离子交换层析脂肪酶洗脱曲线

Ⅰ 用洗脱曲线说明ASP和lys的出峰次数并解释

应该是出峰顺序吧，先是Asp再Lys。阳离子交换树脂，Asp在pH5.3中带负电被排斥先洗出，Lys带正电与树脂交换。

Ⅱ 既有分子排阻作用，又有离子交换功能的填料

色谱分析法基本原理
色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。

Ⅲ 大学生化重点

第一章 氨基酸和蛋白质
一、组成蛋白质的20种氨基酸的分类
1、非极性氨基酸
包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸
2、极性氨基酸
极性中性氨基酸：色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸
酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸
碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸
其中：属于芳香族氨基酸的是：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸
属于亚氨基酸的是：脯氨酸
含硫氨基酸包括：半胱氨酸、蛋氨酸
注意：在识记时可以只记第一个字，如碱性氨基酸包括：赖精组
二、氨基酸的理化性质
1、两性解离及等电点
氨基酸分子中有游离的氨基和游离的羧基，能与酸或碱类物质结合成盐，故它是一种两性电解质。
在某一PH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的PH称为该氨基酸的等电点。
2、氨基酸的紫外吸收性质
芳香族氨基酸在280nm波长附近有最大的紫外吸收峰，由于大多数蛋白质含有这些氨基酸残基，氨基酸残基数与蛋白质含量成正比，故通过对280nm波长的紫外吸光度的测量可对蛋白质溶液进行定量分析。
3、茚三酮反应
氨基酸的氨基与茚三酮水合物反应可生成蓝紫色化合物，此化合物最大吸收峰在570nm波长处。由于此吸收峰值的大小与氨基酸释放出的氨量成正比
三、肽
两分子氨基酸可借一分子所含的氨基与另一分子所带的羧基脱去1分子水缩合成最简单的二肽。二肽中游离的氨基和羧基继续借脱水作用缩合连成多肽。10个以内氨基酸连接而成多肽称为寡肽；39个氨基酸残基组成的促肾上腺皮质激素称为多肽；51个氨基酸残基组成的胰岛素归为蛋白质。
多肽连中的自由氨基末端称为N端，自由羧基末端称为C端，命名从N端指向C端。
人体内存在许多具有生物活性的肽，重要的有：
谷胱甘肽（GSH）：是由谷、半胱和甘氨酸组成的三肽。半胱氨酸的巯基是该化合物的主要功能基团。GSH的巯基具有还原性，可作为体内重要的还原剂保护体内蛋白质或酶分子中巯基免被氧化，使蛋白质或酶处于活性状态。
四、蛋白质的分子结构
1、蛋白质的一级结构：即蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。
主要化学键：肽键，有些蛋白质还包含二硫键。
2、蛋白质的高级结构：包括二级、三级、四级结构。
1）蛋白质的二级结构：指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。二级结构以一级结构为基础，多为短距离效应。可分为：
α-螺旋：多肽链主链围绕中心轴呈有规律地螺旋式上升，顺时钟走向，即右手螺旋，每隔3.6个氨基酸残基上升一圈，螺距为0.540nm。α-螺旋的每个肽键的N-H和第四个肽键的羧基氧形成氢键，氢键的方向与螺旋长轴基本平形。
β-折叠：多肽链充分伸展，各肽键平面折叠成锯齿状结构，侧链R基团交错位于锯齿状结构上下方；它们之间靠链间肽键羧基上的氧和亚氨基上的氢形成氢键维系构象稳定．
β-转角：常发生于肽链进行180度回折时的转角上，常有4个氨基酸残基组成，第二个残基常为脯氨酸。
无规卷曲：无确定规律性的那段肽链。
主要化学键：氢键。
2）蛋白质的三级结构：指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，显示为长距离效应。
主要化学键：疏水键（最主要）、盐键、二硫键、氢键、范德华力。
3）蛋白质的四级结构：对蛋白质分子的二、三级结构而言，只涉及一条多肽链卷曲而成的蛋白质。【在体内有许多蛋白质分子含有二条或多条肽链，每一条多肽链都有其完整的三级结构，称为蛋白质的亚基】，亚基与亚基之间呈特定的三维空间排布，并以非共价键相连接。这种蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，为四级结构。由一条肽链形成的蛋白质没有四级结构。
主要化学键：疏水键、氢键、离子键
五、蛋白质结构与功能关系
1、蛋白质一级结构是空间构象和特定生物学功能的基础。一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间构象以及功能也相似。
尿素或盐酸胍可破坏次级键
β-巯基乙醇可破坏二硫键
2、蛋白质空间结构是蛋白质特有性质和功能的结构基础。
肌红蛋白：只有三级结构的单链蛋白质，易与氧气结合，氧解离曲线呈直角双曲线。
血红蛋白：具有4个亚基组成的四级结构，可结合4分子氧。成人由两条α-肽链（141个氨基酸残基）和两条β-肽链（146个氨基酸残基）组成。在氧分压较低时，与氧气结合较难，氧解离曲线呈S状曲线。因为：第一个亚基与氧气结合以后，促进第二及第三个亚基与氧气的结合，当前三个亚基与氧气结合后，又大大促进第四个亚基与氧气结合，称正协同效应。结合氧后由紧张态变为松弛态。
六、蛋白质的理化性质
1、蛋白质的两性电离：蛋白质两端的氨基和羧基及侧链中的某些基团，在一定的溶液PH条件下可解离成带负电荷或正电荷的基团。
2、蛋白质的沉淀：在适当条件下，蛋白质从溶液中析出的现象。包括：
a.丙酮沉淀，破坏水化层。也可用乙醇。
b.盐析，将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，破坏在水溶液中的稳定因素电荷而沉淀。
3、蛋白质变性：在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。主要为二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构的改变。变性后，其溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。常见的导致变性的因素有：加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂、超声波、紫外线、震荡等。
4、蛋白质的紫外吸收：由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm处有特征性吸收峰，可用蛋白质定量测定。
5、蛋白质的呈色反应
a.茚三酮反应：经水解后产生的氨基酸可发生此反应，详见二、3
b. 双缩脲反应：蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸酮共热，呈现紫色或红色。氨基酸不出现此反应。蛋白质水解加强，氨基酸浓度升高，双缩脲呈色深度下降，可检测蛋白质水解程度。
七、蛋白质的分离和纯化
1、沉淀，见六、2
2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
4、层析：
a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
第二章 核酸的结构与功能
一、核酸的分子组成：基本组成单位是核苷酸，而核苷酸则由碱基、戊糖和磷酸三种成分连接而成。
两类核酸：脱氧核糖核酸（DNA），存在于细胞核和线粒体内。
核糖核酸（RNA），存在于细胞质和细胞核内。
1、碱基：
胞嘧啶 胸腺嘧啶 尿嘧啶 鸟嘌呤 腺嘌呤
嘌呤和嘧啶环中均含有共轭双键，因此对波长260nm左右的紫外光有较强吸收，这一重要的理化性质被用于对核酸、核苷酸、核苷及碱基进行定性定量分析。
2、戊糖：DNA分子的核苷酸的 糖是β-D-2-脱氧核糖，RNA中为β-D-核糖。
3、磷酸：生物体内多数核苷酸的磷酸基团位于核糖的第五位碳原子上。
二、核酸的一级结构
核苷酸在多肽链上的排列顺序为核酸的一级结构，核苷酸之间通过3′，5′磷酸二酯键连接。
三、DNA的空间结构与功能
1、DNA的二级结构
DNA双螺旋结构是核酸的二级结构。双螺旋的骨架由 糖和磷酸基构成，两股链之间的碱基互补配对，是遗传信息传递者，DNA半保留复制的基础，结构要点：
a.DNA是一反向平行的互补双链结构 亲水的脱氧核糖基和磷酸基骨架位于双链的外侧，而碱基位于内侧，碱基之间以氢键相结合，其中，腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对，形成两个氢键，鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对，形成三个氢键。
b.DNA是右手螺旋结构 螺旋直径为2nm。每旋转一周包含了10个碱基，每个碱基的旋转角度为36度。螺距为3.4nm，每个碱基平面之间的距离为0.34nm。
c.DNA双螺旋结构稳定的维系 横向靠互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持，尤以后者为重要。
2、DNA的三级结构
三级结构是在双螺旋基础上进一步扭曲形成超螺旋，使体积压缩。在真核生物细胞核内，DNA三级结构与一组组蛋白共同组成核小体。在核小体的基础上，DNA链经反复折叠形成染色体。
3、功能
DNA的基本功能就是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，它是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础。
DNA中的核糖和磷酸构成的分子骨架是没有差别的，不同区段的DNA分子只是碱基的排列顺序不同。
四、RNA的空间结构与功能
DNA是遗传信息的载体，而遗传作用是由蛋白质功能来体现的，在两者之间RNA起着中介作用。其种类繁多，分子较小，一般以单链存在，可有局部二级结构，各类RNA在遗传信息表达为氨基酸序列过程中发挥不同作用。如：
【核蛋白体(rRNA) 核蛋白体组成成分】
【信使(mRNA) 蛋白质合成模板 】
【转运(tRNA) 转运氨基酸 】
【不均一核RNA (HnRNA)成熟mRNA的前体】
【小核RNA (SnRNA)参与HnRNA的剪接、转运】
【小核仁RNA (SnoRNA) rRNA的加工和修饰 】
1、信使RNA（半衰期最短）
1）hnRNA为mRNA的初级产物，经过剪接切除内含子，拼接外显子，成为成熟的mRNA并移位到细胞质
2）大多数的真核mRNA在转录后5′末端加上一个7-甲基鸟嘌呤及三磷酸鸟苷帽子，帽子结构在mRNA作为模板翻译成蛋白质的过程中具有促进核蛋白体与mRNA的结合，加速翻译起始速度的作用，同时可以增强mRNA的稳定性。3′末端多了一个多聚腺苷酸尾巴，可能与mRNA从核内向胞质的转位及mRNA的稳定性有关。
3）功能是把核内DNA的碱基顺序，按照碱基互补的原则，抄录并转送至胞质，以决定蛋白质合成的氨基酸排列顺序。mRNA分子上每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸，为三联体密码。
2、转运RNA（分子量最小）
1）tRNA分子中含有10％～20％稀有碱基，包括双氢尿嘧啶，假尿嘧啶和甲基化的嘌呤等。
2）二级结构为三叶草形，位于左右两侧的环状结构分别称为DHU环和Tψ环，位于下方的环叫作反密码环。反密码环中间的3个碱基为反密码子，与mRNA上相应的三联体密码子形成碱基互补。所有tRNA3′末端均有相同的CCA-OH结构。
3）三级结构为倒L型。
4）功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的戴本并将其转呈给mRNA。
3、核蛋白体RNA（含量最多）
1）原核生物的rRNA的小亚基为16S，大亚基为5S、23S；真核生物的rRNA的小亚基为18S，大亚基为5S、5.8S、28S。真核生物的18SrRNA的二级结构呈花状。
2）rRNA与核糖体蛋白共同构成核糖体，它是蛋白质合成机器－－核蛋白体的组成成分，参与蛋白质的合成。
4、核酶：某些RNA 分子本身具有自我催化能，可以完成rRNA的剪接。这种具有催化作用的RNA称为核酶。

五、核酸的理化性质
1、DNA的变性
在某些理化因素作用下，如加热，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为变性。监测是否发生变性的一个最常用的指标是DNA在紫外区260nm波长处的吸光值变化。解链过程中，吸光值增加，并与解链程度有一定的比例关系，称为DNA的增色效应。紫外光吸收值达到最大值的50％时的温度称为DNA的解链温度（Tm），一种DNA分子的Tm值大小与其所含碱基中的G＋C比例相关，G＋C比例越高，Tm值越高。
2、DNA的复性和杂交
变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性，其过程为退火，产生减色效应。不同来源的核酸变性后，合并一起复性，只要这些核苷酸序列可以形成碱基互补配对，就会形成杂化双链，这一过程为杂交。杂交可发生于DNA－DNA之间，RNA－RNA之间以及RNA－DNA之间。

六、核酸酶（注意与核酶区别）
指所有可以水解核酸的酶，在细胞内催化核酸的降解。可分为DNA酶和RNA酶；外切酶和内切酶；其中一部分具有严格的序列依赖性，称为限制性内切酶

Ⅳ 给出一种酶，如何设计其纯化方案

发个实验给你参考参考！！！

酵母蔗糖酶的分离纯化和活力测定

实验简介：酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究种具有重要意义。啤酒酵母中蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母作为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶。并对其活力进行测定。

实验原理
蔗糖酶主要存在于酵母中，但工业上通常从酵母中制取。酵母蔗糖酶系胞内酶，提取时细胞破碎或菌体自溶。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析。以此可得到较高纯度的酶。
蔗糖酶催化下蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，本实验中，蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应5min,每产生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。

实验操作
1. 提取
(1) 准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
(2) 将10g湿啤酒酵母，和适量（5g）二氧化硅一起放入研钵中。二氧化硅要预先研细。
(3) 缓慢加入预冷的30mL去离子水，每次加2mL左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相，至酵母细胞大部分研碎，以便将蔗糖酶充分转入水相中。
(4) （可选项） 研磨时用显微镜检查研磨的效果。
(5) 将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机，4℃，10000rpm，离心5min。
(6) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心15min。
(7) 将清液转入量筒，量出体积，用广泛pH试纸检查上清液pH，用1mol / L 醋酸将pH调至5.0，称为“粗级分Ⅰ”。留出1.5mL测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁的离心管中。
2. 热处理和乙醇沉淀
(1) 预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，45℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
(2) 取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。
(3) 将上清液转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。于4℃，10000rpm，离心10min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ”）。废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性（于下一个实验一起做）。
3. DEAE纤维素柱层析纯化酶蛋白
(1) 离子交换剂的处理
称取1.5克DEAE纤维素(DE-32)干粉，加入0.5mol／L NaOH溶液(约50m1)，轻轻搅拌，浸泡至少0.5小时(不超过1小时)，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50mL 0.5mol／L HCl，搅匀，浸泡0.5小时，用去离子水洗至。近中性，再用0.5 mol／L NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用(因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收)。实际操作时，通常纤维素是已浸泡过并回收的，按“碱一酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5 mol／L NaOH-0.5 mol／L NaCl溶液处理，然后水洗至中性。
(2) 装柱与平衡
先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol／L，pH7.3 Tris-HCl缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的pH与缓冲液相同或接近时即可上样。
(3) 上样与洗脱
上样前先准备好梯度混合器，详见附录TH-500梯度混合器使用说明。
用5mL 0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分Ⅱ(注意玻璃搅棒头必须烧圆，搅拌溶解时不可将离心管划伤)，若溶液混浊，则4 000r／min离心除去不溶物。取1.5mL上清液(即醇级分Ⅱ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量)，将剩余的3.5mL上清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，上样后用约30mL缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，注意从上样开始使用部分收集器收集，每管2.5～3.0mL／l0min。然后打开梯度混合器，采用30mL，0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl缓冲液和30mL含0.2mol／L浓度NaCl的0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl.缓冲液，进行线性梯度洗脱，连续收集洗脱液，控制流速2.5～3.0mL／10min。测定每管洗脱液的A280光吸收值。
(4) 各管洗脱液酶活力的定性测定
在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol／L，pH4.6的乙酸缓冲液，一滴0.5mol／L蔗糖和一滴洗脱液，反应5min，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min后观察试纸颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性最高的2～3管，量出总体积，并将其分成10份，分别倒人10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存，使用时取出一管，此即“柱级分Ⅲ”。
4. 各级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力
用0.02mol／L，pH4.6乙酸缓冲液(也可以用pH5～6的去离子水代替)稀释各级分酶液，测出酶活合适的稀释倍数：
Ⅰ： 1 000～10 000倍；
Ⅱ： 1 000～10 000倍；
Ⅲ： 100～1 000倍；
以上稀释倍数仅供参考。
按“表1”的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，为简化操作可取消保鲜膜封口，沸水浴加热改为用90～95℃水浴加热 8-10min，以5min生成的还原糖的毫克数为纵坐标，以试管中lmL反应混合物中的酶浓度(mg蛋白／m1)为横坐标，画出反应速度与酶浓度的关系曲线。

表1 各级分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性测定
各管名称 对照 级分Ⅰ 级分Ⅱ 级分Ⅲ 葡萄糖
管数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
酶液/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
乙酸缓冲液0.2mol/L,pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
蔗糖0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
加入蔗糖，立即摇匀开始记时，室温准确反应5min后，立即加1mL 0.1M NaOH中止反应
二硝基水杨酸溶液 mL 1.0
用保鲜膜封口，扎眼，沸水浴加热5min，立即用水冷却3分钟。
H2O/mL 4.0
A520
稀释后酶活力 /
原始酶活力 /
5. 考马斯亮兰法测定各级分蛋白质含量
(1) 蛋白质标准曲线制作
取14支试管，分两组按下表平行操作。
表2 蛋白质标准曲线制作
试管编号/mL 0 1 2 3 4 5 6
标准蛋白溶液/mL
0.02mol/L Tris-HCl缓冲液/mL
考马斯亮兰试剂/mL
摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色
A595nm
(2) 各级分蛋白质含量测定
考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，在10~100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比。因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
6. 计算各级分的比活力、纯化倍数及回收率
为了测定和计算下面表3中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。
1活力单位(U)＝酶在室温，pH＝4.6条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力＝活力单位/mg蛋白。
表3 各级分的比活力、纯化倍数及回收率

级
分 记录
体积
(m1) 校正
体积
(m1) 蛋白质
(mg／m1) 总蛋白
(mg) Unit
(s／m1) 总活力
(U) 比活力
(Units
／mg) 纯化
倍数 回收率
(％)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ

下面表4是对假定的各级分记录体积进行校正计算的方法和结果：
表4 实验记录表
级分 记录体积 (m1) 校正体积计算 取样体积
(m1) 校正后体积
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
五、 结果
在同一张图上画出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。得出各级分的活力，比活力，提纯倍数以及回收率。
六、 注意事项
从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。
七、 作业
1．为什么酶的提取需要低温操作？
2．热处理的根据是什么？
去除热敏感蛋白。
参考文献
1．邵雪玲，毛歆，郭一清．生物化学与分子生物学实验指导．武汉：武汉大学出版社，2003
2．张龙翔．高级生物化学实验选编．北京：高等教育出版社，1989
3．许培雅，邱乐泉．离子交换柱层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究．实验室研究与探索，2002，21(3):82~84
编著者——陈彦，李绍飞

Ⅳ 蝎毒的采集分离

蝎子在受到激怒的情况下，出于防御或攻击的本能，会从毒囊中排出毒液。蝎毒的采集就是依据这个道理。采集蝎毒的常用方法有剪尾法、机械刺激法和电刺激法三种。剪尾法：夹住蝎的后腹部第五节的两侧，剪下蝎子的尾节，破碎后浸入生理盐水（0.9%的氯化钠溶液）中，浸出有毒部分，再将尾节研磨，用离心机离心（5000转/分）5分钟，重复3次。集中有毒的液体，放入容器内，再制成干毒粉，置于-5℃下保存备用。这种方法，每条蝎子只能采毒一次，而采毒后的蝎子降低了药用功能和经济价值，对蝎子的伤害也大，通常不采用。人工刺激法：用镊子夹住蝎子的一个螯肢，提起悬于容器中片刻，多数蝎子的尾刺即会排出毒液，但也有少数蝎子不排毒液的，不排毒液的可用比如细木筷子等硬物轻碰蝎子的头胸部或前腹部，刺激蝎子的尾刺排毒。电激法：该法是用电子脉冲提毒仪器采集蝎毒的方法。此法采毒量大，工效高，一人操作，全年多次采毒而不致于损害蝎子，是使用较多也较科学的采毒方法。三种采毒方法相比，剪尾提毒法简便、快速、收毒率高，适于大批量采集蝎毒；缺点是活蝎只能供一次采毒，人工刺激法获取的毒液清澈透明，但采毒量较少，工效低，速度慢，对大规模提取蝎毒不适用。
毒素类型及氨基酸序列图册。
电激法获取的毒量较人工刺激法取得的毒量要多1倍。大约3000只成蝎可产湿毒6-7g，可冻成干毒1g，即每毫克湿毒可加工成0.14-0.16mg干毒。每只东亚钳蝎1次可产0.34mg左右的干毒。雄蝎的个体比雌蝎小，其产毒量也比雌蝎少。在电脉冲刺激下，1只雌蝎3次可产湿毒2.59mg，1只雄蝎3次产2.01mg湿毒（按隔7天后采1次毒计算）。但需严格注意卫生，确保采毒的纯度；个别蝎子在通一次电时不排毒，须再通一次电，但通电时间不得超过2秒钟，频率128赫兹，电压6-10伏。以免烧坏仪器和损伤蝎子。蝎子的排毒量随温度的变化高低而各有差异。温度低时排毒量相对较少，当温度低于20℃时，蝎子的排毒量相当少，当低于10℃时，蝎子则停止排毒。因此，常温养殖蝎子要采毒应尽量在6月份气温高于25℃以上时进行。孕蝎和种蝎不能用于采毒。怀孕早期的孕蝎可以采毒，但在临产前不能采毒。用于采毒的蝎子多为商品成蝎和老龄蝎。 蝎毒液成分主要为蛋白质和酶类，容易失去活性。常温下极易变质，必须加工成干毒粉才能保存较长时间。
蝎毒液除了马上用于分离纯化者外，应尽快进行干燥。蝎毒干燥的目的，就是尽量除去毒液中的水分，提高粗毒的稳定性，使之便于保存、分析、出售。常用的干燥方法有两种：一，若要保持蝎毒中酶的活力，应选用真空冷冻干燥；二，若仅为了保持毒性，采用真空干燥即可。
（1）真空干燥（即真空减压干燥）是在低压下，使蝎毒液中的水分快速蒸发的方法。真空干燥装置包括真空干器、冷凝管和真空泵。干燥器顶部活塞接通冷凝管，冷凝管的另一端依次连接吸滤瓶、干燥塔和真空泵。蒸汽在冷凝管中凝集后滴入吸收瓶中。干燥器中放有干燥剂（如五氧化二磷等）和蝎毒液样品。使用前，先在干燥器活塞四周涂上少许凡士林，然后检查整个装置是否漏气。使用时，先将蝎毒液和干燥剂分别装入平皿中，然后置于干燥器中，启动真空泵抽气至盖子推不动，依次关闭活塞和真空泵。蝎毒干燥后，应缓缓旋开活塞，以防止空气冲散蝎毒干粉。最后在净化条件下取出干粉，立即分装，密封保存。
（2）真空冷冻干燥先将蝎毒液在低温冰柜中预冻成固体（用不锈钢皿盛装毒液），然后在低温和高真空度上使之升华，即可得到纯白色蝎毒干粉。由于冷冻干燥是在低温和高真空度下进行的，所以毒液在冻干过程中不起泡、不沾壁、疏松、易取出、易溶于水，有利于保存。 蝎毒的分离纯化过程一般是先经过按照分子量大小分离的色谱柱，再经过离子交换柱，最后采用反向HPLC技术，获得单一的组分。程序为：先用CM-Sephadex C-50离子交换层析分离，再用Sephadex G-50过滤，也可采用CM-Sephadex C-50、Sp-Sephadex C-25离子交换柱层析和Sephadex G-50凝胶过滤三步分离程序。如采用CM-Sephadex C-50进行离子交换层析，将毒性较强的组分透析后再用重层析，再用Sephadex G-50凝胶过滤，纯化可得毒素。或采用RP-HPLC对东亚钳蝎的粗毒进行分离，并且用两种不同的HPLC系统反复分离，用0.1%三氯醋酸-水和0.1%三氯醋酸-70%乙醇-水进行梯度洗脱。或进行二级提取，即用CM-Sephadex C-50离子交换层析提取，再用凝胶过滤，经CM-Sephadex C-10除盐。
如采用Sepharose FF阳性离子交换凝胶柱，可望获得较高纯度的单一有效成分。而利用HPCE及HPLC可较好显示蝎毒中小分子多肽的组成及相对含量，其结果基本一致。当下对蝎毒分离纯化的研究就主要集中在通过选择不同柱长、流速和梯度的凝胶层析和高效液相色谱来获得具有高抗癌活性的单一成分的抗癌多肽，比如用三步色谱法在蝎毒中分离得到了抗癫痫肽并测定了其N端50个氨基酸序列，用离子交换色谱和凝胶排阻色谱从粗毒中分离出镇痛肽，用一步CM Sephadex C-50超长柱从粗毒中纯化了镇痛肽，用低压阳离子交换柱和低压排阻柱及离子交换柱从东亚钳蝎中分离和提取了抗肿瘤肽。比如东亚钳蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽（analgesic antitumoral peptide，AGAP），从东亚钳蝎蝎毒中分离纯化得到的单组分活性肽，为单一肽链的单纯碱性多肽,等电点大于10。含有碱性氨基酸，还富含疏水性氨基酸。活性肽的N末端部分氨基酸序列为：VRDGY IADDKNCAYF CGRNA YCDDE。
为获得高纯度的蛋白质，往往需要反复使用凝胶过滤层析和离子交换层析，但这种分离方法的不足之处在于样品损失率太高，且劳动量较大。利用基因工程技术制备蝎毒特异蛋白质的研究正在研制之中，但成本较高，数量有限。因此，蝎毒粗毒的分离仍是获得蝎毒特异性的蛋白质的主要来源。 蝎毒液在普通冰箱（1-4℃）中，只能作短期保存。只有冻干成结晶粉状，才能保存其生理活性。影响蝎毒干粉稳定性的主要因素是水分、空气和温度。当干粉含水量低于10%时，能抑制微生物活性；含水量低于3%时，可抑制化学活性。所以，应将蝎毒干粉分装在小瓶或小管中，并用熔封或石蜡封口，以隔绝空气，然后置于低温冰箱（一30℃）中保存。
从养殖场运送新鲜蝎毒液到收购、加工部门或检验部门，必须用广口瓶保温冰瓶（瓶中加碎冰块降温）携带。若运送蝎毒干粉至远处，也应采取降温措施，以防蝎毒蛋白质变性失活。 多数动物类中药的有效成分尚不明确或不完全明确，其提取纯化工艺研究较少，在中成药生产工艺中动物类中药基本是生药粉末直接配料，少数用水、醇提取，水醇法精制。由于动物类中药的有效成分多数是蛋白质类、多糖类等大分子物质或其水解产物，常规方法很难充分地提出、分离和纯化这些大分子物质。
传统上蝎毒以全蝎原粉入药效果更好，也是当下临床常采用的方法。但原粉剂量大、卫生学难合格，同时全蝎多是以产地加工后的产品入药。而全蝎的产地加工一般以清水煮或盐水煮居多，但这两种方法又存在很多不合理的地方，比如有效成分的损失、变性，质量难以控制，盐水煮又因为加盐量不同，使得临床剂量不准确等而使得进一步使用受到限制。 蝎毒素最主要的分类按其分子结构中是否含有二硫键，其中含有二硫键的一类，依其药理学特征，可分为Na+通道、K+通道、Cl-通道和Ca2+通道（主要存在于骨骼肌细胞浆膜上）毒素。这些离子通道是细胞膜表面的一类分子量较大的跨膜糖蛋白，在膜上形成特殊的亲水孔道，是细胞内外离子交换的途径，是神经、肌肉、腺体等许多组织细胞膜上的基本兴奋单元，能产生和传导电信号，具有重要的生理功能。
钠离子通道
根据作用方式和结合位点的不同，Na+通道毒素又可分为α型毒素和β型毒素。α-毒素以电压依赖方式作用于Na+通道上的位点3，延缓Na+通道的失活过程，使Na+通道电流衰减减慢，动作电位时间延长，α-毒素可根据其作用对像的不同分为4类：①典型的对哺乳动物高特异性的α-毒素，②作用于昆虫的昆虫型α-毒素，③中间型α-毒素，同时作用于哺乳动物和昆虫的α类似毒素，对哺乳动物和昆虫都有作用，但对哺乳动物毒性更强。
β毒素则结合在Na+通道的位点4上，影响Na+通道的激活过程，使电压依赖的Na+通道激活曲线移向较负的电位。根据β型蝎毒素对昆虫和哺乳动物钠通道的特异性及其作用于昆虫时表现的症状不同又可分为：抗哺乳动物β-毒素，抗昆虫兴奋性β-毒素，抗昆虫抑制性β-毒素和TsVII或γ型蝎毒素。抗哺乳动物β蝎毒素，表现为对哺乳动物的高毒性，并在膜片钳下表现出可调节哺乳动物脑中钠通道电流的作用；抗昆虫兴奋性毒素即使以毫克级别注射到哺乳动物体内（如小鼠脑内）也无毒性表现的；抗昆虫抑制性毒素，经注射性给药可诱发昆虫的迟缓性瘫痪，利用膜片钳技术，抗昆虫抑制性毒素使轴突胞膜动作电位向强去极化方向移动；第四类β-毒素是对于昆虫和哺乳动物的钠通道都有高活性作用，例如Lqhβ1毒素在注射给药于青蝇幼虫时有典型的抑制作用。
钾离子通道
第一类是以Charybdotoxin（CTX）为代表，分子中有三对二硫键，配对方式为C1-C4，C2-C5，C3-C6，但CTX对钾离子通道亚型的选择性不高，这反而使得它的用途相当广泛。，从1990年起，ChTx被开发为实验室商品。它可阻断含高电导Ca2+激活的K+通道（BKCa）、电压依赖性K+通道（如淋巴细胞和果蝇Shaker K+通道）、A型K+通道（卵母细胞）、小电导Ca2+激活的K+通道（Aplysia神经细胞），并且可作用于神经细胞、血液细胞和破骨细胞中的电压依赖型Kv1.3（Shaker钾离子通道的一种）钾离子通道。其特征是它们的N端为焦谷氨酸残基，有70%的氨基酸序列相似性，且在分子的第2与第14位上均分别坐落着保守的Phe和Trp残基。类似的毒素还包括CTX-Lq2、1beriotoxin（1bTX）、BmTX和PBTX等。
第二类是Noxiustoxin（NTX）为代表，最早由墨西哥Centruroides noxius蝎的毒素中分离出，包括从5种蝎毒中分离出来的8种多肽，也是最早报道的蝎钾离子通道阻断剂。主要作用于电压依赖性K+通道，延长动作电位持续时间，并且对Ca2+激活的K+通道（KCa）也有微弱的抑制作用。此类毒素有80%的氨基酸序列相似性，而与第一类蝎毒素仅有40%的相似性。NTx能够以剂量依赖的方式可逆地阻断鱿鱼轴突标本的延迟整流钾离子通道、大鼠骨骼肌标本中的BKCa和人T淋巴细胞中的电压依赖型钾离子通道。类似的毒素还有MgTX、CoTX1、CITX、TsKa和HTX等。
第三类是以Kaliotoxin（KTX）为代表，最早从北非蝎Androctonus martetanicus mauretanicus的粗毒中分离得到，包括从7种蝎毒中纯化到的9种多肽，由37-38个氨基酸残基组成。此类毒素有80%-90%的氨基酸序列相似性，而与第一、二类相比有40%-50%的相似性。可以阻断电压依赖性钾通道，包括高电导Ca2+激活的K+通道（BKCa）。类似的毒素还有Ag-itoxin 2（AgTX 2）、AeTX 3、KTX 2和KTX 3等。
第四类是以LTX1、P05、BmP05为代表的毒素，它们均由31个氨基酸残基组成，有84%的氨基酸序列相似性。它们对小鼠的毒性很强，脑室注射的半致死量低于2μg/kg鼠，可以与apamin竞争结合鼠脑突触膜上的apamin受体，能特异性地阻断不同细胞类型中的低电导、Ca2+激活、apamin敏感的钾离子通道（low-concta-nce，Ca2+-activated，apamin-sensitive K+channel，SKCa）。
第五类为TSK毒素，由巴西产蝎Tityus serru-latus毒素中分离的一种35肽，在C端含有独特的-Cys-Asp-Cys-三肽结构。特异性作用于apamin敏感的小电导Ca2+激活的K+通道（SKCa）。且RodriguesAR等学者发现TsTX-Ka可高亲和力、可逆性地阻断爪蟾卵母细胞上Kvl.3通道（Shaker K+通道的一种亚型）。
第六类是以MTX（Mauxotoxin）为代表，由北非蝎Scorpio maurus毒素中分离出，包括3种蝎毒中分离到的5个多肽，大小介于34～37个氨基酸残基之间，MTX分子中含有与其他毒素位置不同的4对二硫键，为：C1-C4，C2-C5，C3-C6和C7-C8。其他几种的配对方式为：C1-C5，C2-C6，C3-C7，C4-C8。可阻断电压依赖性K+通道，如果蝇的ShakerK+通道、Apamin或KTX敏感的K+通道。类似的毒素还有Pi1、HTX1、Pi4等。
第七类为以P01为代表，由28-29个残基组成，包括从3种蝎毒中分离到的4种多肽，是迄今发现最小分子的蝎毒素组，有76%的氨基酸序列相似性。主要作用于apamin敏感的小电导Ca2+激活K+通道（SKCa），但相对结合能力较弱。对小鼠都毒性很弱（脑室注射至mg水平仍无反应）。因此，尽管将这4个多肽由于结构类似而被归入钾离子通道毒素类，但是它们的主要的功能还有待发掘。类似的毒素还有BmP01和LPII等。
第八类是以BmP02为代表，包括从两种蝎毒中分离到的3个多肽：BmP02、BmP03和LP1，由中国产蝎Buthus martensi Karsch粗毒中分离的28肽，含有3对二硫键，氮基酸序列仅有1个残基差异。微弱作用于apamin敏感的小电导Ca2+激活的K+通道（SKCa），对小鼠没有致死毒性。进一步研究表明BmP02能够减弱兔心肌细胞的瞬时外向钾离子流，因此认为BmP02可以作为研究瞬时外向钾离子通道的工具。
第九类是以BTK-2为代表，由印度红蝎Buthus tamulus的粗毒分离所得的一种K+通道阻断剂，有32个氨基酸通过6个保守的cys交联组成，分子量为3452Da。BTK-2与其他K+通道阻断剂有40%-70%的序列相似性。
当然，这种分组并不是绝对的，各类毒素之间不论在结构上，特别是在生物活性方面都有交叉重叠现象，比如CTX除作用于BKCa外，还作用于淋巴细胞中的Kv，果蝇shaker的Kv，爪蟾卵母细胞表达的A型通道（KA）以及来源于Aplysia的SKCa等；NTX除了抑制Kv外，对钙激活钾通道（KCa）也有弱抑制作用；MTX除了抑制shaker钾通道以外，还抑制apamin和KTX与大鼠脑突触体膜的结合。
钙离子通道
这类毒素只分离到了两个：IpTxA和Maurocalcine，从蝎Pandinus imperator和Scorpio maurus palmatus的粗毒中分离得到，均由33个氨基酸残基组成，分子中有3对二硫键，同源性达82%，对小鼠的LD50为20μg/鼠，能够可逆地作用于肌肉型Ryanodine受体（RyRtype 1），使细胞处于持久的亚通透状态。
钙通道毒素富含碱性残基，可以与细胞膜上荷负电的脂肪酸分子相结合，破坏脂双层后进入膜内与胞内Ryanodine受体相作用。与RyRs结合的分子机制同双羟基嘧啶受体II-III环相同，通过与Rryanodine受体之间的作用，激活内质网中Ca2+的释放。
氯离子通道
氯通道毒素（chlorotoxin）是从Leiurus quinquestri蝎毒液中经过凝胶过滤，及HPLC分离纯化得到的一种多肽，它对神经胶质瘤特有的氯通道（gliomaspecific chloridechannel，GCC，在正常脑组织中则不含有）有特异亲和力。分子量为4070，有4个二硫键，由36个氨基酸残基组成。类似的毒素还包括BeI1、BeI5、AmmP2等。氯毒素可抑制原发性脑胶质瘤的侵袭、转移。 按作用对象可分为哺乳动物毒素（MTx，在粗蝎毒中含量高达10%-50%），脊椎动物毒素，昆虫毒素，即抗昆虫蝎毒素（ITx，在粗蝎毒中含量低于1%），甲壳动物神经毒素（CTx）。其划分的依据是根据把一定剂量的蝎毒多肽注射进不同的实验动物小鼠、麻蝇或家蝇、等足类甲壳动物，或将药在不同的离体动物或离体标本所表现的中毒反应，相应地进行分类。其中哺乳动物毒素根据药理和电生理效应又可分为 α 和 β 两型，α 型毒素通过抑制细胞膜上钠离子通道失活而使钠电流衰减，动作电位时程显著延长，而 β 型毒素主要影响钠通道的激活，使电压依赖性的钠激活曲线移向较负的膜电位，即去极化引起的兴奋效应。不过现有研究表明，对MTx和CTx的定义并不严格分明，MTx和CTx对3种动物均有不同程度的毒性，只不过对哺乳动物和甲壳动物的麻痹作用更敏感而已，而ITx的定义相对较为合理些。
1971年，Zlotkin等率先从非洲蝎Androctons australis纯化出抗昆虫蝎毒素Aa IT，并建立了抗昆虫蝎毒素的鉴定方法，该方法采用麻蝇Sarcophaga foalconta幼虫为鉴定材料，后来陆续也有采用家蝇、蟑螂、蝗虫等昆虫。依据作用效应可将其分为具有快速收缩型麻痹效应的CP型（excitory-constractive paralysis）和引起昆虫肌肉缓慢松弛直到完全麻痹的FP型（flaccid-depressant paralysis）。
如以受体位点及电生理作用为分类依据，ITx可进而分为4类：兴奋（exceitory）型、抑制（depressant）型、α›型和β型。当然，在抗昆虫蝎毒素中，对哺乳动物（或甲壳动物）和昆虫都有毒性的毒素也有存在，不过其中有些毒素对昆虫的毒性远大于对哺乳动物的毒性。

Ⅵ 蛋白质洗脱曲线的分析

从曲线中可以看出，几个蛋白质的峰值出现在11管、30管、37管、41管、76管，其版中76管的峰值最权大，而这几个峰值对应的NaCl的浓度在0.6-0.8之间，76管对应的是0.8.所谓出峰，就是蛋白含量相对较高。这个曲线告诉你，在NaCl的浓度在0.6-0.8时，蛋白质的含量较高，你可在对应的试管数收取你的目的蛋白，然后在通道蛋白电泳等手段检测你的目的蛋白。
我以前做过蛋白的纯化，但是对于洗脱曲线的分析不是很在行，但我想原理是差不多的，希望可以帮助到你。

Ⅶ 电泳法分离混合蛋白质的基本原理是什么

是根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法。
1、电泳：在外电场的作用下，带点颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析分离和制备。 区带电泳是由于在支持物上电泳蛋白质混合物被分离为若干区带。
电泳前用缓冲液浸润薄膜或滤纸等支持物或用缓冲液直接配置成凝胶，将待分离的蛋白质样品加在它的一端或中央，支持物的两端与电极连接，通电电泳。电泳完毕，各个组分分布在不同的区域，用显色剂（蛋白质可用考马斯亮蓝或氨基黑等染色）显色后可以显示出各个组分。
氨基酸混合物特别是寡聚核苷酸混合物一次电泳往往不能完全分开。这种情况可以将第一次电泳分开的斑点通过支持介质间的接触印迹转移到第二个支持介质上，旋转90°，进行第二次电泳。这种方法称为双向电泳。
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的两部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分为分离胶），这两部分凝胶的浓度、缓冲液组分和离子强度、pH以及电场强度都是不同的，即不连续性。电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离。 电泳有三种物理效应：1、样品的浓度效应；2、凝胶对被分离分子的筛选效应；3、一般电泳分离的电荷效应。
3、毛细管电泳：高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳、毛细管电泳，可分离氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段和核酸以及多种小分子，也可用于手性化合物的分离。
毛细管减少了由于热效应产生的许多问题，可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。
电泳迁移引起溶液中荷电分子向相反电荷的电极移动，虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电渗作用使溶液向负极流动，而且电渗电流很强，其速度一般比样品的电泳速率答，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极。对荷正电分子来说，电泳迁移和电渗流效果是一致的，而且移动最快，最先达到负极。随着被分离的分子接近负极，它们都将通过紫外检测器并把信号传递给记录仪。所得结果是被分离组分的紫外吸收对时间的峰谱。
4、等点聚焦（IEF）分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的梯度处，并形成一个很窄的区带。
pH梯度制作一般利用两性电解质，它是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的解离常数和等电点。在外电场作用下，自然形成pH梯度。
5、层析聚焦：根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
原理：当用特种缓冲液滴洗填充在柱中的特种多缓冲交换剂时，就会在层析柱中自上而下自动的建立起连续的pH梯度；同时加在柱上端的蛋白质样品也随多缓冲液的展开按各自的等电点聚焦在相应的pH区段。并在展开过程中随pH梯度下移，蛋白质混合物的各组分先后从柱中流出，达到分离纯化的目的。

Ⅷ 分离蛋白质，目标蛋白分子量64KDa,两种杂蛋白的分子量分别为69KDa和74KDa

用离子交换层析吧 效果应该好
如果想简单一点 就用聚丙烯酰胺凝胶层析吧 填上30厘米高
找的型号要和分子量匹配 50－100KD间的
用紫外检测洗脱曲线 最后面出来的就是最小的蛋白

Ⅸ 为什么用巯基乙醇打开蛋白中的二硫键而不是过甲酸

过甲酸是要使蛋白质变性的吧，俺认为，但是巯基乙醇只是反应二硫键而已

Ⅹ 酶的提取:固液比1:5,20℃提取30分钟,共提取三次如何操作

发个实验给你参考参考！！！

酵母蔗糖酶的分离纯化和活力测定

实验简介：酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究种具有重要意义。啤酒酵母中蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母作为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶。并对其活力进行测定。

实验原理
蔗糖酶主要存在于酵母中，但工业上通常从酵母中制取。酵母蔗糖酶系胞内酶，提取时细胞破碎或菌体自溶。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析。以此可得到较高纯度的酶。
蔗糖酶催化下蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，本实验中，蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应5min,每产生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。

实验操作
1. 提取
(1) 准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
(2) 将10g湿啤酒酵母，和适量（5g）二氧化硅一起放入研钵中。二氧化硅要预先研细。
(3) 缓慢加入预冷的30mL去离子水，每次加2mL左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相，至酵母细胞大部分研碎，以便将蔗糖酶充分转入水相中。
(4) （可选项） 研磨时用显微镜检查研磨的效果。
(5) 将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机，4℃，10000rpm，离心5min。
(6) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心15min。
(7) 将清液转入量筒，量出体积，用广泛pH试纸检查上清液pH，用1mol / L 醋酸将pH调至5.0，称为“粗级分Ⅰ”。留出1.5mL测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁的离心管中。
2. 热处理和乙醇沉淀
(1) 预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，45℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
(2) 取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。
(3) 将上清液转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。于4℃，10000rpm，离心10min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ”）。废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性（于下一个实验一起做）。
3. DEAE纤维素柱层析纯化酶蛋白
(1) 离子交换剂的处理
称取1.5克DEAE纤维素(DE-32)干粉，加入0.5mol／L NaOH溶液(约50m1)，轻轻搅拌，浸泡至少0.5小时(不超过1小时)，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50mL 0.5mol／L HCl，搅匀，浸泡0.5小时，用去离子水洗至。近中性，再用0.5 mol／L NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用(因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收)。实际操作时，通常纤维素是已浸泡过并回收的，按“碱一酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5 mol／L NaOH-0.5 mol／L NaCl溶液处理，然后水洗至中性。
(2) 装柱与平衡
先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol／L，pH7.3 Tris-HCl缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的pH与缓冲液相同或接近时即可上样。
(3) 上样与洗脱
上样前先准备好梯度混合器，详见附录TH-500梯度混合器使用说明。
用5mL 0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分Ⅱ(注意玻璃搅棒头必须烧圆，搅拌溶解时不可将离心管划伤)，若溶液混浊，则4 000r／min离心除去不溶物。取1.5mL上清液(即醇级分Ⅱ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量)，将剩余的3.5mL上清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，上样后用约30mL缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，注意从上样开始使用部分收集器收集，每管2.5～3.0mL／l0min。然后打开梯度混合器，采用30mL，0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl缓冲液和30mL含0.2mol／L浓度NaCl的0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl.缓冲液，进行线性梯度洗脱，连续收集洗脱液，控制流速2.5～3.0mL／10min。测定每管洗脱液的A280光吸收值。
(4) 各管洗脱液酶活力的定性测定
在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol／L，pH4.6的乙酸缓冲液，一滴0.5mol／L蔗糖和一滴洗脱液，反应5min，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min后观察试纸颜色的变化。用“ ”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性最高的2～3管，量出总体积，并将其分成10份，分别倒人10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存，使用时取出一管，此即“柱级分Ⅲ”。
4. 各级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力
用0.02mol／L，pH4.6乙酸缓冲液(也可以用pH5～6的去离子水代替)稀释各级分酶液，测出酶活合适的稀释倍数：
Ⅰ： 1 000～10 000倍；
Ⅱ： 1 000～10 000倍；
Ⅲ： 100～1 000倍；
以上稀释倍数仅供参考。
按“表1”的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，为简化操作可取消保鲜膜封口，沸水浴加热改为用90～95℃水浴加热 8-10min，以5min生成的还原糖的毫克数为纵坐标，以试管中lmL反应混合物中的酶浓度(mg蛋白／m1)为横坐标，画出反应速度与酶浓度的关系曲线。

表1 各级分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性测定
各管名称 对照 级分Ⅰ 级分Ⅱ 级分Ⅲ 葡萄糖
管数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
酶液/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
乙酸缓冲液0.2mol/L,pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
蔗糖0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
加入蔗糖，立即摇匀开始记时，室温准确反应5min后，立即加1mL 0.1M NaOH中止反应
二硝基水杨酸溶液 mL 1.0
用保鲜膜封口，扎眼，沸水浴加热5min，立即用水冷却3分钟。
H2O/mL 4.0
A520
稀释后酶活力 /
原始酶活力 /
5. 考马斯亮兰法测定各级分蛋白质含量
(1) 蛋白质标准曲线制作
取14支试管，分两组按下表平行操作。
表2 蛋白质标准曲线制作
试管编号/mL 0 1 2 3 4 5 6
标准蛋白溶液/mL
0.02mol/L Tris-HCl缓冲液/mL
考马斯亮兰试剂/mL
摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色
A595nm
(2) 各级分蛋白质含量测定
考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，在10~100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比。因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
6. 计算各级分的比活力、纯化倍数及回收率
为了测定和计算下面表3中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。
1活力单位(U)＝酶在室温，pH＝4.6条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力＝活力单位/mg蛋白。
表3 各级分的比活力、纯化倍数及回收率

级
分 记录
体积
(m1) 校正
体积
(m1) 蛋白质
(mg／m1) 总蛋白
(mg) Unit
(s／m1) 总活力
(U) 比活力
(Units
／mg) 纯化
倍数 回收率
(％)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ

下面表4是对假定的各级分记录体积进行校正计算的方法和结果：
表4 实验记录表
级分 记录体积 (m1) 校正体积计算 取样体积
(m1) 校正后体积
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
五、 结果
在同一张图上画出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。得出各级分的活力，比活力，提纯倍数以及回收率。
六、 注意事项
从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。
七、 作业
1．为什么酶的提取需要低温操作？
2．热处理的根据是什么？
去除热敏感蛋白。
参考文献
1．邵雪玲，毛歆，郭一清．生物化学与分子生物学实验指导．武汉：武汉大学出版社，2003
2．张龙翔．高级生物化学实验选编．北京：高等教育出版社，1989
3．许培雅，邱乐泉．离子交换柱层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究．实验室研究与探索，2002，21(3):82~84
编著者——陈彦，李绍飞