樣品應事先研細，液體樣要混合均勻。

b.樣品放入K氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結果偏低。

c.消化時，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷後，加入30%過氧化氫催化劑2~3ml，促使氧化。

d.在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在K氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

e.如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。

f.混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。

g.氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為鹼性。

h.向蒸餾瓶中加入濃鹼時，往往出現褐色沉澱無。這時由於分解促進劑與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱後又分解生成氧化銅的沉澱，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡合物。

i.消化劑綠色後繼續消化30分鍾即可。

2 K氏微量定氮儀法

3 K氏半微量定氮儀法 (2 、 3原理一樣)

操作方法大同小異，半微量法消化後，定容100ml，然後吸25ml蒸餾吸收液吸收。

N（V2-V1）0.014

W＊10／100

計算總氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100

對於微量定氮儀法，儀器有了改進，樣液稱樣少，蒸餾消化液也少，其它基本一樣。

4 K氏自動定氮法

原理與上面一樣，儀器，採用K氏自動定氮儀：其裝置內具有自動加鹼蒸餾裝置，自動吸收和滴定裝置以及自動數字顯示裝置，消化裝置：由優質玻璃製成的K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。

二 水揚酸比色法：

1 原理： 樣品中的pro經H2SO4消化轉化為銨鹽溶液後，在一定的酸度和溫度下與水揚酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計算蛋白質含量。

2 方法 （1）標准曲線的繪制

取6個25ml容量瓶編號 0 1 2 3 4 5 6

分別加空白酸液 2ml

分別加磷酸鹽緩沖液 5ml

稀釋至總體體積至15ml

分別加水揚酸鈉 5ml

37C水浴 15分鍾

加入次氯酸鈉 2.5ml

37C水浴 15分鍾

取出試液於660nm下進行比色，繪標准曲線。

（2）樣品處理：

准確稱樣0.20~1.00g→於K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化劑→電爐上加熱到沸騰後→加大

火力消化→直到出現暗綠色時→搖動瓶子→K氏瓶全部消化後→冷卻→加水至250ml容量

瓶。

（3）樣品測定：

准確吸取上述消化溶液10ml→於100ml容量瓶中→定容→准確吸2ml→於25ml容量瓶中→加

5ml磷酸緩沖液→以下操作與標准曲線繪制的步驟相同

並以試劑空白微對照，測得樣液的光密度，從標准曲線查出其含氮量。

（4）計算

C×F

含氮%= ---------------------------× 100

W×1000×1000

C---從標准曲線中查出測定樣液的含氮量（Ug）

F---樣品溶液的稀釋倍數

W---樣品重量（g）

pro%=總氮%×K（K可為6.25，也可查）

3注意事項：

A 當天消化液最好當天測定，結果重現性好，如果樣液改至第二天比色就有變化。

B 當在PH和試劑適當范圍內加入氯源後，顏色的顯色和溫度有關，應嚴格控制反應溫度。

C 這種方法測定結果基本與K氏法一致。

4 試劑

（1）氯標液：稱經110℃乾燥2h的硫酸銨0.4719g→於燒瓶中定容10ml→此液1ml相當於

1.0mg氮標液→使用時配製成1ml相當於2.50Ug氮標液。

（2）空白酸液：稱0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化劑→與樣品一樣消化→定容250ml→

使用時吸收此液10ml→加水至100ml為工作液備用。

（3）磷酸鹽緩沖液：稱7.1g磷酸氫二鈉→加38g磷酸三鈉→加20g三九石酸鉀鈉→加400ml水

溶解→過濾→另稱35gNaOH溶於100ml水中→冷至室溫→緩緩地攪拌加入磷酸鹽溶液中→加

入水稀釋至1000ml備用。

（4）水揚酸鈉溶液：稱25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶於200ml水中過濾，加水稀釋

至500ml

（5）次氯酸鈉溶液：吸4ml安替富民液，用水稀釋至100ml

5 儀器

（1）分光光度計

（2）恆溫水浴

三 紫外分光光度法

1 原理：

pro及其降解產物的芳香環基 ，在紫外區內對某一波長具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與pro濃度（3~8mg/ml）成直線關系，因此，通過測定pro溶液的吸光度，並參照事先用K氏定氮法分析的標准樣品，從標准曲線查出蛋白質的含量。

2 試劑：

（1） 0.1mol/l檸檬酸水溶液。

（2）8mol/l脲[（NH2）2CO]的2NNaOH溶液。 脲的2N氫氧化鈉液

（3） 95%乙醇

（4） 無水乙醚

3 儀器

（1） 751型的紫外分光光度計

（2） 離心機

4 操作方法

（1）標准曲線的繪制：准確稱取樣品.2.00g，置於50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鍾使其充分溶解，用四層紗布過濾於玻璃離心管中，以每秒鍾3000~5000轉的速度離心10分鍾，分別吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml於6個10ml容量瓶鍾，每個容量瓶，8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鍾（如果離心再次離心），取透明液於比色皿中，在280nm下測定其吸光度。（做參比值）

以事先用K氏定氮法測定的樣品中蛋白質的含量微橫坐標上面的吸光度為縱坐標，繪制標准曲線。

（2）樣品測定

准確稱取試樣1.00g→於50ml燒杯中→加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml→攪拌10分鍾→四層紗布過濾到離心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻後於280nm下測吸光度，從標准曲線上查出pro的含量。

計算： 蛋白質= C/W× 100

C----從標准曲線上查得的pro含量（mg）

W----測定樣品溶液相當於樣品量（mg）

說明：

a.此法運用於糕點，牛乳和可溶性pro樣品，測定糕點時，應把表皮顏色去掉。

b.溫度對pro水解有影響，操作溫度應控制在20~30℃。

四 雙縮脲法-皮尼克法

1 原理：

雙縮脲在鹼性條件中，能與CuSO4結合成紅紫色的絡合物。pro分子中含有肽鏈與雙縮脲結構相似，也呈此反應。本法直接用於測定像小麥粉等固體試樣的pro含量。但作為銅的穩定劑，酒石酸鉀鈉比甘油好些。小麥粉中的pro能直接地一邊抽出一邊進行定量。

2 試劑

⑴甘油作為穩定劑：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈攪拌，同時加入4%CuSO450ml。

⑵酒石酸鈉作穩定劑，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中，激烈攪拌，同時加入4%CuSO4液40ml。

配製以上兩種溶液、試劑，必須澄清，無氫氧化銅生成，否則重配。

3 方法：樣品測定

標准曲線繪制

准確稱0.6g樣品→使用試劑（1）

准確稱0.5g樣品→使用試劑（2）

假如用試劑（2）

（1）准確稱樣→0.5g→於80ml離心管→加1mlClC4→混合→加50ml酒石酸鉀鈉穩定劑→蓋上蓋子離心10min（4000轉/分）→放置1小時→吸混合液15ml→於20ml離心管中→離心到完全透明→取上清夜5ml於→10ml容量瓶→加水定容→於550nm處測定吸光度，從標准曲線上查出pro含量。

（2）標准曲線繪制

按樣品測定方法，根據樣品中pro含量，取離心澄清樣液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml於10ml容量瓶中→分別加水定容，按照樣品測定其吸光度。

事先用K氏定氮法測定樣品中pro含量為橫坐標，以上述吸光度為縱坐標繪制標准曲線。

4 計算：蛋白質%=C/W×100

C----從標准曲線上查得得pro含量（mg）

W----測定樣液時相當於樣品重量（mg）

8. GB 6432-1986 飼料粗蛋白測定方法是什麼呢

不知道，只知道現在用凱氏定氮法

一、原理

蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然後鹼化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收後再以硫酸或鹽酸標准溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質含量。

1.有機物中的胺根在強熱和CuSO4，濃H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4

反應式為：

2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04（其中CuSO4做催化劑）

2.在凱氏定氮器中與鹼作用，通過蒸餾釋放出NH3，收集於H3BO3溶液中

反應式為:

(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4

2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O

3.用已知濃度的H2SO4（或HCI）標准溶液滴定，根據HCI消耗的量計算出氮的含量，然後乘以相應的換算因子，既得蛋白質的含量

反應式為：

(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3

二、試劑

所有試劑均用不含氨的蒸餾水配製。

2.1硫酸銅。

2.2硫酸鉀。

2.3硫酸。

2.42%硼酸溶液。

2.5混合指示液：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶液與1份0.1%次甲基藍乙醇溶液臨用時混合。

2.640%氫氧化鈉溶液。

2.70.025mol/L硫酸標准溶液或0.05mol/L鹽酸標准溶液。

三、儀器

定氮蒸餾裝置：如圖所示。

凱氏定氮法儀器1.安全管

2.導管

3.汽水分離管

4.樣品入口

5.塞子

6.冷凝管

7.吸收瓶

8.隔熱液套

9.反應管

10.蒸汽發生瓶

四、操作方法

1、樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當氮30-40mg），移入乾燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻後於瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支於有小孔的石棉網上，小火加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止後，加強火力，並保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明後，再繼續加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷後，移入100ml容量瓶中，並用少量水洗定氮瓶，洗液並入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸同一方法做試劑空白試驗。

2、按圖裝好定氮裝置，於水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。

3、向接收瓶內加入10ml2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，並使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室，並以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應室，立即將玻璃蓋塞緊，並加水於小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然後用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標准溶液定至灰色或藍紫色為終點。

同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

計算：

X=(（V1-V2）*N*0.014)/(m*（10/100）)*F*100%

X：樣品中蛋白質的百分含量，g；

V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標准液的體積，ml；

V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標准溶液的體積，ml；

N：硫酸或鹽酸標准溶液的當量濃度；

0.014：1N硫酸或鹽酸標准溶液1ml相當於氮克數；

m：樣品的質量（體積），g（ml）；

F：氮換算為蛋白質的系數。蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質，乳製品為6.38，麵粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其製品為5.71，肉與肉製品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為5.30。

五、注意事項

（1）樣品應是均勻的。固體樣品應預先研細混勻，液體樣品應振搖或攪拌均勻。

（2）樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上。萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結果偏低。

（3）硝化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷後，慢慢加入30%過氧化氫（H2O2）2-3ml，促使氧化。

（4）在整個消化過程中，不要用強火。保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

（5）如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。

（6）加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作鹼性反應的指示劑。

（7）混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

（8）氨是否完全蒸餾出來，可用PH試紙試餾出液是否為鹼性。

（9）吸收液也可以用0.01當量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N鹼液滴定，計算時，A為試劑空白消耗鹼液數，B為樣品消耗鹼液數，N為鹼液濃度，其餘均相同。

（10）以硼酸為氨的吸收液，可省去標定鹼液的操作，且硼酸的體積要求並不嚴格，亦可免去用移液管，操作比較簡便。

（11）向蒸餾瓶中加入濃鹼時，往往出現褐色沉澱物，這是由於分解促進鹼與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱後又分解生成氧化銅的沉澱。有時銅離子與氨作用，生成深l藍色的結合物[Cu(NH3)4]2+

（12）這種測算方法本質是測出氮的含量，再作蛋白質含量的估算。只有在被測物的組成是蛋白質時才能用此方法來估算蛋白質含量。

9. 有機化學實驗，怎麼檢查水蒸氣蒸餾裝置不漏氣呢

1、進行水蒸氣蒸餾時，水蒸氣導入管的末端為什麼要插入到接近於容器的底部？
答：使專瓶屬內液體充分加熱和攪拌，有利於更有效的進行水蒸氣蒸餾
2、在水蒸氣蒸餾過程中，經常要檢查什麼事項？若安全管中水位上升很高時，說明什麼問題？如何處理才能解決？
答：：（1）經常要檢查安全管中的水位是否正常，有無倒吸現象，蒸餾部分混合物濺飛是否厲害。

（2）說明有某一部分阻塞。

（3）應立即旋開螺旋夾，移去熱源，拆下裝置進行檢查（一般多數是水蒸氣導入管下管被樹脂狀物質或者焦油狀物所堵塞）和處理。

10. 在蒸餾實驗中，如何檢查裝置的氣密性

1、升高溫度法；對於一些製取氣體量較小的裝置，可採用手握法，把導管回的一端浸在水裡，答兩手緊貼容器(試管)的外壁，如果裝置不漏氣，

裡面的空氣受熱膨脹，導管口有氣泡放出，手移開後，導氣管內水柱上升，且較長時間不回落，說明裝置氣密性良好。

2、液面差法：用止氣夾夾住橡膠導管部分，向長頸漏斗中加水，使之下端浸在水中，繼續加水形成一段水柱，產生高度差，在一段時間內水柱不發生回落，說明氣密性良好。

氣密性檢驗的原則是，先讓裝置和附加的液體(一般指水)，構成封閉的整體，改變這個整體的溫度，導致壓強的變化，來判斷氣密性好壞，由於裝置的不同，檢驗的方法也有所不同。

(10)粗蛋白蒸餾裝置漏氣驗證方法擴展閱讀：

在升高溫度法中，如果環境的溫度與人體的溫度接近，用手握的方法，現象就不夠明顯，也就是說手的溫度與環境的溫度差不多時，手握改變不了這個整體的溫度及壓強。就應該採用微熱法。

微熱法具體操作為：用酒精燈在容器(可以用酒精燈直接或間接加熱的容器)底部微微加熱，或把容器浸在熱水中，如果水中有氣泡放出，停止加熱後，導管內有一段水柱，且在一段時間內不回落，說明裝置氣密性良好。